Sàng lọc vi khuẩn sinh Beta Lactamase phổ rộng phân lập tại Bệnh viện đa khoa trung ương Thái Nguyên bằng kỹ thuật Multiplex PCR

Số hóa bởi trung tâm học liệu
i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC


NGUYỄN THỊ KHÁNH LY


SÀNG LỌC VI KHUẨN SINH BETA – LACTAMASE
PHỔ RỘNG PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN ĐA KHOA
TRUNG ƢƠNG THÁI NGUYÊN BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX – PCR


Chuyên ngành: Công nghệ sinh
Mã số : 60 42 0201


LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Đắc Trung



Thái Nguyên, năm 2013



Số hóa bởi trung tâm học liệu

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới Tiến sĩ
Nguyễn Đắc Trung – Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y – Dược Thái Nguyên,
đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn này.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các bác sĩ, kỹ thuật viên khoa Vi sinh –
Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên, tới các cán bộ nhân viên của Bộ
môn Vi sinh – Đại học Y – Dược Thái Nguyên đã hết sức tạo điều kiện giúp đỡ,
cho tôi trong quá trình làm luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô
giáo, cán bộ giảng dạy của Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên
đã tận tình giảng dạy trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới khoa Xét nghiệm – Bệnh viện Lao và Bệnh phổi
Thái Nguyên, nơi tôi đang công tác đã tạo điều kiện về thời gian cho tôi trong
suốt quá trình nghiên cứu.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2013

Số hóa bởi trung tâm học liệu
ii
DANH MỤC BẢNG
BẢNG
TÊN BẢNG BIỂU
Trang
2.1
Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
21
2.2
Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm

22
2.3
Các giai đoạn trong quá trình nghiên cứu
28
2.4
Trình tự các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại gen
29
2.5
Thành phần các phản ứng PCR đơn mồi
30
2.6
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene bla
TEM

30
2.7
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene bla
CTX-M

31
2.8
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi gene bla
SHV

31
2.9
Thành phần phản ứng multiplex - PCR
32
2.10
Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex - PCR

33
3.1
Cơ cấu các loại vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân lập được
34
3.2
Tỷ lệ đề kháng kháng kháng sinh của E. coli (43 chủng)
35
3.3
Tỷ lệ đề kháng kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae
37
3.4
Kiểu cách kháng kháng sinh của E. coli và K. pneumoniae
39
3.5
Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL
41
3.6
Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E. coli ESBL
42
3.7
Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae
ESBL(+)
43
3.8
Kiểu gene ESBL bla được tìm thấy ở các chủng vi khuẩn
52

Số hóa bởi trung tâm học liệu
iii

DANH MỤC HÌNH

HÌNH
TÊN HÌNH ẢNH
Trang
1.1
Phương pháp đĩa đôi xác định vi khuẩn sinh ESBL
17
1.2
E-test xác định vi khuẩn sinh ESBL
18
2
Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu
27
3.1
Tỷ lệ kháng kháng sinh của E. coli
36
3.2
Tỷ lệ kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae
37
3.3
Kiểu cách kháng kháng sinh của E. coli và K. Pneumoniae
39
3.4
Kết quả Double-disk test ở chủng vi khuẩn ESBL(+)

41
3.5
Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng E. coli ESBL(+)
42
3.6
Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng K. pneumoniae
ESBL(+)
44
3.7
Kết quả khuếch đại gene bla
TEM
bằng PCR đơn gene
46
3.8
Kết quả khuếch đại gene bla
CTX-M
bằng PCR đơn gene
47
3.9
Kết quả khuếch đại gene bla
SHV
bằng PCR đơn gene
49
3.10
Kết quả khuếch đại gene bla
TEM
và bla
CTX-M
bằng multiplex-
PCR

51







Số hóa bởi trung tâm học liệu
iv

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề 1
2. Mục tiêu nghiên cứu 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Kháng sinh và cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn 3
1.1.1. Định nghĩa 3
1.1.2. Phân loại phổ tác dụng và chống chỉ định của thuốc kháng sinh 3
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 6
1.1.4. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn 7
1.2. Enzyme β – lactamase hoạt phổ rộng 9
1.2.1. Lịch sử phát hiện enzyme β- lactamase hoạt phổ rộng 9
1.2.2. Định nghĩa ESBL 10
1.3. Tình hình nghiên cứu khả năng sinh ESBL ở vi khuẩn gây bệnh 10
1.3.1. Trên thế giới 10
1.3.2. Tại Việt Nam 12
1.4. Các gen mã hóa ESBL 13

1.4.1. TEM 13
1.4.2. SHV 13
1.4.3. CTX – M 14
1.4.4. OXA 15
1.5. Một số phương pháp phát hiện vi khuẩn sinh ESBL 16
1.5.1. Phương pháp đĩa đôi 17

Số hóa bởi trung tâm học liệu
v
1.5.2. Phương pháp đĩa kết hợp (Double disk test) 17
1.5.3. Phương pháp E-test 18

1.5.4. Vitek ESBL card 18
1.5.5. Hệ thống tự động BD Phoenix (Becton Dickinson Biosciences) 18
1.5.6. Các phương pháp sinh học phân tử 19
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu 21
2.1.1. Các chủng vi khuẩn 21
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 21
2.1.3. Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 23
2.1.4. Vật liệu và môi trường xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với 23
2.2. Địa điểm nghiên cứu 23
2.3. Phương pháp nghiên cứu 23
2.3.1. Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Gram âm 23
2.3.2. Kỹ thuật xác định độ nhạy cảm với kháng sinh 24
2.3.3. Kỹ thuật xác định vi khuẩn sinh ESBL 25
2.3.4. Sàng lọc vi khuẩn Gram âm sinh ESBL bằng kỹ thuật multiplex-PCR 26
2.4. Xử lý số liệu 33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỷ lệ và kiểu cách kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm gây bệnh phân

lập được 34
3.2. Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL………… ……………….………… 40
3.3. Tỷ lệ và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm (E. coli và
Klebsiella pneumoniae) sinh ESBL phân lập được 42
3.3. Khuếch đại gene ESBL ở E. coli và Klebsiella pneumoniae 45
3.3.1. Kết quả khuếch đại gene ESBL bằng kỹ thuật PCR 45
3.3.1.1. Gene bla
TEM
46


Số hóa bởi trung tâm học liệu
vi
3.3.1.2. Gene bla
CTX-M
47
3.3.1.3. Gene bla
SHV
48

3.3.2. Kết quả khuếch đại gene ESBL bằng kỹ thuật multiplex – PCR 50
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
KẾT LUẬN 54
KHUYẾN NGHỊ 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO 56
PHỤ LỤC

Số hóa bởi trung tâm học liệu
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AMC
Amoxycillin/ Acid clavuanate
DNA
Deoxyribonucleic Acid
RNA
Ribonucleic Acid
FEP
Cefepime
CTX
Cefotaxime
CAZ
Ceftazidime
CRO
Ceftriaxone
CXM
Cefuroxime
CIP

Ciprofloxacin
dNPTs
Deoxyribonucleotide Triphosphate
DO
Doxycyline
E. coli
Escherichia coli
ESBL
Extended-spectrum beta lactamase
K. pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
MEM
Meropenem
MPA
Meat – Peptone – Agar
OFX
Ofloxacin
PABA
Para - aminobenzoic acid
PCR
Polymerase Chain Reaction
TAE
Tris – Acetate - EDTA
Bp
Base pairs
Taq – DNA polymerase
Themus aquaticus DNA polymerase
W/v
Weight/volume
Bla β- lactamase

Số hóa bởi trung tâm học liệu
1
MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc phát minh ra kháng sinh năm 1928 đã làm tăng hiệu quả xử lý các ổ
nhiễm trùng. Nhờ đó nhiều căn bệnh được giải quyết dựa vào việc điều trị bằng
những phác đồ kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong
nhiều thập kỷ qua dẫn đến xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh.
Nhiều bệnh dịch nhiễm trùng kháng thuốc đang nổi lên và kháng sinh dần mất
hiệu lực trong điều trị. Đây là mối lo chung của ngành y tế và của toàn xã hội.
Việc giới thiệu các kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba vào thực hành
điều trị lâm sàng các nhiễm khuẩn trong đầu những năm 1980 đã được dự báo
như là một bước đột phá trong cuộc chiến chống lại các vi khuẩn gây bệnh sinh
β-lactamase. ESBL là các β-lactamase có khả năng tác động lên các phân tử
penicillin và các cephalosporin thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và các aztreonam (trừ
kháng sinh cefamycin và carbapenem) do chúng có khả năng ly giải các kháng
sinh này nhưng chúng lại bị ức chế bởi các các chất ức chế β-lactamase như acid
clavulanic [1, 18]. Nhiều gene mã hóa ESBL nằm trên các phân tử plasmid lớn.
Các plasmid đã kháng thuốc này đều được tìm thấy ở các vi khuẩn họ
Entobacteriaceae, trong đó hay gặp nhất là E. coli và Klebsiella spp. [2, 3, 4, 17,
20, 21, 23]. Nhiễm trùng do các chủng vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng dẫn
đến sự gia tăng tỷ lệ thất bại trong điều trị bằng kháng sinh, trong đó làm tăng
cao tỷ lệ tử vong đặc biệt ở những trường hợp nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn
sinh ESBL. Khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL cũng đồng nghĩa với việc chúng
kháng lại rất nhiều loại kháng sinh, đặc biệt là các kháng sinh nhóm
cephalosporin. Bệnh viện Đa khoa Trung ương Thái Nguyên là bệnh viện hạng I
trực thuộc Bộ Y tế, được thành lập từ năm 1951, có nhiệm vụ khám chữa bệnh
cho nhân dân các dân tộc miền núi vùng Đông bắc Việt Nam. Bệnh viện đóng

trên địa bàn trung tâm của tỉnh Thái Nguyên có trách nhiệm phục vụ trực tiếp

Số hóa bởi trung tâm học liệu
2
cho người dân của tỉnh. Lưu lượng bệnh nhân đến khám và điều trị tại bệnh viện
ngày một tăng. Nhiều nghiên cứu về cơ cấu vi khuẩn và mức độ kháng kháng
sinh của các vi khuẩn phân lập tại bệnh viện cũng đã được thực hiện và công bố
trên các tạp chí trong nước. Tuy nhiên, vẫn chưa có một nghiên cứu nào điều tra
về vi khuẩn sinh β-lactamase phổ rộng được thực hiện tại bệnh viện. Đó là lý do
chúng tôi chọn tên đề tài “ Sàng lọc vi khuẩn sinh beta – lactamase phổ rộng
phân lập tại bệnh viện Đa khoa trung ƣơng Thái Nguyên bằng kỹ thuật
multiplex - PCR”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định tỷ lệ và kiểu cách kháng kháng sinh của một số vi khuẩn Gram âm
gây bệnh phân lập tại BVĐKTƯ Thái Nguyên.
Xác định tỷ lệ và mức độ kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm sinh
ESBL phân lập tại BVĐKTƯ Thái Nguyên.
Phát hiện một số gene ESBL ở các chủng vi khuẩn phân lập bằng kỹ thuật
multiplex - PCR.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Thu thập bệnh phẩm từ các mẫu bệnh hô hấp, sinh dục và các bệnh phẩm
khác.
Nuôi cấy, phân lập và xác định vi khuẩn.
Thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của
vi khuẩn.
Sàng lọc chủng vi khuẩn sinh ESBL bằng kỹ thuật khoanh giấy đôi (double -
dist test).
Sử dụng kỹ thuật muitiplex PCR để phát hiện gene sinh ESBL (SHV, CTX
và TEM)

Số hóa bởi trung tâm học liệu
3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. KHÁNG SINH VÀ CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN
1.1.1. Định nghĩa
Kháng sinh là chất được chiết xuất từ vi sinh vật hoặc được tổng hợp hóa
học, với liều rất nhỏ có tác dụng ức chế hoặc giết chết vi sinh vật, có thể dùng
tại chỗ hoặc toàn thân, ít độc hoặc không độc cho cơ thể.
1.1.2. Phân loại
Có nhiều cách phân loại kháng sinh: phân loại theo nguồn gốc, phân loại
theo phổ tác dụng hoặc phân loại theo cấu trúc hóa học. Trong đó phân loại theo
cấu trúc hóa học được coi là khoa học nhất vì nó cho phép lựa chọn kháng sinh
cùng nhóm thay thế hoặc phối hợp kháng sinh sao cho hiệu quả và hợp lý [3].
Theo đó kháng sinh được phân vào 8 nhóm chính như sau:
* Nhóm β-lactamin
Nhóm này có tính độc thấp và phổ tác dụng rộng, gồm 2 phân nhóm là phân
nhóm penicillin và phân nhóm cephalosporin.
- Phân nhóm Penicillin
+ Benzyl penicillin: Bao gồm các penicillin G, benzathine benicillin… chủ
yếu tác dụng với các vi khuẩn Gram dương.
+ Penicillin V: có tác dụng giống penicillin G nhưng yếu hơn, không bị phá
hủy dưới tác dụng của dịch vị nên có thể dùng bằng đường uống.
+ Penicillin A: Bao gồm các ampicillin, amoxycillin…tác dụng lên các vi
khuẩn Gram dương và 1 số vi khuẩn Gram âm.
+ Penicillin M (tổng hợp): Bao gồm các methycillin, oxacillin, nafcillin,…
có phổ hẹp tác dụng lên các tụ cầu, đặc biệt với các tụ cầu kháng với penicillin
G và V.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
4

+ Monobactam: Bao gồm các aztreonam… tác dụng mạnh lên các vi khuẩn
Gram âm.
+ Carbapenem: đại diện là imipenem có tác dụng lên nhiều loại vi khuẩn đặc
biệt là các vi khuẩn Gram âm.
+ Acid Clavulanic, sulbactam: các chất này có khả năng ức chế enzyme của
vi khuẩn dùng kết hợp làm tăng hiệu lực của kháng sinh.
+ Carboxypenicillin: Bao gồm các carbenicillin, ticarcillin.
+ Ureidopenicillin: Bao gồm các mezlocillin, piperracillin… có hiệu lực diệt
khuẩn lên vi khuẩn mủ xanh và một số vi khuẩn Gram âm.
- Phân nhóm Cephalosporin
+ Thế hệ 1: Bao gồm các cephalothin, cephalexin…tác dụng diệt khuẩn lên
các vi khuẩn Gram dương và một số ít vi khuẩn Gram âm.
+ Thế hệ 2: Bao gồm các cefuroxim, cefoxitin…tác dụng cân bằng lên cả 2
loại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm.
+ Thế hệ 3: Bao gồm các cefotaxime, ceftriaxone, ceftazidime… phổ tác
dụng mở rộng, nhưng có tác dụng với Gram âm nhiều hơn.
+ Thế hệ 4: Bao gồm các cefepim, cefpirom, phổ tác dụng giống như thế hệ
3 nhưng thời gian xuyên thấm qua vách tế bào nhanh hơn.
* Nhóm Aminosid
- Những loại kháng sinh ban đầu là streptomycin, neomycin.
- Thế hệ mới hơn là gentamycin, amikacin, netilmicin
Hai nhóm này có tác dụng diệt khuẩn mạnh. Tuy nhiên, dùng loại kháng
sinh này liều cao và kéo dài dễ gây ảnh hưởng tới thận, thính giác, tiền đình.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
5
* Nhóm Phenicol
Gồm có chloramphenicol và thiamphenicol, tác dụng ức chế lên các vi
khuẩn Gram âm. Lưu ý nhóm này nếu dùng liều cao, dài ngày có thể gây suy tủy
và thiếu máu không hồi phục, không dùng cho trẻ dưới 3 tuổi, phụ nữ có thai,

cho con bú .
* Nhóm Lincosamid
Gồm có lincomycin, clindamycin, tác dụng chủ yếu lên các vi khuẩn Gram
dương. Dùng kéo dài có thể gây viêm đại tràng chảy máu có màng giả.
* Nhóm Macrolide
Những kháng sinh ban đầu là erythromycin, thế hệ sao có phổ rộng hơn.
Các kháng sinh như: roxithromycin, clarithromycin, đặc biệt có azithromycin tác
dụng mạnh, khả năng thấm và tạo nồng độ kháng sinh cao có tác dụng tốt trên
các loại vi khuẩn như: chlamydia, mycoplasma…
* Nhóm Cycline
Thế hệ đầu là tetracycline, thế hệ sau là doxycicline, minocyline có tác dụng
ức chế nên nhiều loại vi khuẩn khác nhau. Nhóm này khi sử dụng dễ gây tổn
thương men răng, tổn thương tới chức năng gan và màng xương.
* Nhóm kháng sinh chống nấm
Kháng sinh đầu tiên tìm ra là nystatin có tác dụng chống nấm tại chỗ và
không ngấm qua niêm mạc ruột. Các kháng sinh mới là ketoconazole,
fluconazole…có phổ rộng, hấp thu tốt , có thể dùng tại chỗ hoặc toàn thân.
* Các nhóm khác
- Các quinolon: Thế hệ I là các nalidixic acid… có tác dụng hạn chế, độc
tính cao. Thế hệ II như ciprofloxacin, ofloxacin… tác dụng trên nhiều loại vi
khuẩn. Các quinolon thế hệ mới nhất mở rộng phổ kháng khuẩn.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
6
- Các Nitroimidazol: metronidazol, tinidazol, secnidazol…Phổ tác dụng
khá rộng. Độc tính gây ra là buồn nôn, hạ huyết áp, gây viêm thần kinh.
- Các Sulfamid: Phổ kháng khuẩn của sulfamid rộng nhưng tỷ lệ kháng
thuốc và kháng chéo giữa các loại sulfamid khá cao nên thường ít sử dụng.
- Các Glycopeptide: Gồm các loại như vancomycin, teicoplanin… có hiệu
lực diệt khuẩn mạnh lên các cầu khuẩn Gram dương. Vancomycin được coi như

là kháng sinh dự trữ điều trị tụ cầu kháng thuốc [1].
- Các polypeptide :Đại diện là polymycin có hiệu lực diệt khuẩn trên nhiều
loại vi khuẩn nhưng độc tính cao nên hiện nay ít dùng.
1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh
Kháng sinh có thể tác dụng lên vi khuẩn bằng nhiều cơ chế hoặc bằng một
trong các cơ chế dưới đây:
a. Ức chế tổng hợp vách tế bào
Vách tế bào ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương đều được cấu tạo bởi
các phức hợp Peptidoglycan. Các phức hợp Peptidoglycan được trùng hợp bởi
các enzyme transpeptidase. Các kháng sinh thuộc nhóm β - lactamin gắn chọn
lọc vào các transpeptidase này làm cho vách tế bào của vi khuẩn không được
tổng hợp hoặc bị tan rã. Khi vách tế bào bị tổn thương và mất đi sẽ làm cho tế
bào chết. Nhóm kháng sinh tác động theo cơ chế này có hiệu quả mạnh. Các
kháng sinh thuộc nhóm này như: penicillin, bacitracin, vancomycin [1]…
b. Ức chế chức năng của màng tế bào
Các kháng sinh loại này sẽ gắn lên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm chọn
lọc của màng bào tương, làm mất chức năng của màng, thất thoát nội chất. Tế
bào vi khuẩn khi mất đi các chất cần thiết sẽ bị chết. Các kháng sinh thuộc nhóm
này gồm polymycin, gentamycin, amphotericin…

Số hóa bởi trung tâm học liệu
7
c. Ức chế tổng hợp protein
Thuộc cơ chế này lại được chia làm hai loại chính: làm ngừng quá trình tổng
hợp protein hoặc tạo nên những loại protein bất thường, vô dụng.
* Làm ngừng quá trình tổng hợp protein: Các kháng sinh thuộc loại này
gắn vào tiểu phần 50S của Ribosom vi khuẩn, ngăn cản giải phóng các acid
amin ra khỏi tARN, làm ngừng quá trình tổng hợp protein. Kháng sinh có cơ chế
này thuộc nhóm phenicol như chloramphenicol…
* Tổng hợp nên các protein bất thường: Các kháng sinh này gắn vào các

tiểu phần 30S của Ribosom vi khuẩn dẫn đến rối loạn sự đọc mã mRNA, do đó
gắn sai vị trí axit amin tạo nên protein bất thường. Các kháng sinh thuộc nhóm
này như streptomycin, tetracycline…
d. Ức chế tổng hợp acid nucleic
Nhóm Rifamycin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao
mã tạo mRNA. Kháng sinh thuộc nhóm này như rifampicin…Nhóm quinolon ức
chế tác dụng của enzyme DNA gyrase làm quá trình tổng hợp DNA bị ngừng.
Kháng sinh thuộc nhóm này như ciprofloxacin, ofloxacin…Nhóm sulfamide có
tác dụng cạnh tranh đối kháng. Các sulfamide có cấu trúc hóa học tương tự
PABA- Para - aminobenzoic acid nên cạnh tranh thay thế PABA dẫn đến ngừng
tổng hợp Acid nucleic của vi khuẩn. Nhóm trimethoprim tác động vào các
enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân Purin làm ức chế quá tình tạo Acid
nucleic. Các kháng sinh có cơ chế tác động này như: proloprim, monotrim và
triprim.
1.1.4. Cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn
Nhân tố kháng thuốc, được gọi là nhân tố R, sẽ tạo cho vi khuẩn kháng lại
các kháng sinh bằng các cách sau:

Số hóa bởi trung tâm học liệu
8
a. Tạo ra các enzyme làm biến đổi hoặc phá hủy phân tử kháng sinh
Một số vi khuẩn sản xuất ra β-lactamase, enzyme này sẽ mở vòng β- lactam
làm mất hoạt tính của các kháng sinh thuộc nhóm β-lactamin.
Ngoài khả năng sinh β- lactamase thì một số vi khuẩn Gram âm có thể sản
xuất được các enzyme khác như adenylate cyclase, phosphorylase… phá hủy
các aminoglycoside hoặc chloramphenicol acetyltranferase kháng lại các kháng
sinh thuộc nhóm chloramphenicol.
b. Làm giảm tính thấm của màng tế bào
Theo cơ chế này vi khuẩn có thể làm giảm nồng độ kháng sinh bên trong tế
bào bằng các con đường sau:

- Làm giảm tính thấm của màng tế bào với các chất kháng sinh này, bảo vệ
tế bào vi khuẩn tránh khỏi sự tác động xấu bởi chất kháng sinh.
- Nhờ hệ thống bơm chủ động: các chất kháng sinh trong tế bào bị giảm
nồng độ do bị tế bào đưa ngược ra ngoài môi trường. Ví dụ sự đề kháng của vi
khuẩn với kháng sinh thuộc nhóm tetracycline, quinolon…
- Làm mất hệ thống vận chuyển qua màng do đó làm cho kháng sinh không
xâm nhập được vào tế bào vi khuẩn như các kháng sinh thuộc nhóm oxacillin.
c. Làm thay đổi vị trí tác động của kháng sinh làm kháng sinh không
gắn đƣợc vào đích
Là hiện tượng vi khuẩn thay đổi cấu trúc của một thành phần nào đó làm
cho các kháng sinh mất tác dụng. Các vi khuẩn làm mất hay thay đổi protein đặc
hiệu trên phần 30S hoặc thay đổi các thụ thể trên phần 50S của Ribosom làm
thay đổi vị trí bám của kháng sinh loại erythromycin.

Số hóa bởi trung tâm học liệu
9
d. Vi khuẩn thay đổi con đƣờng chuyển hóa làm cho thuốc kháng sinh
không tác động đƣợc vào quá trình chuyển hóa của vi khuẩn:
Một số vi khuẩn kháng với các sulfonamid không cần sử dụng tới para-
aminobenzoic acid (PABA) mà chúng sử dụng luôn acid folic có sẵn trong môi
trường, do vậy các kháng sinh thuộc nhóm này bị vô hiệu lực.
e. Vi khuẩn tăng tổng hợp enzyme chuyển hóa để bù vào lƣợng enzyme
đã bị kháng sinh tác động:
Đây là trường hợp vi khuẩn tăng tổng hợp các transferase để bù cho lượng
enzyme này đã bị kháng sinh ức chế. Tuy nhiên đây chỉ là phản ứng ban đầu của
vi khuẩn, sau đó những chủng nào kháng thật sự sẽ chuyển sang những hình
thức kháng kể trên.
* Vi khuẩn đa đề kháng: hầu như chưa có định nghĩa rõ ràng nào về vi
khuẩn đa đề kháng tuy nhiên phần lớn xác định vi khuẩn đa đề kháng là loại vi
khuẩn kháng với ba hay nhiều hơn ba loại kháng sinh [20].

Phương pháp chủ yếu để xác định vi khuẩn có đa đề kháng hay không là căn
cứ vào kết quả thử nghiệm tính nhạy cảm của vi khuẩn đó với các loại kháng
sinh thử nghiệm trong phòng thí nghiệm. Vi khuẩn xếp vào loại đa đề kháng nếu
như kết quả thử nghiệm cho thấy nó kháng ba hay trên ba loại kháng sinh trở
lên.
1.2. ENZYME β – LACTAMASE HOẠT PHỔ RỘNG
1.2.1. Lịch sử phát hiện enzyme β- lactamase hoạt phổ rộng
Năm 1963 người ta đã phân lập được enzyme này từ một chủng E. coli
kháng với ampicillin từ máu của môt bệnh nhân có tên là Temoniera. Chủng E.
coli này kháng với kháng sinh do có sinh β- lactamase. Sau đó enzyme này được
đặt tên là TEM-1 theo tên bệnh nhân. Enzyme này thường gặp hơn ở các vi

Số hóa bởi trung tâm học liệu
10
khuẩn Gram âm. Có tới trên 90% các chủng E. coli kháng kháng sinh Ampicillin
là do sinh loại enzyme này [21].
Năm 1974, phát hiện ra một β- lactamase loại khác ở K. pneumonia và E.
coli đặt tên là SHV-1, có nguồn gốc từ TEM-1 do 1 axit amin bị thay thế. Các
enzyme này kháng cao với các kháng sinh penicillin và cephalosporin thế hệ
1[21].
Năm 1983 tại Đức người ta phát hiện ra thêm một loại enzyme khác là kết
quả của sự đột biến các axit amin ở các vị trí khác nhau từ các loại cũ do vậy
chúng tăng phổ tác dụng của enzyme. Chúng không phân hủy cephamycin và
carbapenem nhưng bị ức chế bởi acid clavulanic.
Đặc biệt các chủng sinh ESBL thường là các chủng đa đề kháng do gen mã
hóa các ESBL thì cũng có những gen kháng các loại kháng sinh khác như
tetracycline, aminoside,… do vậy việc điều trị càng thêm khó khăn. Hiện nay
loại kháng sinh chủ yếu dùng để điều trị là nhóm carbapernem.
1.2.2. Định nghĩa ESBL
ESBL là các β - lactamase có khả năng kháng với các penicillin các

cephalosporin thế hệ 1, thế hệ 2, thế hệ 3 và các aztreonam (trừ các Cefamycin
và carbapenem) do chúng có khả năng ly giải các kháng sinh này nhưng chúng
lại bị ức chế bởi các các chất ức chế β - lactamase như acid clavulanic.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ESBL Ở VI KHUẨN
GÂY BỆNH
1.3.1. Trên thế giới
Tổng số ESBL đã được nghiên cứu và mô tả là trên 400 loại khác nhau,
những ESBL này đã được liệt kê chỉ tiết trên website về đặt tên ESBL của
George Jacoby và Karen Bush ( Cho
đến nay những nghiên cứu đã công bố về ESBL có nguồn gốc từ hơn 30 quốc

Số hóa bởi trung tâm học liệu
11
gia khác nhau cho thấy sự phân bố rộng rãi của các vi khuẩn sinh ESBL. Các
loại ESBL bao gồm các nhóm: SHV, TEM, CTX-M và Toho β-lactamases,
OXA, PER, VEB-1, BES-1 và các ESBL khác. Nhiều gene mã hóa ESBL nằm
trên các phân tử plasmid lớn. Các plasmid đã kháng thuốc này đều được tìm
thấy ở các vi khuẩn họ Entobacteriaceae, trong đó hay gặp nhất là E. coli và
Klebsiella spp [18, 19, 21, 23, 27, 28, 33].
Để xác định sự tồn tại và mô tả đặc điểm của các β - lactamase ở các vi
khuẩn Gram âm phân lập tại một Bệnh viện nhi đồng ở Ai Cập, Maysaa đã thu
thập các mẫu máu từ những bệnh nhi nghi ngờ bị nhiễm khuẩn bệnh viện từ
tháng 1/2005 - tháng 12/2006. Trong số 1.600 bệnh nhi nghi ngờ nhiễm khuẩn
huyết có 816 trường hợp (45%) nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gram âm; phổ
biến nhất là Klebsiella (38,2%), tiếp theo là Enterobacter (32,4%), Serratia
(16,2%) và Burkholderia cepacia (10,3%); Tỷ lệ vi khuẩn đề kháng cao nhất là
với cefazolin và ampicillin/sulbactam (75,5%), kháng với cefuroxime là 70,3%
và với cetriaxone là 63,5%. ESBL được tìm thấy ở 44,5% các chủng kháng
cefotaxime và 50% với các chủng kháng ceftazidime bằng phương pháp khoanh
giấy đôi [19]. Trong một nghiên cứu được tiến hành năm 2004, các chủng vi

khuẩn đề kháng với cefotaxime được phân lập từ những bệnh nhân bị nhiễm
khuẩn tiết niệu tại bệnh viện trường cao đẳng y tế Indira Gandhi, Nagpur, Ấn
Độ, đã được kiểm tra khả năng sinh ESBL bằng phương pháp khoanh giấy đôi
cộng hưởng. Kết quả cho thấy trong số 87 chủng vi khuẩn Gram âm kháng
Cefotaxime có 42 chủng (48,3%) sinh ESBL đó là E. coli, K. pneumonia và
Acinetobacter. Sự đa đề kháng được tìm thấy phổ biến ở các vi khuẩn sinh
ESBL (90,5%) cao hơn hẳn các vi khuẩn không sinh ESBL (68,9%), sự khác
biệt này có ý nghĩa thống kê với p<0,05 [31].
Để xác định tần số các chủng E. coli và K. pneumonia sinh ESBL được phân
lập từ nước tiểu của những bệnh nhân nhiễm khuẩn tiết niệu tại một bệnh viên
công ở nam Tehran ( Iran), Zohreh đã kiểm tra độ nhạy cảm với kháng sinh và

Số hóa bởi trung tâm học liệu
12
khả năng sinh ESBL của 124 chủng E. coli và 40 chủng K. pneumonia. Sự đề
kháng có sinh ESBL đã được phát hiện ở 52,5% chủng K. pneumonia và 45,2%
chủng E. coli. Kiểu cách đa đề kháng kháng sinh ESBL được tìm thấy ở 30%
chủng K. pneumonia và 25,8% chủng E. coli [29] .
Ba mươi chín chủng vi khuẩn Gram âm được phân lập từ 39 bệnh nhân nghi
ngờ nhiễm khuẩn bệnh viện của một bệnh viện cấp 3 Tazania đã được Faustine
và cộng sự xác định sự nhạy cảm kháng sinh và khả năng sinh ESBL. Trong số
các chủng vi khuẩn được phân lập, gồm E. coli, Enterobacter spp, Pseudomonas
spp, Proteus spp, K. pneumonia, C. freundii và Chryseomonas luteola thì 28,2%
các chủng này sinh ESBL. Các gen ESBL đã được mô tả là SHV-28 và CTX-M-
15. Các chủng vi khuẩn sinh ESBL kháng với gentamicin và ciprofloxacin cao
hơn các chủng không sinh ESBL [25].
Các loài vi khuẩn sinh ESBL cũng được tìm thấy tại các nước khu vực châu
Á - Thái Bình Dương. Một số nghiên cứu đã cho thấy mức độ kiểu hình cao của
ESBL, đặc biệt là ở Klebsiella, đáng chú ý nhất là ở Trung Quốc, Hàn Quốc,
Nhật Bản và Ấn Độ [26]. Trong một nghiên cứu của Stephen và cộng sự về khả

năng sinh ESBL ở vi khuẩn E. coli và Klebsiella spp., trong tổng số 3.004 chủng
vi khuẩn Gram âm phân lập từ các nhiễm khuẩn bụng tại khu vực châu Á - Thái
Bình Dương (2007); 42,2% chủng E. coli và 35,8% chủng Klebsiella sinh
ESBL. Tại Ấn Độ, tỷ lệ sinh ESBL lần lượt là 79%, 69,4% và 100% với E. coli,
K. pneumonia và K. oxytoca. Trong khi đó 55% chủng E. coli ở Trung Quốc và
50,8% vi khuẩn này ở Thái Lan sinh ESBL. Kết quả cũng cho thấy Imipenem là
loại kháng sinh hiệu quả nhất có khả năng ức chế trên 90% các chủng vi khuẩn
kể cả các vi khuẩn sinh ESBL [32].
1.3.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, một số nghiên cứu về vi khuẩn sinh ESBL cũng đã thực hiện.
Trong 350 chủng vi khuẩn được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng tại 1

Số hóa bởi trung tâm học liệu
13
bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh, kết quả cho thấy: 36,7% các vi khuẩn
Gram âm kháng với cephalosporin thế hế thứ 3. Tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL là
14,7% [30]. Một nghiên cứu khác tại 7 bệnh viện ở Thành phố Hồ Chí Minh từ
08/2000 đến 08/2001 cũng cho thấy: có 32/730 chủng E. coli sinh ESBL, kết
quả này ở K. pneumonia là 13/438 chủng và ở Proteus mirabilis là 10/141 chủng
[6,7, 8, 22, 30].
1.4 Các gen mã hóa ESBL
1.4.1. TEM
TEM-1 β lactamase thường gặp nhất trong các vi khuẩn Gram âm. Lên đến
90% sức đề kháng ampicillin trong E. coli là do TEM-1 sản xuất [53]. Loại
enzyme này cũng chịu trách nhiệm cho sự đề kháng ampicillin và kháng
penicillin được tìm thấy trong H. influenzae, N. gonorrhoeae với số lượng ngày
càng tăng. TEM-1 có thể thủy phân các penicillin và cephalosporin (cephalothin
và cephaloridine). TEM-2, phát sinh đầu tiên của TEM-1, đã có một sự thay thế
acid amin từ β - lactamase ban đầu [35]. Điều này gây ra một sự thay đổi trong
điểm đẳng điện pI của 5,4 - 5,6, nhưng nó đã không thay đổi bản chất chất nền.

TEM-3, ban đầu được báo cáo vào năm 1989, là loại TEM-β-lactamase đầu tiên
hiển thị kiểu hình ESBL [59]. Trong những năm kể từ báo cáo đầu tiên, hơn 90
dẫn xuất TEM bổ sung đã được mô tả (đối với chuỗi axit amin cho TEM, SHV,
và OXA mở rộng phổ kháng thuốc ức chế β - lactamase, /
studies / webt.htm ). Có một số β-lactamase kháng thuốc ức chế enzyme, nhưng
phần lớn là dẫn xuất mới của các ESBLs.
1.4.2. SHV
- K. pneumoniae
ampicilin qua trung gian
[63]. Trong nhiều chủng K. pneumoniae, bla
SHV-1
hoặc gen có liên quan được
tích hợp vào nhiễm sắc thể vi khuẩn [53]. M ene

Số hóa bởi trung tâm học liệu
14
- on
[52]. Khôn β-lactamase
. Hơn nữa, những thay đổi đã được quan
sát trong bla
SHV
e. Phần lớn các của SHV biến thể có một kiểu hình ESBL được đặc
trưng bởi sự thay thế của một serine cho glycine ở vị trí 238. Một số biến th
-
. Dư lượng serine ở vị trí
238 là rất quan trọng cho quá trình thủy của ceftazidime và dư lượng lysine là
rất quan trọng cho quá trình thủy phân của cefotaxim [50].
1.4.3. CTX – M
las –
- M C . chúng

chủ yếu được tìm thấy trong các chủng Salmonella enterica serovar
Typhimurium và E. coli, nhưng cũng đã được mô tả trong các loài khác của
Enterobacteriaceae - M-10A [56]
2 [51, 57].
β-lactamase
β-lacta
c
( -
e Kluyvera
ascorbata ( e -
[61]. M
sinh l - β-lactamase ; CTX-M -

Số hóa bởi trung tâm học liệu
15
M 3; - -M 2, CTX M 4, CTX M 5, CTX M
6, CTX M
g [38]
[38].
biểu hiện β-lactamase - phân bố tại
Âu [39, 44, 48], Nam M B [57].
e được tim thấy Tây Â
dịch ) [64]
E.coli
Salmonella ` Tây Ban Nha biểu hiện - - -
e
Tây Âu [61] - - Enterobacter cloacae
phân [41]
e - phân lập n
[61].

điều o chủng
Salmonella enterica serovar Typhimurium [36, 39, 44, 45, 64]
dịch ( bùng phát, bộc phát) S. enterica serovar Typhimurium
sở hữu - - Nam M Tây Â
sở hữu biểu hiện -M. D
- .
1.4.4. OXA
e ển s β-
lactamase e
2d [40]. β-lactamase

Số hóa bởi trung tâm học liệu
16
a c
o c
axit clavulanic [40]. -
β-lactamase
β-lactamase OXA.
Trong
Enterobacteriaceae . P.
aeruginosa. -10 - -
- 17) [39, 34, 43, 48]. OXA- với –
- 2 amino axit dư –
e -
asparagine cho seri
aspartate 157. C
Gly157Asp ceftazidime [42]
; OXA
e (
) [55].

1.5. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI KHUẨN SINH ESBL
Phát hiện chủng vi khuẩn sinh ESBL dựa vào sự phát hiện cộng hưởng giữa
cephalosporin và clavulanate.
1.5.1. Phƣơng pháp đĩa đôi ( Double – dist test )
Phương pháp này còn gọi là phương pháp khuếch tán mặt thạch. Cấy vi
khuẩn thuần khiết lên mặt thạch rồi đặt các khoanh kháng sinh. Ở giữa đĩa thạch

Số hóa bởi trung tâm học liệu
17
đặt khoanh amoxycillin/clavulanate, các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin
đặt xung quanh khoanh amoxycillin/clavulanate theo một đường thẳng cách
nhau 20mm. Đĩa thạch sau đó được để vào tủ ấm 37
0
C trong 24 giờ. Khi có sự
mở rộng vòng vô khuẩn của khoanh kháng sinh cephalosporin về phía tiếp giáp
với khoanh kháng sinh amoxycillin/ clavulanate, chứng tỏ chúng có sự cộng
hưởng hay vi khuẩn đó sinh ESBL. Phương pháp này dễ thực hiện, độ nhạy 79-
99%, độ đặc hiệu 94-100%.
Độ nhạy có thể giảm nếu hoạt tính ESBL thấp. Nếu trường hợp nghi ngờ âm
tính giả, có thể làm lại với khoảng cách các khoanh kháng sinh gần nhau hơn.

Hình 1.1. Phương pháp đĩa đôi xác định vi khuẩn sinh ESBL [20]
1.5.2. Phƣơng pháp đĩa kết hợp
Dùng một đĩa chỉ chứa khoanh kháng sinh nhóm cephalosporin và một đĩa
chứa phối hợp cả cephalosporin với clavulanate. Vi khuẩn sinh ESBL khi có sự
chênh lệch đường kính vòng vô khuẩn của hai đĩa kháng sinh: đĩa có clavulanate
có đường kính vòng vô khuẩn ≥ 5mm so với đĩa tương ứng không có
clavulanate [1].
1.5.3. Phƣơng pháp E-test
Thanh thử 1 đầu có chứa một kháng sinh loại Cephalosporin như

Ceftazidime (TZ) hoặc Cefotaxime một đầu chứa Ceftazidime và Clavuanate