chuẩn độ nito theo phương pháp kjeldah

TRƯỜNG ĐAI HỌC BÁCH KHOA
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THÍ NGHIỆM HOÁ SINH
BÀI 7
ĐỊNH LƯỢNG NITO TỔNG THEO PHƯƠNG
PHÁP KJELDAHL
GVHD: HUỲNH NGỌC OANH
Nhóm TN: Nhóm 4_ chiều thứ 6
Ngày TN : 26/03/2010
TRẦN THỊ KIM DUNG 60700358
NGUYỄN THỊ HƯƠNG HẠ 60700701
NGUYỄN THỊ HẢI 60700678
BÀI 7a:
THỰC HIỀN CHƯNG CẤT ĐAM BẰNG BỘ
CHƯNG CẤT KJELDAHL
1. NGUYÊN TẮC
Dưới tác dụng của H
2
SO
4
đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nito bị
phân huỷ và oxy hoá đến CO
2
và H
2
O còn nito chuyển thành amoniac
(NH
3
) và tiếp tục kết hợp với H

2
SO
4
tạo thành muối amoni sulfat
Quá trình được thực hiện theo các bước sau:
Bước 1: Vô cơ hoá nguyên liệu
R-CH-COOH + H
2
SO
4
CO
2
+H
2
O+(NH
4
)
2
SO
4
NH
2
Bước 2: Cất đạm
phản ứng xảy ra trong thiết bị cất đạm
(NH
4
)
2
SO
4

+2NaOH Na
2
SO
4
+2NH
3
+2H
2
O
Phản ứng xảy ra trong bình hứng
NH
3
+H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4
+H
2
SO
4
dư
Bước 3: Chuẩn độ lượng H
2
SO

4
còn thừa trong bình hứng bằng NaOH
t
Xúc tác

BỘ CHƯNG CẤT ĐẠM KJELDAHL
GIỚI THIỆU TERMAMYL
-Termamyl là tên thị trường của enzyme amylase
-Termamyl là một loại alpha-amylase ổn định nhiệt sản xuất bởi một chủng
Licheniformis Bacillus.
Ứng dụng:
-Termamyl được sử dụng trong các ngành công nghiệp sau đây:
Tinh bột
Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ
thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn
tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo
A
B
C
D
E
F
P
1
P
2
và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường,
công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau
đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất
nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu

cơ, amino acid,….
Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá
và giai đoạn đường hoá. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên,
trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng
acid và bằng enzym. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid
vô cơ như HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất
khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không
đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng
enzym để thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển.
Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành
công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều
nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase càng
ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện
nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà
không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV, cụ thể là
các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng.
Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân
tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng,
giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường.
Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt), hạt bắp nảy
mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,…
đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở
nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho
nhiều ngành khác phát triển. Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm
mềm vải,…
Trong công nghiệp tinh bột, Termamyl được sử dụng cho các hóa lỏng liên
tục của tinh bột ở nhiệt độ lên tới 105-110 ° C, lợi dụng sự ổn định nhiệt cực
độ của enzym này.
Rượu
Trong công nghiệp rượu, Termamyl được sử dụng cho tinh bột mỏng trong

chưng cất mashes.
Mía đường
Trong công nghiệp đường, Termamyl được sử dụng để phá vỡ các mặt tinh
bột trong nước trái cây mía. Qua đó nội dung tinh bột đường thô giảm và lọc
tại nhà máy lọc tạo điều kiện.
Dệt may
Trong ngành công nghiệp dệt may, Termamyl được sử dụng cho hàng dệt
trước khi nhuộm ở nhiệt độ cao.
HOẠT ĐỘNG
-Enzyme termamyl là một endoamylase bẻ gãy mối liên kết hydrolyses 1,4-
alpha glycosidic trong amylose và Amylopectin, hai thành phần của tinh bột.
Do đó ,tinh bột bị phá vỡ nhanh chóng để tạo dextrins và oligosaccharides.
-Termamyl hoạt động tối ưu ở pH 7 và 90 ° C.
-Termamyl là một amylase được sử dụng để loại bỏ vết bẩn tinh bột .
-Termamyl hiệu quả loại bỏ vết bẩn tinh bột và cung cấp độ trắng.
Termamyl là có hiệu quả tại môi trường kiềm tương đối cao và ở nhiệt độ
cao.
Tổng quan về enzym amylase
Amylase là gì?
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme
này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử
trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước.
Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( enzyme nội bào ) và
exoamylase ( enzyme ngoại bào ).
Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm
enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase (
hay α-dextrin 6 – glucosidase); khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-
1,6-glucosidase) và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các
liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.
Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy

phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.
Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:
• Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ
như khoai lang, khoai tây, khoai mì… , trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và
có công thức tổng quát là (C6H12O6)n.Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau
đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin ( Meyer, 1940 ). Các loại tinh bột
đều có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin. Trong thực vật, tinh bột
được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng.
-Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200-
1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành
một mạch xoắn dài không phân nhánh.
-Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được
cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4-
glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột
không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng ( 60-
850C ) thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột . Dưới tác dụng
của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân
cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch
hóa và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian
dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và
glucose.
-Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng
cho cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh
bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose.
Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung
cấp chủ yếu là đường và tinh bột.
• Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ
thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò
quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, VSV, glucogen
được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở

các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside.
Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2
triệu-3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều
Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ.
Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan.
Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylas
Đặc tính của enzym α-amylase
α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi
loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một
protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic
acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên
phân tử enzyme:
- α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine.
- Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir
1956;Fisher,Stein, 1960 ).
- Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng.
- Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline.
-Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).
-α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30
nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham
gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt
động của enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự
tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động
của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca
thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền
với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm
lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kiềm
hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như :Li+,
Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến
α-amylase.

Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau
( g/100 g protein ): alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9, leucine= 8,3;
Isoleucine= 5,2; prolin= 4,2, phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan=
4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7, cystein + cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9;
amide= 1,5 ( Akabori et amiloza, 1954 ). Không giống các α-amylase khác,
amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose
này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol
enzyme ( Akabori et amiloza, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ,
song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm
hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme.
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương
tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối
với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) .α-amylase của nấm
sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy
phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc
phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân
nhánh.
Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm
sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ α-amylase
VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên
men. Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và
maltose có thể lên tới 84-87%.
Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không
giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 (
có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH
tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ
Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối
thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của
Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn

Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn
sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt
lực của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova,
Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH=
5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-
2,8.Ở 0oC và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác
nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác
động nhiệt. . Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở
70OC( Kozmina, 1991 ).
Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác
động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của
nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. Ở 500C trong 2 giờ, α-
amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn ( Miller và cộng sự ).
Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase
α-amylase ( 1,4-α-glucan-glucanhydrolase ). α-amylase từ các nguồn khác
nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách các
liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất ( tinh bột hoặc
glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase
không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên
song với tốc đột rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn.
+ Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ):Chỉ một số phân tử cơ chất bị
thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt
của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa
nhanh ).
+ Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với
iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới
disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị

phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose( vì vậy,
người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc
glucopiranose 1 ).
+ Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và
maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân
của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase
lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết
α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu
tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72%
maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông
thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử
thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao
của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại
amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa.
Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase:
+ Giai đoạn dextrin hóa:
Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp
+ Giai đoạn đường hóa:
Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide
Amylase oligosacharide poliglucose
Maltose maltotriose maltotetrose
2.NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT , THIẾT BỊ:
NGUYÊN LIỆU: Mẫu termamyl đã vô cơ hoá và pha loãng
HOÁ CHẤT :
H
2
SO

4
N/100
NaOH N/100
Metyl đỏ
CÁCH TIẾN HÀNH:
Bước 1: Vô cơ hoá mẫu _ termamyl dùng đã được vô cơ hoá mẫu sẵn.
Bước 2 : Cất đạm
a )Rửa máy :
- Đun sôi bình A và mở nước vào ớng làm lạnh F. Khoá P
1
và P
2
đều đóng ,
sau đó cho vào phễu D ít nước cất (khoảng 10ml) và cho chảy xuống bình C
bằng P
2
.
Hơi nước của bình A sẽ từ từ qua erlen F, cứ để như vậy cho đến khi erlen F
có khoảng 5ml nước thì ngưng đun bình A, làm nguội bình A , áp suất trong
bình A giảm xuống đồng thời áp suất trong bình B cũng giảm , do đó nước
trong bìnhC sẽ rút qua B .
- Khi nước đã rút hết ta lại thêm nước vào phễu D, và lại mở kẹp cho nước
chảy qua C, kế đó nước sẽ rút qua B.
Ta làm như vậy chừng vài lần.
- Nuớc ở bình B đầy ta mở kẹp P
1
cho nước chảy ra.
Khoá kẹp P
1
và P

2
lại.
b)Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH
3
(bình F):
Cho vào bình hứng F (erlen 250 ml) 15ml H
2
SO
4
N/100 và 5 giọt thuốc thử
metyl đỏ, dung dịc có màu tím đỏ.
Đặt bình hứng sao cho đầu mút của ống sinh hàn E ngập trong dung dịch
của bình hứng.
c)Thực hiện chung cất lôi cuốn hơi nước:
- Lúc này bình A đang được đun sôi, kẹp P
1
v à P
2
đóng. Đổ vào phễu D 10
ml dung dịch termamyl, mở kẹp P2 sao cho dung dịch chảy từ từ xuống bình
C, đóng P
2
lại. Đổ nước tráng vào D và mở kẹp cho nước chảy từ từ xuống C
cho đến khi mực nước trong D xuống gần sát kẹp P
2
thì khoá kẹp P
2
lại. Sau
đó tráng D bằng nước cất vài lần với thao tác như trên.
- Thêm vào phễu D 10 ml NaOH đậm đặc . Mở khoá P

2
từ từ để cho NaOH
chảy từ từ xuống C từng giọt một. Nếu nước trong C trào lên mạnh quá thì
khoá P
2
lại, rồi sau đó lại tiếp tục cho NaOH chảy gần hết xuống C.
Tráng phễu D 2 lần bằng nước cất , chỉ cho nuớc chảy gần sát tới P
2
mà thôi.
- Tiếp tục chưng cất lôi cuốn hơi nước trong 5 phút, sau đó hạ erlen xuống
sao cho đầu mút của ống sinh hàn trong không khí , đun tiếp 3 phút. Rửa đầu
mút của sinh hàn E nằm trong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu mút
lại bằng nước cất, rồi lấy erlen ra để định lượng H
2
SO
4
thừa.
- Ngưng đun bình A , rửa máy vài lần.
*Ta thực hiện lại một lần thử không thay vì dùng termamyl ta dùng 10 ml
nước cất.
Bước 3: Chuẩn độ
Lượng H
2
SO
4
N/100 còn thừa trong bình F được chuẩn độ bằng NaOH
N/100. Quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ tím sang
màu vàng nhạt.
3.SƠ ĐỒ KHỐI
XÁC ĐỊNH HỆ SỐ HIỆU CHUẨN :

Lấy 2 erlen , cho vào mỗi erlen 20 ml H2SO4 N/100 và vài giọt metyl đỏ .
Sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH N/100 .
MẪU
TERMAMYL
10 ML
CHO VÀO PHỄU D, TRÁNG LẠI
PHỄU BẰNG NƯỚC CẤT
RỬA MÁY CHƯNG CẤT ĐẠM 2
ĐẾN 3 LẦN
CHUẨN BỊ DUNG DỊCH Ở BÌNH
HỨNG F : 15 ml dung dich H2SO4
N/100, 5 giọt metyl đỏ
RỬA MÁY CHƯNG
CẤT ĐẠM
CHO 10 ml DUNG DỊCH NaOH ,
TRÁNG LẠI BẰNG NƯƠC CẤT
-CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC TRONG 5 PHÚT
-SAU ĐÓ HẠ ERLEN XUỐNG SAO CHO ĐẦU MÚT
CỦA ỐNG SINH HÀN TRONG KHÔNG KHÍ , ĐUN
TIẾP 3 PHÚT.
-RỬA ĐẦU MÚT CỦA SINH HÀN E NẰM TRONG
KHÔNG KHÍ, ĐUN TIẾP 3 PHÚT NỮA.
-RỬA ĐẦU MÚT LẠI BẰNG NƯỚC CẤT
ĐUN SÔI BÌNH A
VÔ CƠ HOÁ
MẪU
TERMAMYL
NaOH
N/100
10 ml

LẤY DUNG DỊCH TRONG BÌNH F
CHUẨN ĐỘ VỚI NaOH N/100 ĐẾN KHI
DUNG DỊCH CHUYỂN SANG VÀNG
NHẠT
4. KẾT QUẢ
Thể tích NaOH N/100 (ml)
Mẫu trắng (V
0
) 12.8
Mẫu chuẩn ( V
1
) 7.9
Xác định hệ số hiệu chỉnh (lần 1) (V
NaOH1
)
16.8
Xác định hệ số hiệu chỉnh (lần 2) (V
NaOH2
)
17
a) Hệ số hiệu chuẩn
V
NaOH1
= 16,8 ml
V
NaOH2
= 17,0 ml
vậy V
NaOH
= 16,9 ml

Hệ số hiệu chuẩn
1834.1
9.16
20
100/20
100/
===
NNaOH
V
NNaOHml
X
b) Tính lượng đạm có trong mẫu
Gọi V
o
là thể tích NaOH của lần thử không , V
o
=12,8ml
V
1
là thể tích NaOH của lần thử thât , V
1
=7,9 ml
Lượng NaOH tương ứng với NH
3
phóng thích bởi 10 ml dung dịch
termamyl đã vô cơ hoá và pha loãng
▲V=V
0
-V
1

= 12.8 – 7.9 =4.9
Số mol NH
3
phóng thích tương đương với số mol NaOH. Do đó , số mol
NH
3
phóng thích bởi 10ml dung dịch termamyl là :
)(10798.5101834.19.410
1000.100
.
555
molXV
XV
−−−
∗=∗∗=∆=
∆
Số gram đạm có trong 10ml dung dich termamyl đã vô cơ hoá và pha loãng
là:
14.∆V.X.10
-5
=14*5.798*10
-5
=8.118*10
-4

(g)

Số gram đạm có trong 100ml dung dịch đạm vô cơ hoá là
)(10118.810 14
10

100
.10 14
345
gXVXV
−−−
∗=∆=∆
Số gram đạm có trong 1 lit mẫu ban đầu
)/(118.8
1
1000
*1834.1*9.4*14
1000
.10 14
4
lg
Vm
XV
==∆
−
5.NHẬN XÉT
Phương pháp cho kết quả khá chính xác, thực hiện khá đơn giản, sai số
không cao.
Lượng đạm có trong mẫu termamyl tương đối thấp.
6. MỞ RỘNG
Johan Gustav Christoffer Thorsager
Kjeldahl
(1849-1900), nhà hoá học người Đan Mạch
Định lượng nitơ tổng số theo phương pháp Microkjeldahl
1. Nguyên tắc: Trong phân tử protein, hàm lượng nitơ chiếm tỉ lệ 15- 18%
khối lượng phân tử. Do đó nếu xác định được hàm lượng % nitơ trong

nguyên liệu, tùy theo mỗi loại protein mà ta nhân với hệ số khác nhau.
Hàm lượng protein động vật: % protein = % N protein x 6,25
Hàm lượng protein thực vật: % protein = % N protein x 6,25 đối với hạt
ngũ cốc. % protein = % N protein x 5,75 đối với hạt đậu đỏ.
Dưới tác dụng của H2SO4 đặc, nhiệt độ cao nitơ có trong thành phần các
hợp chất hữu cơ tạo thành (NH4)2 SO4. Dùng kiềm đặc, đầy nitơ ra khỏi
muối của nó dưới dạng NH3 kết hợp với hơi nước tạo thành NH4OH. Lượng
nitơ có trong thành phần NH4OH được xác định bằng hệ chuẩn H2SO4-
NaOH hoặc H3BO3- H2SO4 0,01N.
2. Hóa chất và nguyên liệu:
BỘ CHƯNG CẤT KJELDAHL
LỚN
Thuốc thử hỗn hợp: xanh metylen 0,1% và đỏ metylen 0,1% trong ethanol
960 với tỉ lệ ½; H2SO4 đặc; hỗn hợp xúc tác K2SO4/ CuSO4 với tỉ lệ 3/1;
H2SO4 0,01N; NaOH 0,01N; H3BO3 2%; ethanol 960; axit trichloacetic
20%. Các nguyên liệu có nguồn gốc động vật như thịt, cá, nguồn gốc thực
vật như gạo, ngô, đậu đỗ, sấy khô tuyệt đối ở 1050C
3. Dụng cụ:
Ống đong 100ml, 50ml, 10ml; bình định mức 100ml (3); cốc 250ml, 100ml,
50ml(3), đũa thủy tinh (3); lọ đựng hóa chất(7); máy Microkjeldahl bán tự
động hoặc tự động; bếp đun; ống sinh hàn
4. Tiến hành:
Cân 200mg nguyên liệu dạng bột sấy khô tuyệt đối cho vào bình kjeldahl,
dùng ống đong 10ml H2SO4 đặc đổ vào bình kjeldahl sẽ thấy xuất hiện màu
nâu đen do nguyên liệu đã bị oxy hóa. Cho thêm 200mg hỗn hợp xúc tác, lắc
nhẹ, đậy kín bình, để một thời gian cho H2SO4 tác dụng với nguyên liệu sẽ
giảm bớt được thời gian đun. Sau đó đặt bình kjeldahl lên bếp đun (đặt hơi
nghiêng), đậy miệng bình bằng phễu thủy tinh, đặt bếp vào trong phòng hút
khí. Khi đã sôi, giữ nhiệt độ bếp đun không quá cao để tránh hóa chất trào
ra, vừa tránh mất amoniac.

Trong khi đun theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi
thấy dung dịch có màu trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân
tử ở trên thành bình chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho
đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình, chuyển dung dịch sang
bình định mức 100ml, dùng nước cất tráng lại bình kjeldahl và dẫn tới vạch.
- Giai đoạn cất đạm theo phương pháp dùng hệ chuẩn H2SO4- NaOH:
Cho nước cất 1 lần tới 2/3 thể tích của bình, cắm điện đun sôi nước trong
bình. Hơi nước và nhiệt độ của bình 1 giúp cho nitơ trong (NH4)2 SO4 của
dịch nghiên cứu bị NaOH 30% đẩy ra dưới dạng NH3. NH3 được ngưng tụ
nhờ hệ thống làm lạnh và hơi nước tạo thành NH4OH. Sau khi nước trong
bình đã sôi, cho vào bình hứng 10ml H2SO4 0,01N và 3 giọt thuốc thử hỗn
hợp, dung dịch trong bình nón sẽ có màu tím hồng chứng tỏ môi trường axit.
Đặt bình hứng vào giá đỡ sao cho đầu mút của ống sinh hàn ngập trong dung
dịch của bình hứng. Nếu lương axit trong bình hứng không đủ ngập, có thể
cho thêm vào một ít nước cất vô đạm.

Máy Microkjendahl
Các bộ phận của máy:
1. Bình đun
2. Bình cất
3. Hệ thống sinh hàn
4. Bình hứng
5. Bình đựng dung dịch thải
Cho vào bình cất 10ml dung dịch nghiên cứu và 3 giọt thuốc thử hỗn hợp,
sau đó tráng phễu bằng nước cất vô đạm. Cho tiếp vào bình cất 15ml NaOH
30% rồi đóng chặt van lại. Dung dịch trong bình cất chuyển từ màu tím
hống sang màu xanh lá mạ thể hiện môi trường kiềm. Sau 8-10 phút cất
đạm, để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử
dung dịch ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ còn màu xanh thì phải cất đạm
tiếp, nếu giấy quỳ không đổi màu thì quá trình cất đạm đã xong, lấy bình

hứng đem chuẩn độ.
- Chuẩn độ: Dùng NaOH 0,01N chuẩn độ cho tới khi dung dịch trong bình
hứng chuyển từ màu tím hồng sang màu xanh lá mạ. Lượng NaOH 0,01N
dùng để chuẩn độ bằng H2SO4 0,01N còn dư trong bình hứng.
- Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số hay nitơ toàn phần được tính theo
công thức N% = 1,42 x( V1 – V2) x 100 / a
V1: Số ml H2SO4 0,01N cho vào bình hứng.
V2: Số ml NaOH 0,01N đã chuẩn độ.
( V1 – V2): Số ml H2SO4 0,01N trong bình hứng đã bị trung hòa bởi
NH4OH được tạo ra do quá trình chưng cất đạm
1,42 là hệ số: cứ 1ml H2SO4 0,01N dùng để trung hòa NH4OH thì tương
đương với 1,42 mg nitơ.
a là số nguyên liệu tính bằng gam của mẫu cất đạm
Sau khi tính được nitơ tổng số, đem kết quả đó nhân với hệ số tương ứng sẽ
cho ra hàm lượng protein trong nguyên liệu
BÀI 7b:
XÁC ĐỊNH NITO TỔNG VỚI MẪU MÌ TIỂU NHỊ
BẰNG MÁY KJELDAHL TỰ ĐỘNG
1. NGUYÊN TẮC
Trước tiên mẫu được vô cơ hoá bằng H
2
SO
4
đậm đăc ở nhiệt đọ cao và có
chất xúc tác . Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá xảy ra như sau:
2 H
2
SO
4
2H

2
O +2SO
2
+O
2
Oxy tạo thành lại oxy hoá các nguyên tố khác : cacbon tạo thành CO
2
,
hydro tạo thành H
2
O , còn nito giải phóng ra dưới dạng NH
3
kết hợp với
H
2
SO
4
dư tạo thành (NH
4
)
2
SO
4
tan trong dung dịch.
NH
3
+ H
2
SO
4

(NH
4
)
2
SO
4
QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT ĐẠM BẰNG HỆ THỐNG TỰ ĐỘNG
Chất đạm đã được vô cơ hoá nằm dưới dạng amoni sulfat khi có tác dụng
với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac.
(NH
4
)
2
SO
4
+2NaOH Na
2
SO
4
+H
2
O +2NH
3
Sau đó , NH
3
được hơi nước lôi cuốn và đưa vào dung dịch H
3
BO
3
. Trong

dung dịch này, NH
3
tồn tại dưới dạng ion NH
4
+
và giải phóng ra ion H
2
BO
3
-

Chuẩn độ lượng ion nàu bằng HCl chuẩn sẽ xác định được lượng amoniac
sinh ra. Từ đó, suy ra được lượng đạm trong mẫu nguyên liệu ban đầu.
CÁC THIẾT BỊ TỰ ĐỘNG CHƯNG CẤT KJELDAHL
2.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
Bộ chưng cất đạm Kjeldahl tự động
Erlen 250 ml
THIẾT BỊ VÔ CƠ
HOÁ MẪU
THIẾT BỊ CHƯNG
CẤT ĐẠM
Burret 25 ml
3. HOÁ CHẤT
Dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc
Dung dịch NaOH 40%
Hỗn hợp xúc tác K

2
SO
4
và CuSO
4
(tỉ lệ 3:1)
Dung dịch H
3
BO
3
%
Thuốc thử hỗn hợp metyl đỏ 0.1 % pha trong cồn
4.CÁCH TIẾN HÀNH
- Vô cơ hoá mẫu : cho 5 (g) mì tiểu nhị vào ống Kjeldahl , thêm vào 5ml
dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc và hỗn hợp xúc tác K
2
SO
4
và CuSO
4
. Đưa ống
vào máy để vô cơ hoá mẫu.
- Dịnh đạm bằng máy Kjeldahl :
Mẫu sau khi vô cơ hoá được đưa vào máy Kjeldahl để định đạm. Đồng thời ,
đưa vào một erlen có chứa thuốc metyl đỏ để thu mẫu .
Mẫu này sau đó đem đi chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0.1 N đến khi xuất

hiện màu hồng nhạt.
SƠ ĐỒ KHỐI
5g MÌ TIỂU NHỊ
THU MẪU
CHUẨN ĐỘ MẪU BẰNG DUNG DỊCH HCl 0.1 N
VÔ CƠ HOÁ MẪU
ĐỊNH ĐẠM BẰNG MÁY KJELDAHL TỰ ĐỘNG
DUNG DỊCH H2SO4
HỖN HỢP K2SO4 VÀ
CuSO4
ERLEN CHỨA
METYL ĐỎ
KẾT QUẢ
thể tích HCl 0.1 N (ml)
Mẫu trắng 0.01
Mẫu thật 5.2
Hàm lượng Nito tổng số ( N
t
) trong nguyên liệu là:
)/(266.7
1
1000*0014.0)01.02.5(10000014.0)(
1
lg
V
VV
N
t
t
=

∗−
=
∗∗−
=
V1: thể tích HCl 0.1 N chuẩn độ mẫu thật
Vt: thể tích HCl 0.1 N chuẩn độ mẫu trắng
V:thể tích dịch mẫu lấy ban đầu
0.0014 : số gram nito ứng với 1ml HCl 0.1N
6.NHẬN XÉT
Lượng nitơ có trong mẫu ban đầu khá cao.
Phương pháp này khá chính xác và đơn giản.
7.MỞ RỘNG
Ngoài ra còn có một số máy chưng cất tự động Kjeldahl được thiết kế khác
Định lượng N - Protein bằng máy Kjeldahl
Nguyên tắc của quá trình phân tích
Mẫu được vô cơ hoá bằng H
2
SO
4
đđ ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác.
Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá mẫu xảy ra như sau:
2H
2
SO
4
2 H
2
O + 2SO
2
+ O

2
Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hoá các nguyên tố khác. Các phân
tử chứa nitơ dưới tác dụng của H
2
SO
4
tạo thành NH
3
. Các protein bị thuỷ
phân thành axit amin. Cacbon và hydro của axit amin tạo thành CO
2
và H
2
O,
còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH
3
kết hợp với axit H
2
SO
4
dư tạo
thành (NH
4
)
2
SO
4
tan trong dung dịch.
2NH
3

+ H
2
SO
4
(NH
4
)
2
SO
4
Các nguyên tố khoáng khác như P, K, Ca, Mg,…chuyển thành dạng oxit:
P
2
O
5
, K
2
O, CaO, MgO…tuy tồn tại trong dung dịch mẫu nhưng không ảnh
hưởng đến kết quả phân tích.
Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH.
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH = Na
2
SO
4

+ H
2
O + 2NH
3
NH
3
bay ra cùng với nước sang bình hứng. Bình hứng có chứa H
3
BO
3
do
đó NH
3
bay ra sẽ tác dụng ngay với H
3
BO
3
theo phản ứng:
2NH
3
+ 2H
2
O + 4H
3
BO
3
= (NH
4
)
2

B
4
O
7
+ 7H
2
O
Lượng (NH
4
)
2
B
4
O
7
được xác định thông qua việc chuẩn độ bằng HCl
0,25N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt và không bị mất
màu.
Những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích
+ Nồng độ HCl 0,25N không đảm bảo chính xác
+ Lấy mẫu không đại diện
+ Cân mẫu không chính xác
+ Nguồn nước bị nhiễm N
Khả năng ứng dụng của phương pháp Kjeldahl
Phương pháp này có khả năng ứng dụng cho hầu hết các loại mẫu:
+ Mẫu thực phẩm: thuỷ hải sản, nước mắm, các loại đậu, thức ăn nuôi
tôm cá, rau quả…
+ Đất, nước thải
+ Bã men bia, bánh dầu đậu nành, bánh dầu cao su…
Nguyên tắc hoạt động của máy Kjeldahl

Mẫu được đưa vào bồn đốt (hệ thống vô cơ hoá mẫu) thông qua các ống
Kjeldahl Sau khi vô cơ hoá mẫu xong, toàn bộ mẫu + ống Kjeldahl được
đưa qua hệ thống chưng cất NH
3
toàn bộ sản phẩm được đưa qua thiết bị
chuẩn độ Kết Quả.
Thực Hành
Qui trình
Phân tích mẫu đậu phộng:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
-Mẫu hạt được nghiền mịn
-Sấy mẫu ở 80oC cho đến khi đạt trọng lượng không đổi
Bước 2: Vô cơ hoá mẫu
-Cân 0,3 – 1 g mẫu khô đã được nghiền mịn.
-Cho mẫu vào tận đáy của ống Kjeldahl (chu ý không để dính trên thành
ống)
-Cho 5g hỗn hợp xúc tác K
2
SO
4
và CuSO
4
theo tỉ lệ 10:1
-Dùng pipet hút 15ml H
2
SO
4
đậm đặc (d=1,84) cho vào ống vô cơ hoá
mẫu có chứa hỗn hợp trên.
-Lắp ống trên vào hệ thống vô cơ hoá mẫu.

-Việc vô cơ hoá mẫu hoàn toàn khi toàn bộ dung dịch trong ống vô cơ
hoá mẫu có màu xanh trong suốt.
Bước 3: Chưng cất mẫu
-Lắp ống vô cơ hoá mẫu vào bộ chưng cất, lắp bình hứng chứa 10-60ml
H
3
BO
3
4% và 7 giọt dung dịch chỉ thị màu.
-Khởi động máy cất.
-Quá trình chưng cất tiến hành khoảng 390 giây thì toàn bộ khí NH
3

chuyển sang bình hứng.
-Khi NH
3
được cất hoàn toàn, hạ bình hứng xuống, dùng tia nước cất nhỏ
tráng sạch axit dính đầu ống làm lạnh.
Bước 4: Chuẩn độ
Bước 5: Tính kết quả
Ta có 1ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035g N.
Thông qua số ml HCl 0,25N, người ta biết được số lượng axit boric kết
hợp với NH
3
, từ đó biết lượng NH
3
giải phóng từ mẫu.
N tổng (%) = (VHCl * 0,35)/ P mẫu
Trong đó: V tính bằng ml
P tính bằng g

Protein tổng (%) = (VHCl * 0,35* 6,25)/ P mẫu

Một số thiết bị và hoá chất sử dụng
Thiết bị:
- Tủ sấy mẫu
- Máy nghiền mẫu
- Cân phân tích 4 số
- Máy phân tích đạm tự động Kjeldahl
- Thiết bị chuẩn độ
- Máy cất nước 2 lần
Hoá chất:
- Hỗn hợp K
2
SO
4
và CuSO
4
theo tỷ lệ 10:1
- Nước cất 2 lần
- NaOH 32%