phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) pdf

2.3. Nhân gene và kỹ thuật giải
trình tự ADN.

Sau đây là những nét chung
nhất của kỹ thuật PCR:
Nguyên tắc cơ bản của PCR:
+ Khái quát chung:
PCR là phương pháp dùng
enzym khuyếch đại chọn lọc một
đoạn ADN theo luật số mũ. Phản
ứng nhân gene được thực hiện với
enzym ADN chịu nhiệt, hai mồi
tổng hợp và 4 loại
deoxyribonucleic (dATP, dGTP,
dCTP và dTTP). Mỗi một chu kỳ
phản ứng nhân gene gồm 3 bước
(xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là
biến tính ADN, có tác dụng tách
hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép.
Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai
sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo
dài chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với
quá trình trùng hợp gắn các dNTP
dọc theo sợi khuôn để tạo thành
phiên bản mới theo nguyên tắc bổ

sung. Tính đặc hiệu của phản ứng
được quy định bởi mồi và sự sao
chép trực tiếp theo trình tự sợi
khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết
quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi
khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn
ADN có kích thước 20-30
nucleotid được thiết kế theo trình tự
của đoạn gene cần khuyếch đại dựa
theo dữ liệu có sẵn. Mỗi cặp mồi
phải hoàn thành chức năng của
mình trong toàn bộ phản ứng, tức là
chúng phải bám đặc hiệu vào đúng
vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như
vậy là do nếu chúng không bám
vào vị trí đặc hiệu thì không thể
khuyếch đại được đoạn gene đích.
Với các gene có độ bảo thủ cao như
rADN thì khi cặp mồi được thiết kế
thì chúng có thể nhân được gene từ
nhiều đối tượng. Ngược lại, trong
nhiều trường hợp dùng mồi không
đặc hiệu thì có thể nhân được các
sản phẩm PCR không đặc hiệu.
Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều
được dùng cho định typ vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần
đầu tiên dùng mảnh Klenow của
enzym ADN polymerase I

từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị
biến tính tại 94
o
C và như vậy cần
phải bổ sung enzym mới sau mỗi
chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình
này đã được cải thiện do dùng
enzym Taq ADN
polymerase (Taq = Thermus
aquaticus ) chịu nhiệt. Enzym này
được tách ra từ vi khuẩn sống ở
suối nước nóng. Tốc độ xúc tác cho
phản ứng của enzym này rất nhanh,
có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại
755
o
C. Hoạt tính enzym giảm một
nửa khi xử lý tại 92.5
o
C trong 230
phút hoặc 40 phút tại 95
o
C. Như
vậy khi dùng enzym này thì không
cần bổ sung enzym mới sau mỗi
chu kỳ phản ứng.

+ Các thông số kỹ thuật:

Bất kỳ một phản ứng PCR nào

cũng bắt đầu bằng việc tách ADN
làm sợi khuôn. Nói chung, theo lý
thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng
đủ cho phản ứng tạo ra sản phẩm
nhưng trong thực tế cần khoảng 10-
100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn bị
ADN theo phương pháp đơn giản
không cần tinh sạch cũng phù hợp
cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều
quan trọng là tránh sự có mặt của
EDTA (acide éthylène-diamine-
tétraacétique) hoặc đệm phosphat
vì kết quả sẽ làm giảm Mg
++
(do
EDTA hoặc tạo thành muối
Mg
3
(PO4)
2
khi nhiệt độ cao). Phản
ứng PCR có thể nhân được đoạn
gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế
thường dùng để nhân các đoạn có
kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có
thể tham khảo các thông số thành
phần phản ứng PCR trong bảng
dưới đây.

Bảng 1.8. Thành phần phản ứng

PCR.

Thành
phần
Số lượng
ADN khuôn

10-100 ng
dNTP (mỗi
loại)
200 mM
Mồi xuôi 0.1 – 1.0
mM
Mồi ngược 0.1 – 1.0
mM
Taq
polymerase
1 U
KCL 50 mM
Tris HCL
(pH 8.4) tại
25
o
C
10 mM
MgCl
2
2.85 mM
Gelatin 100 mg/l
Nonidet-40 0.05%

Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản
phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ.
Điều chú ý là các mồi cho phản
ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với
ADN đích gần nhau, có trình tự
không bổ sung nhau để tránh bắt
cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của
các mồi cũng phải khác với trình tự
vùng trung tâm của sản phẩm để
tránh tạo thành hiện tượng kẹp tóc.
Nói chung, ngày nay người ta có
thể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờ sự
trợ giúp của các chương trình máy
tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện
tượng nhân sản phẩm PCR không
đặc hiệu, điều này thường hay xuất
hiện khi dùng các cặp mồi suy biến
từ chuỗi acid amin. Tuy nhiên trong
hầu hết các trường hợp này thì việc
thay đổi điều kiện phản ứng có thể
hạn chế được các sản phẩm không
mong muốn. Các thành phần như
nhiệt độ, nồng độ Mg
++
và enzym
có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu.
Sự có mặt của nonidet-40 có tác
dụng tăng hiệu suất của phản ứng.

Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP
với sản phẩm PCR có thể là cách
nhanh chóng để tìm sự khác biệt
đối với các gene khác nhau. Với
cách này yêu cầu sản phẩm PCR
phải sạch và đồng nhất. Theo cách
này trình tự có thể được thực hiện
như sau: Sau khi điện di kiểm tra
độ sạch của sản phẩm PCR, tiến
hành kết tủa với ethanol. Kết tủa
được hoà với đệm thích hợp và sau
đó được xử lý với enzym cắt hạn
chế thích hợp. Kiểm tra kết quả
thông thường trên gel agarose,
trong một số trường hợp có thể trên
gel polyacylamid để thu được độ
phân giải cao hơn. Chú ý rằng
thông thường hoạt tính enzym giảm
5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy
có thể ước lượng 50% hiệu quả
khuyếch đại mất đi trong toàn bộ
quá trình phản ứng.
+ Một số khó khăn với phản
ứng PCR:

PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn
trong nghiên cứu sinh học phân tử
nhưng cũng nảy sinh một số vấn đề
cần chú ý đặc biệt khi phát hiện
một số bệnh virus hay vi khuẩn.

Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả
tế bào chết và tế bào sống đều cho
kết quả dương tính trong phản ứng
PCR. Phản ứng nhạy nên mọi sự
nhiễm ADN đều có thể đưa đến sản
phẩm dương tính giả trong kết quả.
Để hạn chế thực tế này cần tiến
hành với các mẫu đối chứng cần
thiết để biết được sự nhiễm tạp từ
các thành phần phản ứng hay từ
dụng cụ thí nghiệm.

Một vấn đề nữa cũng cần đề cập
là sai số trong phản ứng nhân gene
với enzym taq ADN polymerase.
Sai sót thêm nucleotid xảy ra với
mỗi một đơn vị sao chép khoảng
9000 nucleotid và đột biến dịch
khung xảy ra với số lượng tương
ứng khoảng 40 000 nucleotid.
+ Một số kỹ thuật PCR khác:
Một số kỹ thuật phát triển trên
cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa
quan trọng cho định danh và định
typ vi sinh vật là nested PCR (PCR
lồng), revert transtriptase PCR (sao
chép ngược) và asymmetric PCR
(PCR một chiều). PCR lồng là phản
ứng PCR bao bồm hai phản ứng
đồng thời, phản ứng đầu ở vòng

ngoài gene và sản phẩm của nó lại
làm khuôn cho phản ứng sau cho
đoạn nằm trong gene. Như vậy
phản ứng sau cần 1 hay 2 mồi để
nhân phần gene nằm trong sản
phẩm PCR từ hai mồi phía ngoài
tạo ra. Vai trò kỹ thuật này làm
tăng độ nhạy và đặc hiệu của phản
ứng PCR.
Phản ứng PCR phiên mã
ngược được dùng để nhân ADN từ
ARN của virus. Việc kết hợp phản
ứng này với PCR lồng có tác dụng
phát hiện ARN tại thời điểm nhất
định của mẫu.
Kỹ thuật PCR một chiều được
ứng dụng trong phương pháp giải
trình tự ADN trực tiếp từ sản phẩm
PCR.phẩm PCR.
+ Sử dụng kỹ thuật PCR cho
xác định typ vi sinh vật:
Như đã trình bày ở trên, dùng
cặp mồi đặc hiệu có thể xác định
được gene đặc trưng cho loài hay
thậm chí một chủng vi sinh vật nào
đó. Các chiến lược ứng dụng lợi thế
của kỹ thuật PCR dùng trong xác
định typ vi sinh vật trong nghiên
cứu dịch tễ học được chia làm 4
nhóm sau:

- Phân tích RFLPs với sản
phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc
hiệu.
Trong trường hợp này dùng kết
hợp kỹ thuật PCR và xử lý sản
phẩm PCR với enzym cắt hạn chế
và quan sát kết quả sau khi điện di
sản phẩm trên gel agarose hoặc
polyacrylamid Một dẫn chứng cho
kỹ thuật này là kết quả nhân gene
synthase citrat trong Ricketsiae sau
đó sản phẩm PCR được xử lý với
enzym cắt hạn chế để phân biệt
giữa các chủng với nhau (Regnery
và Ctv, 1991). Các ví dụ sau (bảng
1.8) đã cho thấy hiệu quả của
phương pháp này.
Bảng 1.9. Một số ví dụ cho kỹ
thuật RFLPs (Restriction
Fragment Length
Polymorphism) phân tích các
gene đặc hiệu được nhân lên bằng
kỹ thuật PCR.
Chủng vi sinh
vật nghiên cứu
Tác giả
nghiên cứu
và tài liệu
dẫn
Chlamydia spp. Kaltenboek et

al (1992)
Clostridium spp. Gurtler et al.
(1991)
Helicobacter
pylori
Foxall et al.
(1992)
Hepatilis C virus

Okamoto et
al.(1992)
Mycobacterium
tuberculosis
Ross
&Dwyer(1993
)
Nitrobacter spp. Navarro et
al.(1992)
Rickettsia spp. Regnery et al.
(1991)
Streptococcus sp
p.
McClellADN
et al. (1992)

+ Dùng kỹ thuật PCR cho
ribotyping:
Kỹ thuật PCR ribotyping là
ứng dụng các cặp mồi đặc hiệu để
nhân các vùng gene của ARN

(thuộc ribosom hay ARN vận
chuyển). Tuy nhiên, trong thực tế
kỹ thuật này yêu cầu kinh nghiệm,
kỹ thuật và tốn thời gian để thực
hiện phép lai. Để khắc phục hạn
chế này một cách tiếp cận được
trình bày ở đây là phân tích đa hình
(dấu vân tay) của vùng gene này
hay vùng gene xen kẽ của rARN
hoặc tARN.
Hầu hết các chủng vi khuẩn
đều chứa 2-22 phiên bản rARN
trong mỗi tế bào (Gottlie và
Rundner, 1985) trong khi đó vùng
xen kẽ giữa 16S và 23S chứa một
số các đoạn ADN lặp lại (Bacot và
Reeves, 1991). Trong khi đoạn
gene mã hoá cho tARN khá bảo thủ
thì vùng xen kẽ của tARN lại thay
đổi từ 2-35bp đối với Bacillus
subtilis (Vod, 1985) và từ 2-208bp
trên đối tượng E.coli (Jinks-
Roberson và Nomura, 1987). Như
vậy khi sử dụng cặp mồi nhân toàn
bộ vùng gene tARN có thể tạo ra
được sự khác biệt giữa các chủng vi
sinh vật. Kết quả ứng dụng kỹ thuật
này trên một số đối tượng được
trình bày trong bảng 1.9.

Bảng 1.10 Một số ví dụ sử dụng
kỹ thuật PCR cho ribotyping.
Vi sinh vật Tác giả và tài
liệu dẫn
Vi khuẩn
lactic
Klijin
etal.(1991)
Listeria Czajka et
al.(1993)
Mycoplasma
Van Kuppeveld
et al.(1992)
Pseudomonas
cepacia
Kostman et
al.(1992)
Pseudomonas
solanacearum

Seal et
al.(1992b)
Staphylococc
us spp.
Welsh
&McClellADN
(1992)
Streptococcus McClellADN(1
spp. 992)

Khi số phiên bản rARN tăng có
nghĩa là làm tăng độ nhạy của
phương pháp ứng dụng. Engstrand
và cộng tác viên (1920) đã công bố
có thể sử dụng mẫu dò là đoạn
nucleotid bổ sung với đoạn 16S của
rARN như là một trong số mồi cho
phép nhân phiên mã ngược ARN
và phép phân tích được thực hiện
nhờ kỹ thuật PCR nhân sản phẩm
cDNA được dùng cho phát
hiện Helicobacter spp. Độ nhạy của
phương pháp phát hiện này tăng 50
lần so với phương pháp truyền
thống.
+ Kỹ thuật rep-PCR:
Một phương pháp trực tiếp cho
kết quả finger printing không cần
sử dụng enzym cắt hạn chế là rep-
PCR dựa trên nguyên tắc nhân các
đoạn gene lặp lại. Thuật ngữ rep-
PCR là chỉ phương pháp chung sử
dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân các
chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi
sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ. Các
chuỗi lặp lại có độ bảo thủ cao
trong các đối tượng
thuộc Enterobacteriaceae và một
số đối tượng khác (Versalovic và
Lupsky, 1991). Dùng các đoạn mẫu

dò bảo thủ có thể lai với cả hai
đoạn ADN lặp lại: đoạn có kích
thước 126bp (Enterobacterial
repetitive intergeneic concensus-
ERIC) và đoạn 38bp (repetitive
extrageneic palindromic-REP) từ
bộ gene của Enterobacteriaceae vi
khuẩn gram âm và một số chủng có
quan hệ xa khác. Có thể trực tiếp
thiết kế cặp mồi cho các đoạn gene
bảo thủ để thu được kết quả finger
printing sau khi nhân gene dùng bộ
gene của các vi sinh vật có mang
các đoạn gene bảo thủ này. Sau khi
điện di có thể phát hiện được trên
agarose các đoạn gene có kích
thước khác nhau từ các nguồn vi
sinh vật khác nhau. Kỹ thuật này
được ứng dụng đã đem lại kết quả
tốt khi nghiên cứu mối quan hệ trên
các đối tượng Bacillus
subtilis (Versalovic và cộng sự,
1992), Citrobacterdiversus (Woods
và cộng sự,
1991), Rhizobium meliloti (Brujin,
1992). Thực tế phương pháp tạo ra
kết quả finger printing đa dạng từ
hầu hết các đại diện
củaEnterobacteriaceae (Versalovic
và cộng sự, 1991) và được ứng

dụng trên tất các vi khuẩn có mang
các đoạn gene bảo thủ lặp lại trên.
Phương pháp tương tự cũng cho
phép phát hiện sự khác nhau từ các
nguồn ADN trên các đối tượng
nhân thực thuộc chi Naegleria như
mô tả của Belkim và Quint (1992).
Phương pháp này dùng cho phát
hiện đa hình các đoạn gene chung
cho cả vi sinh vật nhân sơ và nhân
chuẩn.
+ Kỹ thuật RAPD (Random
amplified of polymorphic DNA):
Hạn chế của các phương pháp
nghiên cứu trước đây là phải dùng
cặp mồi đặc hiệu. Theo cách này
phải có các thông tin liên quan đến
đoạn gene nhất định và đối tượng
nghiên cứu. Khó khăn này được
loại bỏ trong trường hợp dùng các
mồi ngẫu nhiên hay tuỳ tiện, như
vậy phương pháp phân tích không
cần đến thông tin về geneome của
đối tượng nghiên cứu…Cơ sở của
phương pháp này đã được Welsh
và McClell ADN (1990) mô tả khi
dùng mồi ngẫu nhiên nhân gene và