phân loại vi sinh vật bắng sinh học phân tử potx

2.3. Nhân gene và kỹ thuật giải
trình tự ADN.
b. Giải trình tự ADN
Phương pháp chính xác và đưa
lại nhiều thông tin nhất cho định
danh và định typ vi sinh vật là xác
định chính xác trình tự chuỗi ADN
của một vùng quy định trên nhiễm
sắc thể. Phương pháp giải trình tự
ADN phát triển nhanh chóng, kết
quả so sánh sự tương đồng của
trình tự gene nghiên cứu trở thành
phương pháp phân loại chuẩn theo
sinh học phân tử trong nghiên cứu
hệ thống học và cây phả hệ di
truyền giữa các đối tượng nghiên
cứu. Các gene bảo thủ được giải
trình tự làm cơ sở để xác định vị trí
của sinh vật nghiên cứu, trong khi
đó các trình tự không tương đồng
(khác biệt) lại làm cơ sở cho sự biệt
hóa cũng như xác định mối quan hệ
giữa các cá thể gần với nhau.
+ Nguyên tắc:
Phương pháp giải trình tự ADN
theo nguyên tắc tạo ra các mảnh
ADN được đánh dấu tại đầu 5’

hoặc 3’. Các mảnh có các base
đánh đấu được tách ra trên gel
polyacrylamid Các mảnh được
phân biệt về vị trí trên gel với sự
sai khác chỉ với một nucleotid.
Việc đánh dấu và đọc kết quả theo
các kỹ thuật và phương pháp khác
nhau. Việc tạo ra các mảnh ADN
sai khác nhau về 1 nucleotid được
trình bày theo 2 phương pháp:
phương pháp hóa học (Maxam &
Gilbert, 1997) và phương pháp
enzym kết thúc phản ứng chuỗi
(Sanger, 1997). Ngày nay phương
pháp enzym được dùng phổ biến
hơn cả.
+ Phương pháp enzym kết
thúc phản ứng chuỗi của Sanger:
Phương pháp kết thúc phản ứng
chuỗi được thực hiện dựa trên việc
nhân ADN từ sợi khuôn khi có
đoạn ADN mồi với xúc tác của
Klenow hay T7-ADN polymerase
và 4 loại deoxyribonucleotid
(dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng
được tiến hành đồng thời và trong
mỗi phản ứng thì có một loại dNTP
bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm
dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả
là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu

cho mỗi một base xác định xảy ra
một cách ngẫu nhiên trong mỗi
phản ứng. Trình tự của ADN được
xác định trên gel. Đầu tiên phương
pháp này được xây dựng cho xác
định trình tự sợi ADN đơn tạo ra
bằng cách tách dòng ADN vào
vectơ thực khuẩn thể M13 (Sanger
và cộng sự, 1978). Sau đó phương
pháp xác định trình tự sợi đôi ADN
đã được Chen, William (1986) mô
tả khi tách dòng ADN vào plasmid.
Ngày nay người ta lựa chọn
phương pháp Sanger để giải trình
tự ADN cho nghiên cứu phân loại
và xác định typ vi sinh vật thay cho
phương pháp hóa học.
Một số lợi thế của phương pháp
này ở chỗ: Phương pháp này đơn
giản và không tốn nhiều thời gian
như phương pháp hóa học. Khi
nghiên cứu phân loại và xác định
typ thì các gene nghiên cứu có độ
bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể
dùng chung mồi cho nhiều đối
tượng khác nhau. Một trong hạn
chế của phương pháp này ở chỗ các
đoạn ADN cần được tách dòng
trước khi tiến hành giải trình tự
ADN. Tuy nhiên cho đến nay

người ta đã cải tiến phương pháp
này để có thể giải trình tự trực tiếp
sản phẩm PCR.
+ Giới thiệu kỹ thuật giải
trình tự ADN theo Sanger:
Có hai phương pháp: Phương
pháp giải trình tự truyền thống đọc
kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng
phóng xạ là chủ yếu) và phương
pháp giải trình tự và đọc kết quả tự
động (đánh dấu bằng hóa chất
huỳnh quang).
- Phương pháp truyền
thống:
Các bước chính cho giải trình tự
ADN như sau:
Chuẩn bị ADN khuôn
Bắt cặp ADN khuôn và
mồi
Tiến hành phản ứng giải
trình tự ADN
Tách sản phẩm trên gel
polyacrylamid biến tính với
urea.
Đọc kết quả.
Tuy nhiên cần chú ý một số
điểm sau:
1. Chuẩn bị ADN khuôn.
2. Điều kiện bắt cặp mồi.
3. Thực hiện phản ứng giải

trình tự ADN.
4. Tách sản phẩm trên
acrylamid gel.
5. Đọc kết quả.

Vietsciences- Dương Văn Hợp,
Nguyễn Lân Dũng