phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) ppt

Một số điểm cần được chi tiết
thêm cho mỗi bước như sau:
1, Chuẩn bị ADN khuôn:
Sợi khuôn cần được hiểu là việc
giải trình tự được thực hiện với sợi
đơn (vectơ M13) hay sợi đôi ADN.
Việc đọc trình tự theo sợi đơn
thường cho kết quả là kích thước
đoạn gene đọc dài và độ chính xác
cao. Ngày nay người ta thường đọc
sợi đôi vì việc chuẩn bị mẫu dễ
dàng hơn, ngoài ra khi sử dụng hai
phản ứng với hai mồi tương thích
thì quá trình đọc lại chính xác hơn.
Đó là ưu thế của cách đọc sợi đôi
ADN. Do vậy, rất cần đọc kết quả
từ cả hai sợi ADN. Hiện nay
phương pháp đọc trình tự ADN
trực tiếp từ sản phẩm PCR đang
ngày càng trở lên phổ biến.
2, Chuẩn bị sợi ADN mồi cho
bước bắt cặp vào sợi khuôn:
Người ta có thể dùng các đoạn
ADN mồi tiêu chuẩn đặc hiệu cho
trình tự ADN của vectơ gần sát với

sợi khuôn hay primer đặc hiệu của
sợi khuôn mà nó sẽ bắt cặp vào.
Tiện ích của việc dùng mồi chuẩn ở
chỗ mọi điều kiện đã được lựa chọn
cho sợi khuôn và mồi được dùng
lặp đi lặp lại nhiều lần cho các sợi
khuôn khác nhau. Hạn chế của loại
mồi này ở chỗ chỉ đọc được một
đoạn ngắn của gene (300 – 500
bps) trong trường hợp phải đọc các
gene có kích thước lớn cần phải
tiến hành subclone để đọc tiếp.
Điều này có thể thực hiện bằng
cách tạo ra các đoạn ADN ngẫu
nhiên từ toàn bộ gene sau đó lại
gắn vào vectơ để đọc cho hết trình
tự của gene.
Phương pháp tiếp theo là sử
dụng mồi được thiết kế theo
nguyên tắc bổ sung với trình tự của
gene. Theo cách này, lần lượt các
đoạn được đọc mà không cần thao
tác subclone. Tuy nhiên theo cách
đoạn mồi được thiết kế để đọc gene
như vậy thì điều kiện cho từng
phản ứng giải trình tự ADN với các
mồi khác nhau sẽ không được tối
ưu. Tuy vậy, hiện nay việc tổng
hợp mồi đã trở nên dễ dàng và phổ
biến với giá thành thấp, hơn thế

nữa với sự trợ giúp của tin học thì
bước thiết kế mồi đã được tối ưu
hoá. Vì vậy phương pháp này ngày
càng trở lên thông dụng hơn. Sau
khi mồi đã được thiết kế thì việc
tiếp theo là chọn cách đánh dấu vào
mồi hay vào đoạn ADN sẽ được
tổng hợp. Ưu thế của việc đánh dấu
ngay tại đầu 5’ của mồi ở chỗ các
băng ADN thường có cùng một
cường độ tín hiệu. Thông thường
với phương pháp đọc trình tự thủ
công thì P
32
thường được dùng. Ưu
thế của nó là mang gốc photphat
cao năng bêta mạnh, do đó chỉ cần
trong thời gian ngắn là thu được tín
hiệu. Hạn chế của phương pháp này
là do mang năng lượng cao nên khó
phân biệt giữa các băng khác nhau
so với dùng S
35
. Hiện nay để giải
quyết vấn đề này người ta dùng
P
33
tuy giá thành cao nhưng cho kết
quả tốt hơn.
3, Thực hiện phản ứng giải

trình tự ADN:
Enzym thông dụng thường dùng
là sequenase (là một dạng của T7
DNA polymerase), enzym này có
ưu thế hơn hẳn so với Klenow được
dùng trước đây. Phản ứng được
thực hiện nhanh hơn và thu được
kết quả tối ưu nếu có mặt ion Mn
++
,
ion này giúp cho quá trình sao chép
có độ chính xác cao. Trước đây
dNTPs đánh dấu với P
32
được dùng
để đánh dấu sản phẩm. Tuy nhiên
ngày nay nhiều người đã chuyển
sang dùng S
35
thay thế cho P
32
, kết
quả là cho độ phân giải cao hơn.
Mới đây phương pháp giải trình
tự dựa trên kỹ thuật PCR được gọi
là chu kỳ giải trình tự trực tiếp
ADN đang thay thế phương pháp
cũ dùng enzym sequenase. Về
nguyên tắc thì các phương pháp
này là giống nhau. Ưu thế của

phương pháp này là: lượng ADN
đòi hỏi ít và không yêu cầu phải có
mức độ tinh sạch cao. Ngoài ra, có
một ưu điểm nữa là phản ứng xảy
ra ở nhiệt độ cao, do đó đã khắc
phục được những hạn chế của các
phương pháp khác khi giải trình tự
đối với các sợi khuôn có cấu trúc
bậc 2 (Fan & cộng sự, tạp
chí Biotechniques 21: 1132-1137).
4, Tách sản phẩm trên gel
urea-acrylamid:
Cho đến nay đã có nhiều tiến bộ
trong kỹ thuật điện di gel kể từ năm
1970 khi mà người ta phát hiện ra
phương pháp này. Tiến bộ quan
trọng nhất là gel gradient tạo ra độ
dãn cách thích hợp để đọc được
thêm từ 50-100 base. Đầu tiên,
gradient được tạo ra giữa acrylamid
và gradient muối khi đổ gel. Có thể
có cách khác nữa là người ta thay
đổi độ dày của gel bằng spacer.
Phương pháp dễ nhất là bổ sung
nồng độ muối NaOAc vào bể đệm
dưới khi chạy gel, kết quả sẽ tạo ra
một gradient cần thiết mà không
mấy khó khăn.
Có nhiều cách cải tiến khác
nhau để tạo ra gel có độ phân giải

cao, ví dụ tạo ra gradient đối với
acrylamid mạch thẳng hay bổ sung
một số chất tạo ra gradient (Long
Ranger). Mặt khác việc đổ gel cũng
được đơn giản hóa bước sử dụng
băng dán. Một số người dùng các
gel siêu mỏng để đạt độ phân giải
cao. Nhiều thiết bị được phát minh
nhằm thu nhận các băng đã được
tách riêng khi chúng ra khỏi gel, và
gần đây những thiết bị này đã được
thương mại hóa.
Nhuộm bạc là phương pháp
tương đối hiệu quả để xác định các
trình tự ADN, cách này hạn chế
được nhiều bước dùng trong các kỹ
thuật dựa vào ảnh bức xạ mà không
cần sử dụng chất phóng xạ.
5, Đọc trình tự gene:
Hiện nay kỹ thuật đọc phim tự
động đã thay thế công việc đọc
trình tự ADN buồn tẻ trước đây. Có
hàng loạt các thiết bị từ loại có thể
ghi lại trình tự dựa vào việc chọn
từng loại base đến những thiết bị có
thể thực hiện được toàn bộ quá
trình này một cách tự động.
Hy vọng rằng với những bàn
luận ngắn gọn này sẽ giúp bạn làm
quen dần với nhiều loại kỹ thuật

khác nhau. Ngày nay các thiết bị
giải trình tự tự động càng trở lên
thông dụng và việc sử dụng loại
thiết bị và hóa chất khác nhau rất
đa dạng. Việc chọn lựa thiết bị, hóa
chất và phương pháp thích hợp để
giải trình tự ADN nhanh, chính xác
và kinh tế là điều cần được quan
tâm đến.

Vietsciences- Dương Văn Hợp,
Nguyễn Lân Dũng