phân loại vi sinh vật bằng sinh học phân tử (tt) pot

2.3. Nhân gene và kỹ thuật giải
trình tự ADN.
Kỹ thuật lai ADN đã được sử
dụng rộng rãi cho các nghiên cứu
xác định typ của nhiều đối tượng vi
sinh vật. Nguồn ADN đích đôi khi
chỉ có số lượng ít trừ khi các tiến
hành nuôi cấy vi sinh vật. Trong
một số trường hợp việc nuôi cấy
không thể thực hiện được với nhiều
loài vi sinh vật hay virút hoặc trong
các trường hợp khác cần thời gian
dài nuôi cấy vi sinh vật để có đủ
ADN cho các kỹ thuật lai hay định
typ. Khó khăn này được khắc phục
bằng cách làm tăng nguồn ADN
đích một cách nhanh chóng bằng
kỹ thuật nhân gene PCR.
a. Kỹ thuật nhân gene
PCR (Polymerase Chain
Reaction)
Việc nhân ADN cho phép làm
tăng số lượng gấp hàng triệu hoặc
nhiều hơn nữa đối với đoạn ADN
hay ARN nghiên cứu. Có nhiều
phương pháp khác nhau để phân
tích nguồn ADN khuyếch đại theo

cách này. Phương pháp đơn giản
nhất là sử dụng điện di để xác định
kích thước sản phẩm của phản ứng
PCR. Có thể xác định độ nhạy và
tính đặc hiệu cao hơn nếu sản phẩm
PCR được lai với mẫu dò đặc hiệu
đã được đánh dấu. Phương pháp
đưa lại thông tin nhiều nhất là xác
định được trình tự ADN và ARN
của sản phẩm PCR. Việc xác định
được sai khác của chuỗi ADN sẽ
cho phép xác định và định typ
chính xác nhất các đối tượng vi
sinh vật nghiên cứu. Kết quả xác
định trình tự ADN còn cho phép
xác định mối liên hệ tiến hoá và
dịch tễ học của các chủng vi sinh
vật.
- Đôi nét về phản ứng chuỗi
PCR:
Phản ứng chuỗi PCR nhằm
khuyếch đại ADN lần đầu tiên
được Saki (1985) giới thiệu và đây
được coi là một trong những tiến
bộ khoa học quan trọng nhất về
sinh học trong thập kỷ 80. Phản
ứng PCR sử dụng enzym chịu nhiệt
tạo ra nhiều phiên bản theo hàm số
mũ. Có thể ví dụ, chỉ cần 1 sợi
ADN sau vài giờ có thể nhân lên

10
11
phiên bản ADN tương đương
với 100 ng ADN. Sau khi thực hiện
phản ứng PCR thì cần tiến hành
một số kỹ thuật để xác định sản
phẩm, đơn giản nhất là điện di và
xác định kích thước của sản phẩm
PCR. Trong các nghiên cứu chẩn
đoán thì kết quả này rất có ý nghĩa,
nó chứng tỏ sự có mặt của ADN
đích trong mẫu nghiên cứu. Có thể
nhận được tính đặc hiệu và độ nhạy
cao hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP
với sản phẩm PCR hoặc lai với
mẫu dò đặc hiệu. Tuy nhiên, thông
tin đầy đủ nhất vẫn là kết quả xác
định trình tự ADN của sản phẩm
PCR.
Ngay từ khi được giới thiệu
thì PCR đã được xem là phương
pháp đưa lại kết quả khá nhạy trong
việc xác định và phát hiện vi sinh
vật. Tính ưu việt của nó thể hiện ở
chỗ có thể chỉ cần một hạt virus
hay một tế bào vi khuẩn nào đó
cũng đủ cho phản ứng xảy ra và
khuyếch đại tới mức có thể phát
hiện được trong thời gian ngắn. Kỹ
thuật PCR còn được dùng để nhân

ADN từ khuôn RNA sau khi đã
được chuyển thành cDNA sau phản
ứng phiên mã ngược (RT). Phương
pháp này nhanh chóng được chú ý
và trở lên phổ biến cho các nghiên
cứu phát hiện vi khuẩn hay virus ở
nồng độ thấp trong các mẫu môi
trường và bệnh phẩm. Ví dụ việc
phát hiện mẫu máu nhiễm HIV có
nghĩa là phát hiện phần nhỏ ADN
của virus trong hệ gene người có
kích thước gấp 100 000 lần. Mặt
khác khi dùng kỹ thuật miễn dịch
với kháng thể thì phải cần tới 8
ngày mới có đáp ứng miễn dịch
trong máu, trong khi đó với kỹ
thuật PCR thì toàn bộ quy trình
phát hiện chỉ mất vài giờ (đối với
nguồn ADN hay RNA). Lợi thế của
kỹ thuật PCR được tận dụng cho
việc chuẩn bị ADN làm mẫu dò với
số lượng lớn cho các phép lai ADN
đã trình bày ở trên. Các mẫu dò có
thể được đánh dấu bằng phóng xạ
hay phi phóng xạ khi tiến hành
phản ứng khuyếch đại. Mẫu dò
đánh dấu với kỹ thuật PCR có ưu
thế hơn các phương pháp đánh dấu
truyền thống bằng kỹ thuật tổng
hợp các mạch đứt gãy (nick

translation) hay đánh dấu với mồi
ngẫu nhiên (rADN random primer
labeling). Các ưu thế này có thể kể
đến, cụ thể như là cần lượng nhỏ
sợi ADN khuôn, có thể tiến hành
đánh dấu với các mẫu dò có kích
thước ngắn, chuẩn bị mẫu dò không
cần tinh sạch ADN khuôn. Bảng
1.7. dưới đây liệt kê một số ví dụ
ứng dụng kỹ thuật PCR cho phát
hiện nhiều đối tượng vi sinh vật
khác nhau. Rất nhiều các kết quả
nghiên cứu như vậy được trình bày
trong các tạp chí chuyên ngành
như: ành như: ành như: ành
như: Journal of Clinical
Microbiology, Applied
Environmental Microbiology.
Bảng 1.7. Một số ví dụ về ứng dụng
kỹ thuật PCR trong xác định vi sinh
vât.


Vi sinh vật Tài liệu
Acanthamoeba sp
Bordetella pertussis
Borrelia burgdorferi
Brucella sp
Candida albicans
Carnobacterium spp

Vokin et al
(1992)
Houard et al
(1989)
Marconi
ADN Garon
(1992)
Chlamydia
trachomatis
Clostridium difficile
Coxiella burneti
Cryptosporidium
parvum

Cytomegalovirus
Dengue virus
Epstein-barr virus
Erwinia amylovora
Escherichia coli
Frankia spp
Gaeumannomyces spp

Herman an
Derider
(1992)
Miyakawa et
al (1992)
Brook et al
(1992)
Hayes et al

(1992)
Gumerlock
et al (1991)
Stein an
Raoult
(1992)
Laxer et al
Helicobacter pylori
Hepatitis C virus
Human
immunodeficiency
virus (HIV)
Influenza virus
Leptospira spp
Litsteria
monocytogenees
Luteovirus
Mycobacterium
leprae
Mycobacterium
tuberculosis
(1991)
Gozlan et al
(1991)
Henchal et al
(1991)
Samoszuk
(1991)
Bereswill
etal (1992)

Jackson
(1992)
Simonet et al
(1990)
Henson
(1992)
Neisseria meningitis
Papillomavirus
Parvovirus
Plsmodium
falciparum

Pneumocystis carini
Polio virus
Pseudomonas
solanacearum
Rickettsia spp
Rotavirus
Salmonella spp
Staphylococcus spp
Claton et al
(1992)
Okamoto et
al (1992)
Dawood et al
(1992)
Claas et al
(1992)
Merien et al
(1992)

Niederhauser
et al (1992)
Robertson et
al (1991)
Hackel et al
Toxoplasma gondii
Treponema pallidum
Trichomonas
vaginalis
Trypanosoma cruzi
Vibrio vulnificus
Yersinia

(1990)
Altamirano
et al (1992)
Maiden et
al(1992)
Charlotte et
al (1993)
McOmish et
al (1993)
Barker et al
(1992)
Olsson et al
(1993)
Yang et al
(1991)
Seal et al
(1992a)

Gage et al
(1992)
Taniguchi et
al (1992)
Rahn et al
(1992)
Murakami et
al (1991)
Vanevan et
al (1991)
Grimprel et
al (1991)
Riley et al
(1992)
Breniere et
al (1992)
Hill et al
(1991)
Nakajima et
al (1992)