Tinh sạch protein - Phần 4

Tinh sạch protein
(tt)



V. Phân tách protein bằng điện
di trên gel
Để đánh giá quá trình tinh sạch
protein có hiệu quả hay không, ngoài
cách xác định hoạt tính đặc trưng của
protein có tăng lên sau mỗi bước tinh
sạch, còn một cách là làm hiện hình
các protein hiện diện trong mẫu sau
mỗi bước; điều này được thực hiện
nhờ kỹ thuật điện di.
V.1Điện di một chiều
Một phân tử có mang điện tích sẽ di
chuyển trong điện trường. Hiện tượng
này, được đặt tên là điện di, giúp
hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để
phân tách protein và các đại phân tử
khác như DNA và RNA. Vận tốc di
chuyển (v) của một protein (hay bất
kỳ phân tử nào) trong điện trường phụ
thuộc vào lực điện trường (E), điện
tích thực của protein (z) và hệ số ma
sát (f)

Lực điện Ez kéo phân tử mang điện
tích tới điện cực trái dấu bị cản trở bởi

lực kéo của độ nhớt fv tăng lên do sự
ma sát giữa phân tử đang chuyển
động với môi trường. Lực ma sát phụ
thuộc vào cả khối lượng, hình dạng
của phân tử đang di chuyển lẫn độ
nhớt (η) của môi trường. Với một
khối cầu có bán kính là r, ta có
Điện di luôn được thực hiện trên gel
(hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì
gel giống như một cái ray phân tử sẽ
làm tăng sự phân tách. Những phân tử
nhỏ hơn kích thước lỗ gel sẽ có thể di
chuyển xuyên qua gel, trong khi đó
những phân tử lớn hơn lỗ gel thì gần
như không di chuyển. Những phân tử
có kích thước trung bình di chuyển
trong gel với nhiều vận tốc khác nhau.
điện di được thực hiện trên một bảng
polyacrylamide mỏng, thẳng đứng.
Hướng của dòng điện từ trên xuống.
Gel polyacrylamide, được tạo thành
từ sự polymer hóa acrylamide và sự
liên kết chéo của
methylenebisacrylamide, được chọn
làm môi trường cho điện di vì nó có
tính trơ về mặt hóa học và được tạo
hình nhanh chóng. Điện di là một
cách lọc qua gel mà theo đó tất cả các
phân tử, không xét về kích thước, sẽ
bị tác động một lực để di chuyển

trong cùng một chất nền. Gel ở đây có
thể xem tương đương với một hạt
trong cột lọc gel.
Các protein có thể được phân tách dựa
trên khối lượng bằng điện di trên
acrylamide dưới điều kiện đã bị biến
tính. Hỗn hợp protein được hòa tan
trong dung dịch sodium dodecyl
sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện
tích âm sẽ phá tất cả các nối không
cộng hóa trị của protein ban đầu.
Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay
dithiothreitol cũng có thể được thêm
vào để làm giảm số nối disulfide.
Phức hợp SDS với protein đã bị biến
tính có một điện tích thực âm tỉ lệ
thuận với khối lượng của protein.
Điện tích âm có được do gắn với SDS
lớn hơn rất nhiều điện tích của bản
thân protein ban đầu; vì thế, điện tích
ban đầu của protein không ảnh hưởng
đáng kể đến điện tích của phức hợp.
Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là
mẫu để chạy điện di. Khi điện di kết
thúc, những protein trên gel sẽ được
nhìn thấy là một dãy các băng bằng
cách nhuộm với bạc hay một chất
nhuộm màu như Coomassie blue.
Những đánh dấu phóng xạ có thể
được phát hiện bằng cách đặt một tấm

phim chụp x quang lên miếng gel, quá
trình này gọi là phóng xạ tự ghi.
Những protein nhỏ di chuyển nhanh
trong gel, trong khi những protein lớn
ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính di
động của phần lớn các chuỗi
polypeptide dưới những điều kiện như
thế tỉ lệ với khối lượng của chúng.
Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu
carbohydrate và protein màng không
tuân theo mối tương quan này. SDS-
PAGE có độ phân tách cao, cho kết
quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với
lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol)
protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm
với Coomassie blue và thậm chí ít hơn
(~0.02ug) vẫn có thể được phát hiện
khi nhuộm bằng bạc. Những protein
chênh lệch về khối lượng khoảng 2%
(ví dụ: 40 kD và 41 kD hay khác nhau
khoảng 10 acid amin) có thể phân biệt
được bằng SDS-PAGE.
Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta
đánh giá kết quả của quá trình tinh
sạch. Với những phân đoạn đầu tiên,
kết quả là dãy gồm rất nhiều protein.
Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số
lượng protein sẽ giảm và sẽ có một
băng ngày càng đậm. Vạch đó tương
ứng với protein mục tiêu.

V.2 Điện di dựa vào điểm đẳng
điện
Các protein còn có thể được phân tách
bằng điện dựa vào tỉ lệ giữa số acid
amin có tính acid và số acid amin có
tính base của chúng. Điểm đẳng điện
của một protein (pI) là điểm pH mà ở
đó điện tích thực của nó bằng 0. Tại
điểm pH này, tính di động của protein
trong điện trường cũng bằng 0 bởi vì
z trong công thức (1) bằng 0. Mỗi một
protein có một pI riêng; ví dụ như pI
của cytochrome C, một protein vận
chuyển ion có tính base cao, là 10.6,
trong khi pI của albumin huyết thanh,
một protein có tính acid trong máu, là
4.8. Giả định cho một hỗn hợp protein
chạy trong điện trường trong một
miếng gel với một khuynh độ pH,
không có sự hiện diện của SDS. Mỗi
protein sẽ di chuyển cho đến khi nó
đến vị trí mà tại đó pH bằng pI của
nó. Dựa vào hiện tượng này, ta có
phương pháp phân tách protein dựa
vào điểm đẳng điện của protein. để
tạo Khuynh độ pH, trước hết là cho
vào gel một hỗn hợp polyampholyte
(những polymer nhỏ đa điện tích) có
nhiều giá trị pI, sau đó điện di hỗn
hợp này. Điện di dựa vào điểm đẳng

điện phân tách protein nhanh với khả
năng phân biệt được sự chênh lệch pI
khoảng 0.01 hay những protein khác
nhau chỉ một đơn vị điện tích cũng có