phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) pps

2.1. Phân tích acid nucleic:
Kỹ thuật phân tích acid
nucleic liên quan chủ yếu đến phân
tích kích thước, cấu trúc acid
nucleic, mối tương quan về trình tự
acid nucleic thông qua giải trình tự
ADN và lai ADN.
a. Phân tích ADN plasmid:
Phương pháp phân tích ở đây
bao gồm tách plasmid, so sánh các
loại plasmid về kích thước sau đó
tinh sạch plasmid và xử lý bằng
enzym cắt hạn chế, sau đó điện di
trên gel agarose và so sánh sự đa
hình của các mảnh cắt để phân biệt
các chủng vi sinh vật với nhau.

Plasmid vòng

Streptomyces và Borrelia
Plasmid là nhân tố di truyền
ngoài nhân và sao chép độc lập với
nhiễm sắc thể. Cấu trúc plasmid là
sợi đôi ADN khép kín theo vòng.
Tuy nhiên, có nhiều trường hợp
ngoại lệ là sợi kép ADN mạch
thẳng (đối với vi
khuẩn Borrelia và Streptomyces).

Plasmid được tìm thấy hầu hết ở
các vi khuẩn và một số ít các vi
sinh vật nhân thực bậc thấp như
nấm men.
+ Tách plasmid:
Thông thường lượng plasmid có
trong tế bào chiếm < 5% tổng số
acid nucleic của tế bào. Như vậy, ta
phải thực hiện phép tách plasmid ra
khỏi ADN của nhiễm sắc thể. Nói
chung có nhiều phương pháp tách
plasmid từ vi khuẩn nhưng nguyên
tắc chung là phá tế bào vi khuẩn
dùng enzym, siêu âm hay trong
dung dịch kiềm có chất tẩy rửa là
SDS hoặc TritonX-100, sau đó là
việc loại ADN của nhiễm sắc thể
và protein. Thông thường dùng
phương pháp kết tủa với axetat.
Lúc này phần lớn các thành phần
ADN nhiễm sắc thể và protein của
tế bào đã bị kết tủa bị loại bằng li
tâm và plasmid nằm trong dịch trên
tủa được tách khi kết tủa với
ethanol hay isopropanol. Đây là
phương pháp có hiệu quả để tách
plasmid, trên thực tế hiệu quả tách
các plasmid có kích thước nhỏ cao
hơn nhiều so với các plasmid có
kích thước lớn (>100 Kb). Với các

plasmid có kích thước lớn cần các
thao tác nhẹ nhàng để tránh đứt gãy
do các nguyên nhân cơ học. Với
cách tách plasmid như trên thì sản
phẩm thu được có lẫn các đoạn
ADN có kích thước khoảng 500 bp
và nhiễm ARN. Để tránh nhiễm
ARN thì cần xử lý với RNase
(ribonuclease A). Tuy nhiên, có thể
tách theo các phương pháp như:
- Tách bằng Caeseium
chloride.
- Tách bằng KIT
QIAGENE.
- Tách bằng kỹ thuật
khác.

+ Điện di plasmid trên gel
agarose:

Sau khi thu được plasmid thì
phải tiến hành kiểm tra trước khi
phân tích kết quả điện di trên gel
agarose để biết phổ plasmid và kích
thước của chúng. Khi tiến hành
điện di thì nồng độ gel khoảng 0.7-
1% với một trong các đệm sau:
TAE (40 mM Tris acetat 1mM
EDTA, pH 8.0), TBE (89 mM Tris
borat 89 mM boric acid, 2 mM

EDTA, pH 8.0) và TPE (80 mM
Tris- phosphats 2 mM EDTA, pH
8.0). Sau khi điện di, gel được
nhuộm với ethidium bromide và
phát hiện dưới tia UV (310 nm).
Nồng độ ethidium bromide khoảng
5 mg/l và thời gian nhuộm là 10
phút. Sau đó được rửa một lần
nhanh bằng nước loại ion trước khi
được nhìn dưới UV và chụp ảnh
làm tài liệu.
Một số vấn đề cần lưu ý khi
phân tích plasmid: trên gel thông
thường plasmid được thấy ở 3
dạng: dạng siêu xoắn, dạng đứt gãy
và dạng mạch thẳng khi bị cắt bởi
endonuclease. Dạng di chuyển tốc
độ cao hơn là siêu xoắn (Hình 1.1).

Hình 1.1. Di chuyển của plasmid
mạch thẳng (L) và siêu xoắn (OC)
khi điện di
Đôi khi việc tách plasmid
cũng phức tạp đặc biệt trong những
trường hợp plasmid có kích thước
nhỏ có lẫn các mảnh ADN của
nhiễm sắc thể. Trong mọi trường
hợp đều có nhiễm các RNA và
chúng di động nhanh nhất trừ các
trường hợp plasmid như vậy không

được nhầm lẫn giữa plasmid siêu
xoắn và dạng chính plasmid đứt
gãy và plasmid khác. Một chú ý
khác là tránh nhầm lẫn khi so sánh
kích thước giữa các plasmid siêu
xoắn và dạng duỗi xoắn hay mạch
thẳng. Thực tế là chỉ có thể so sánh
các plasmid siêu soắn với nhau về
kích thước.
Khi tiến hành phân biệt giữa
các chủng vi khuẩn thì đương nhiên
là chỉ có thể thực hiện so sánh giữa
các chủng cùng có plasmid với
nhau. Cũng nên chú ý là không
phải các chủng đều giống nhau về
đặc tính miễn dịch nếu có chung
kết quả phân tích plasmid như
nhau. Phép phân tích sẽ có hiệu quả
trong các mẫu có nhiều loại
plasmid, tuy nhiên cũng phải tính
đến việc các plasmid cũng có thể bị
mất trong quá trình bảo quản.
+ Kỹ thuật dấu vân tay (finger
printing) phân tích plasmid
với enzym cắt hạn chế:
Cho đến nay, người ta đã tìm
thấy hơn 400 enzym cắt hạn chế.
Mục đích của kỹ thuật này bổ sung
cho kỹ thuật so sánh phổ kích
thước plasmid ở trên. Tức là người

ta có thể phân biệt được sự khác
nhau của các plasmid có cùng kích
thước. Như vậy, khi xử lý plasmid
với một hay kết hợp một số enzym
cắt hạn chế thì kết quả sẽ thu được
là các đoạn ADN được cắt có kích
thước khác nhau. Kết quả này có độ
lặp lại cao, do đó dễ sử dụng khi so
sánh các mẫu khác nhau.
Hiện nay, có nhiều enzym cắt
hạn chế được sản xuất và tiêu thụ
trên thị trường, các enzym này có
điểm nhận biết thay đổi từ 4-6 cặp
nucleotid. Thông thường xử lý
enzym trong 1 giờ sau đó mẫu
được phát hiện trên gel agarose
hoặc polyacrylamid Tuỳ thuộc vào
kích thước của các mảnh cắt mà sử
dụng agarose có nồng độ khác
nhau:
Bảng 1.1. Nồng độ agarose và kích
thước mẫu ADN tương ứng.

Nồng độ
agarose (%)
Kích
thước ADN
(kb)
0.3 1-7
0.5 0.7-45

0.8 0.4-20
1.0 0.3-10
1.2 0.2-8
1.5 0.2-6
2.0 0.1-5
Theo kinh nghiệm của nhiều
tác giả (Grimont-1991) phổ các
băng ADN có ý nghĩa cho so sánh
không nên dưới 10 băng và nên có
cả băng kích thước nhỏ và kích
thước lớn. Tuy nhiên, các băng lớn
không nên vượt quá 10 do băng có
kích thước lớn như vậy khó di
chuyển trên gel. Trong các trường
hợp so sánh thì nên dùng thang
chuẩn ADN để so sánh kích thước
và phép phân tích dấu vân tay cho
các lần phân tích khác nhau. Như
đã trình bày ở trên, nếu như phân
tích các chủng vi sinh vật dựa vào
kích thước plasmid có ý nghĩa đối
với các đối tượng có nhiều plasmid
thì phương pháp xử lý enzym cắt
hạn chế lại có ý nghĩa lớn trong các
trường hợp nghiên cứu dịch tễ học
trên các chủng có cùng phổ plasmid
hay plasmid có kích thước giống
nhau. Người ta đã ứng dụng kỹ
thuật này trong nghiên cứu
chủng E.coli (0157: H7) gây bệnh

từ thực phẩm (Hamburger). Các
plasmid từ các chủng khác nhau thì
có phổ khác nhau về các đặc điểm
cắt bởi enzym cắt hạn chế. Kết quả
tạo ra các mảnh ADN đặc trưng
cho cá thể làm cơ sở cho phép so
sánh. Tuy nhiên khó có thể so sánh
kết quả thu được từ các phòng thí
nghiệm khác nhau, sở dĩ như vậy là
do không dùng cùng một loại
enzym cắt hạn chế. Một lý do nữa
cũng cần được đề cập đến là sự
xuất hiện các đột biến ngẫu nhiên
tại vị trí enzym cắt, kết quả này tạo
ra sự khác biệt về phổ thu được từ
các mảnh cắt.

-