So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III.DOC

đặt vấn đề
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều
loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau.
Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1].
Berberin đợc biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều
trị bệnh lỵ. Thuốc đợc sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn,
không ảnh hởng tới sự phát triển b×nh thêng cđa vi khn cã Ých ë rt.
HiƯn nay trên thị trờng có các dạng bào chế của Berberin nh: thuốc nhỏ
mắt, viên nén, viên bao. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lợng nguyên liệu làm
thuốc cũng nh thành phẩm là rất quan trọng.
Dợc điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên
liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ tử
ngoại UV- VIS, dợc điển Trung Quốc (2005) định lợng Berberin bằng HPLC.
Để có cơ sở lựa chọn phơng pháp định lợng Berberin thích hợp, chúng tôi đÃ
tiến hành thực hiện đề tài : So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin
nguyên liệu bằng HPLC theo dợc ®iĨn Trung Qc (2005) vµ b»ng ®o quang
phỉ hÊp thơ UV-VIS theo dợc điển Việt Nam III với những mục tiêu sau:
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC
theo dợc điển Trung Quốc (2005)
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng đo
quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
So sánh hai phơng pháp định lợng trên để tìm phơng pháp thích
hợp cho việc định lợng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lợng
thuốc trong nớc.

PHầN I. TổNG QUAn

1


1.1. vµi nÐt VỊ BERBERIN:

1.1.1. CÊu tróc:
Beberin lµ mét alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung
protoberberin[1]. Isoquinolin còn đợc gọi là benzo[c] pyridin hay 2- benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic[18]

Cấu trúc của isoquinolin
Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử: C20H18NO4+
Tên khoa học :

PTL: 336.36

5,6 dihydro 8,9 – dimethoxy – 1,3 – dioxa – 6a

– azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6]
1.1.2. Nguån gèc: Berberin thêng cã trong rÔ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây
thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin có nhiều
trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so
với alcaloid toàn phần [9].
Berberin thờng có lẫn các tạp chất alcaloid khác nh: palmatin,
jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5
% [6],[13].

2


1.1.3. Tính chất
- Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. Tan trong nớc nóng,
khó tan trong ethanol và nớc lạnh, rất khó tan trong cloroform, không tan trong

ether.[6]
1.5. Tác dụng dợc lý:
- Berberin có tác dụng kháng vi trùng nh: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu và
liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kÝ sinh trïng
g©y bƯnh (kÝ sinh trïng sèt rÐt, kí sinh trùng đờng ruột) [12], [17].
- Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽ không
ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của hƯ vi khn cã Ých ë rt, khi dïng
phèi hỵp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các
thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đờng ruột [17].
- Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co
cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đờng, ức chế cơn nhịp nhanh thất,
giảm viêm cho ngời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm
tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin[17].
Chỉ định: [9],[12],[17]
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật và
đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt.
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng, gió,
lạnh, bụi, khói) và điều trị bệnh đau mắt hột.
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
1.1.6. Chống chỉ định: [17]
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung cđa berberin
- Ngêi dÞ øng víi berberin ( rÊt hiếm gặp)
1.1.7. Dạng thuốc và hàm lợng: [11]

3


- Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lợng 10 mg, hoặc 50-100
mg/ viên
- Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích

bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói)
1.2. Một số phơng pháp định lợng Berberin:
1.2.1. Phơng pháp thể tích: [5], [13]
Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào trong cốc với 150ml nớc đang sôi.
Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml. Lấy chính xác 50ml
dung dịch kali dicromat 0,1N rồi thêm nớc tới vạch. Lắc đều trong 5 phút, lọc
qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 100ml dịch lọc cho vào
bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau đó thêm 10 ml
dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng tối trong 10
phút. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm tơng đơng thêm
2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi màu xanh biến mất
thì dừng.
Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tơng ứng với 12,39 mg C20 H18NO4Cl.
1.2.2. Phơng pháp đo UV-vis
Phơng pháp 1:[6].
* Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm và hòa tan trong 200ml nớc bằng
cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000ml. Lấy 10ml dung dịch
này pha loÃng với nớc đến 100ml.
* Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc thử
chuẩn đà sấy khô ở 1100C trong 4 giờ, hòa tan trong nớc. Thêm 10ml dung dịch
acid sulfuric 1N và thêm nớc vừa đủ 1000ml.
* Đo độ hấp thụ: Đo At và As của dunh dịch thử và dung dịch chuẩn ở bớc sóng 421 nm.
* Cách tính: Lợng ( mg) của C20H18NO4Cl đợc tính bằng công thức sau:

4


P=

At
1
ì
ìa
As 1,006

a: khối lợng ( mg) kali dichromat.
Phơng pháp 2 [6]
Xác định hàm lợng berberin clorid trong viên nén.
* Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lợng trung bình và nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác một lợng bột viên tơng đơng với khoảng 80 mg berberin
clorid, thêm 10ml nớc để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng 200ml nớc sôi,
khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nớc tới
vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy chính xác 5ml dung dịch
trong ở trên đem pha loÃng với nớc cất vừa đủ 100ml.
* Dung dịch chuẩn : pha tơng tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu
berberin clorid.
* Mẫu trắng: nớc cất.
* Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều
kiện tại bớc sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm.
1.2.3. Phơng pháp cân [5]
áp dụng để định lợng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo tủa
của berberin với acid picric.
Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lợng bột viên tơng ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml, thêm
khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm methanol
đến ngấn. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu. Lấy đúng
100ml dịch lọc. Làm bay hơi cho đến khô trên cách thủy, thêm 150ml dung
dịch NaOH 0,1N và 90ml nớc, đun nóng. Lắc kỹ để hòa tan. Để nguội rồi lọc
qua giấy lọc đà thấm ớt. Rửa phễu và giấy lọc 3 lần, mỗi lần 10ml nớc.
Gộp dịch lọc và nớc rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N rồi

tiếp tục cho ngay và từ từ 30ml dung dịch bÃo hòa acid picric ( TT). Lắc đều.

5


Để yên qua một đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đờng kính lỗ xốp 10
16 àm ( đà cân bì) để lấy tủa. Rửa tủa 3 lần với nớc cất ở khoảng 150C, mỗi
lần 15ml nớc, hút kiệt nớc rồi sấy khô phễu và tủa ở 1000C đến khối lợng không
đổi. Khối lợng tủa xác định là P (g).
1 g tđa t¬ng øng víi 0,6586 g C20H18NO4Cl.
1.2.4. Phơng pháp HPLC
Phơng pháp 1:[14], [15].
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x 4 mm) đợc nhồi bởi hạt silicagel đà đợc octadecylsilan hóa có đờng kính 5 àm.
- Nhiệt độ cột: 400C.
- Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong
1000 ml hỗn hợp dung môi nớc và acetonitril (1:1).
- Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thêi gian lu cđa berberin kho¶ng
10 phót.
- Detector UV ë bíc sãng 345 nm.
- ThĨ tÝch tiªm: 10 àl.
- Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung dịch
này giống nhau.
* Tiến hành:
Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin
trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng
berberin trong chế phẩm.
* Cách tính: Lợng Wt (mg) của berberin clorid (C20H18ClNO4).
Wt = Ws x (At / As)
Ws = Lỵng (mg) cđa berberin chn, tÝnh theo lỵng khan.

6


Phơng pháp 2: [13]
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột đợc nhồi bởi các hạt silicagel đà đợc octadecylsilan hóa.
- Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali
dihydrophosphat víi 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chøa 0,2%
triethylamin, ®iỊu chØnh tíi pH 3,0 b»ng acid phosphoric] và acetonitril (60:40).
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phót.
- Detector UV ë bíc sãng 263 nm.
- ThĨ tÝch tiêm: 20 àl
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 32 àg/ml
* Tiến hành:
Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin
trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng berberin có
trong chế phẩm.
Phơng pháp 3: [16]
* Điều kiƯn s¾c ký:
- Cét s¾c ký: Cét Hypersil C18 ( 5 àm, 25 cm x 4,6 mm)
- Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l – acetonitril ( 58: 42).
- Tèc ®é dßng: 1ml/phót.
- Detector UV ë bíc sãng 349 nm.
* TiÕn hành: Tơng tự nh 2 phơng pháp HPLC đà trình bày ở trên.
1.3. Tổng quan Phơng pháp hplc
1.3.1. Nguyên tắc
Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và
định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất
với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu

năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp c¸c chÊt

7


cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha
động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất víi hai pha,
chóng sÏ di chun qua cét víi vËn tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị
trên màn hình hoặc đa ra máy in. [8]
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một
tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột.
Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách đợc
các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc
đồ. [8], [11]
1.3.3. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký:
Kết quả của quá trình sắc kí đợc detector phát hiện, phóng đại và ghi
thành sắc ký đồ( hình 1):

t R2
t R1

to
W 0.5-1

t' R1

W b1

W 0.5-2

W b2

t' R2

Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trng

8


Trong đó :
to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách
tR (thời gian lu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích đợc bơm vào cột
cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích.
tR (thời gian lu thực ) = tR- to.
W0,5: §é réng pic ë nưa chiỊu cao
Wb: Độ rộng đáy pic.
1.3.2.1. Hệ số dung lợng k

t'
k'
t
=

R

=

0

t t
t
R

0

=

0

t
t

R

1

0

[8]
Nếu k' nhỏ thì tR

cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất.
Hai chất chỉ đợc tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau.
1.3.2.2 Độ chọn lọc (selectivity - factor)

k' = t
k' t

− t0

2

R2

1

α=

− t0
R1

(k2' > k1' ) [4], [8]

khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 2.
1.3.2.3. Độ phân giải (resolution)
Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo c«ng thøc:
R=

(

2 t R , B − t R ,A

w

B

+ wA

)

=

1,18

w

(t

R ,B

1 / 2B

− t R ,A

)

+ w1 / 2 A

=

N  α − 1  k 'B 




4 1+k 'B



[4], [8]

Độ phân giải cơ bản đạt đợc khi R = 1,5
1.3.2.4. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó đợc tính theo công thức:
AF =

w

1 / 20

2a

[4], [8]

Trong đó:
W1/20: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiỊu cao cđa pic

9


a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng
cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Khi AF nằm trong khoảng 0,5-2,5 thì phép định lợng đợc chấp
nhận, nếu AF càng tăng lên thì hiện tợng kéo đuôi càng rõ. Hiện tợng đỉnh kéo
đuôi (tailing peak) có thể là do tơng tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh hoặc

cột sắc ký bÈn. §Ønh kÐo tun tríc (fronting peak) cã thĨ do lợng mẫu đa vào
quá lớn so với năng lực cột [7].
1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N
Đặc trng cho hiệu lực cét.
N = 16

 tR 
 
wB

2

hay N=5,54

 tR 


 w1 / 2B 

2

[4], [8]

NÕu gäi L lµ chiỊu cao cét sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H đợc
tính bằng công thức:

H=

L
N

1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC [4],[8]
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm viÖc theo kü thuËt HPLC bao gåm
6 bé phËn chÝnh sau:
a/Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0 400 bar)
a/ Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thờng bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi
chạy sắc ký đợc lọc qua màng lọc (thờng màng lọc cỡ lỗ 0,45 àm ) và đuổi khí
hòa tan.
c/ Hệ tiêm mẫu
Để đa mẫu phân tích vào cột.
Có nhiều phơng pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một
van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự ®éng.

10


Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể đợc tiêm ngay sau khi lọc loại tạp
qua màng lọc 0,45 àm, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi
thích hợp.
d/ Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột đợc chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu đợc với áp suất
cao đến vài trăm bar.
- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh
có đờng kính rất nhỏ (3, 5, 10 àm).
- Đờng kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.
e/ Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ

UV - VIS. Ngoài ra còn có detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hóa.
f/ Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín hiệu
đo dới dạng pic.
Sơ đồ khối hệ thống HPLC đợc tổng quát ở hình 2
Van tiêm
mẫu

Binh
chứa
pha
động

Cột

Detector

Bơm

Bộ phận tự ghi
Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC

11


1.3.5. Cách đánh giá pic[7]
* Đánh giá diện tích pic: Diện tích của một chất tơng ứng với tổng lợng
chất ®ã. §Ĩ tÝnh diƯn tÝch pic, hiƯn nay ngêi ta thờng dùng máy tích phân điện
tử gắn với máy vi tính (sai số khoảng 0,5 %) hoặc máy phân tích cơ học (sai số
1,3 %). Phơng pháp này có thể dùng cho các pic không bị trôi đờng nền và cả

pic có đờng nền bị trôi. Phơng pháp này chỉ cần điểm đầu điểm cuối của pic đợc
nhận ra chính xác và cho kết quả tốt với nồng độ vừa, trung bình và cao.
* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic
(khoảng cách giữa đờng nền và đỉnh pic) là một đại lợng tû lƯ víi diƯn tÝch pic
vµ nã cịng cã thĨ dùng để đánh giá phổ. Phơng pháp chỉ áp dụng khi các chỉ số
k' là hằng định.
* Với pic có đờng nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao
pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.4.Tổng quan PHƯƠNG PHáP QUANG PHổ HấP THụ UV-VIS
1.4.1. Cơ sở lý thuyết[2],[3],[4],[6]
1.4.1.1. Định luật Lambert-Beer
Chiếu một chùm tia sáng đơn sắc có bớc sóng và cờng độ Io qua dung
dịch đồng nhất có nồng độ C, bề dày lớp dung dịch là l. Khi đi qua dung
dịch ,một phần ánh sáng bị hấp thụ, một phần bị phản xạ, phần còn lại (I) thì đi
qua dung dịch .
Mối quan hệ giữa I và Io đợc thể hiện bằng định luật Lambert-Beer.
I = Io ì 10 -Cl
Với là hệ số hấp thụ riêng của dung dịch. Hệ số này không phụ thuộc vào
nồng độ, chỉ phụ thuộc vào bản chất chất tan, vào bớc sóng của ánh sáng chiếu
vào dung dịch.
1.4.1.2. Điều kiện ứng dụng định luật Lambert beer
+ Chùm tia sáng phải đơn sắc
+ Dung dịch phải loÃng (nằm trong khoảng nồng độ thích hợp)

12


+ Dung dịch phải trong suốt (trừ chuẩn độ đo quang).
+ Chất thử phải bền trong dung dịch và phải bỊn di t¸c dơng cđa ¸nh
s¸ng (UV-VIS).

1.4.1.3. Sù sai lƯch đối với định lật Lambert-beer
+ Sự sai lệch do máy:(do bộ phận đơn sắc ,bộ phận khuếch đại kém) nh do
tế bào quang điện, nhân quang quá già, độ nhạy kém.
+ Sai lệch do hoá học:
- Do sự phân ly (ion hoá): thờng gặp khi pha loÃng dung dịch, phân tử chất
tan bị phân ly, mà độ hấp thụ của dạng phân tử và dạng ion phân ly không nh
nhau.
- Do tạo dimer, trimer: sản phẩm trùng hợp này lại có độ hấp thụ khác dạng
đơn phân tử.
+ Do phản ứng các chất lạ:
- Chất lạ có thể tạo phức với các ion trong dung dịch: để đề phòng hiện tợng này xảy ra, ngời ta dùng mẫu trắng có thành phần nh dung dịch, chỉ thiếu
chất cần định lợng.
- Sù hÊp thơ cđa chÊt l¹, thc thư cịng cã thể ảnh hởng tới kết quả định lợng. Vì vậy trong quá trình làm phản ứng tạo màu, phải chú ý tới điều kiện
phản ứng và các thành phần tham gia phản ứng.
1.4.1.4. Một số đại lợng thông dụng[
a/ Độ truyền qua (T-Transmittance):
Độ truyền qua (hay còn gọi là độ thấu quang) đặc trng cho độ trong suốt
(về mặt quang học) của dung dịch, đợc định nghĩa:
T=

I
I

t

= 10-Cl

0

Thờng T tính ra phần trăm (%). Một chất có T=1(hay100%), nghĩa là hoàn

toàn không có hấp thụ ánh sáng, ngời ta nói chất đó hoàn toàn trong suốt.
b/ Độ hấp thụ (A-Absorbance):

13


Độ hấp thụ (hay còn gọi là mật độ quang) đợc định nghĩa :
A = lg

1
= .C.l
T

Đối với một chất xác định (có xác định), thờng đo trên một loại cốc đo
(có bề dày thông thờng là l=1 cm), nh vËy ®é hÊp thơ tû lƯ thn víi nång độ
dung dịch:
A=K.C (K=.l)
1cm

c/ Hệ số hâp thụ phần trăm ( E 1% ):
Theo c«ng thøc A =ε.C.l, nÕu l=1 cm, C=1% thì :
A= =
Vậy

E

1cm
1%

E

1cm
1%

chính là độ hấp thụ của dung dịch có nồng độ 1%, dùng cốc đo

có bề dày 1cm. Với một chất tan xác định, tại một xác định,

E

1cm
1%

là một hằng

số.
d/ Hệ số hấp thụ phân tử ():
Hệ số hấp thụ phân tử, hay còn gọi là hệ số tắt mol là độ hấp thụ của dung
dịch có nồng độ 1M/l, dùng cốc đo có bề dày1cm.
Cũng nh

E

1cm
1%

, với một chất xác định, trong những điều kiện đo xác định

(, dung môi, nhiệt độ,...) là một hằng số.
Giữa

E

1cm
1%

E

1cm
1%

và có mối liên hệ = 10 ì M

ở đây M là phân tử gam của chất tan.
1.4.2. Một số kỹ thuật định lợng bằng phơng pháp quang phổ UV-VIS.[2],
[4],[8]
1.4.2.1. Phơng pháp đo phổ trực tiếp:
Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá trị

E

1cm
1%

biết trớc (tra cứu).

14


A=

E

1cm
1%

.C.l C =

A

E

1cm

(với l =1 cm)

1%

Trong phơng pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bớc sóng () và mật
độ quang A bằng cách:
ã Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng có bớc sóng xác định).
ã Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.
ã Dùng một kính lọc Holmium (có các giá trị max xác định cho trong tài
liệu )để kiểm tra lại máy.
ã Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành dung
dịch có nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị max và tìm Amax

.

1.4.2.2. Phơng pháp so sánh

Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử có nồng độ Cx (cha biết) và của
dung dịch chuẩn có nồng độ Ac (đà biết).
Ta có:

A
A

x
c

=

C
C

x
c



Cx =

A
A

x

x Cc

c

Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc không đợc
chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết quả
càng chính xác.
Ngoài ra còn có các kỹ thuật định lợng khác nh: phơng pháp đờng chuẩn,
phơng pháp thêm đờng chuẩn, phơng pháp chuẩn độ đo quang, phơng pháp định
lợng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ .

15


Phần 2: thực nghiệm và kết quả
2.1. Nguyên vật liệu và phơng pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất, thuốc thử:
2.1.1.1. Đối tợng nghiên cứu:
. Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lỵng 83,3% do ViƯn kiĨm nghiƯm
thc TW cung cÊp
. Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ môn Hoá Dợc cung cÊp
. Palmatin: do viƯn kiĨm nghiƯm thc TW cung cÊp
2.1.1.2. Ho¸ chÊt, thc thư:
. Mi potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric (H3PO4)
. Heptane sodium sulfonate, triethylamine
. Acetonitril dïng cho HPLC (Merk)
. Nớc cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vô cơ trờng đại học Dợc
Hà Nội) dùng cho máy HPLC
. Một vài hóa chất khác
2.1.1.3. Thiết bị:
+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode arrayPDA 100
+ C©n ph©n tÝch AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg
+ Máy đo pH JENWAY của Anh

+ Máy cất nớc 2 lần
+ Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức

16


+ Máy lọc hút chân không Satorius
+ Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml ...
+ Cốc có mỏ: các loại 100; 200; 500
+ Pipet chính xác, pipet thờng, đũa thủy tinh.
+ Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 àm...
2.1.2. Phơng pháp nghiên cứu:
2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu:
. Phân tích mẫu thử bằng phơng pháp HPLC và phơng pháp đo quang
phổ hấp thụ UV- VIS
. Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của hai
phơng pháp trên
. So sánh 2 phơng pháp trên
2.1.2.2. Phơng pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu:


Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn ph-

ơng pháp phân tích


Bằng thực nghiệm, dựa vào kết quả thu đợc, xử lý thống kê và rút

ra kết luận

Phơng pháp sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ

hấp thụ UV-VIS
2.1.2.3.Phơng pháp xử lý số liệu thống kê:
. Dữ liệu thu đợc đợc xử lý bằng phơng pháp thống kê - sử dụng công
cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel
. Một số đặc trng thống kê đợc sử dụng:
- Giá trị trung bình:

x=

1 n

n i =1 x i

∑ (x − x)
n

S=

- §é lƯch chn:

17

i =1

i

n −1

2


S
ì 100
x

- Độ lệch chuẩn tơng đối (RSD):

RSD% =

- Sai số chuẩn :

s

- Sai số tơng đối:

% ) =t n ) ìsx ì 0
(
10
(
1
x

à

- Khoảng tin cậy:

x

=

S
n

x tSx

=

Trong đó : xi là kết quả xác định lần thứ i ; n là số lần xác định
+ Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2 phơng pháp thí nghiệm khác nhau :

Ftn =

S
S

2
1
2

; trong ®ã S1 > S2

2

Ftn>Flt : ®é chính xác hay độ lặp lại của hai phơng pháp khác nhau có ý nghĩa
thống kê
Ftn>Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phơng pháp khác
nhau có ý nghĩa thống kê

Ftnnhau không có ý nghĩa thống kê


Flt tra bảng ở mức tin cËy 95% khi bËc tù do K = n – 1

+ Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lợng của hai phơng
pháp khác nhau :
T=

X −X
S
1

p

1

+

2

1

n1 n 2

( X 1 > X 2 ) víi

S

( n − 1) S + ( n − 1) S
n +n −2
2

p

=

1

1

1

18

2

2

2
2


n + −2
 T < t α /2 n : giá trị trung bình kết quả định lợng của hai phơng
1

2

pháp khác nhau không có ý nghĩa thống kê
n
t

T>

1

+

/2

n 2 2 : giá trị trung bình kết quả định lợng của hai phơng

pháp khác nhau có ý nghĩa thống kê
n
t



1

+

/2

n 2 2 tra bảng ở mức tin cËy 95% khi bËc tù do K = n1+n2-2

2.2. KÕt quả thực nghiệm :
2.2.1. Định lợng Berberin clorid nguyên liệu bằng phơng pháp đo quang

phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III *
Cách tiến hành :
+ Dung dịch thử : Cân 0,200 g chÕ phÈm vµ hoµ tan trong 200 ml nớc
bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000 ml. Lấy 10 ml
dung dịch này pha loÃng với nớc đến 100 ml (C = 20 à g/ml)
+ Dung dịch chuẩn đợc pha tơng tự dung dịch thử , dùng chất đối chiếu
berberin clorid
+ Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng điều
kiện tại bớc sóng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nớc cất, cốc đo dày 1 cm.
* Cách tính kết quả :
Theo phơng pháp so sánh, hàm lợng phần trăm đợc tính theo công thức :

A ìm
A ×m
t

c

c

C% =

× C

t

*

Do có sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên
chúng tôi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn.

19


Trong đó :
C% : Hàm lợng % Berberin clorid có trong mẫu thử.
C : Hàm lợng % Berberin clorid có trong mẫu chuẩn
At : Độ hấp thụ của dung dịch thử.
Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn.
mt : Khối lợng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột
nguyên liệu đà cân để pha dung dịch thử.

mc : Khối lợng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đÃ
cân để pha dung dịch chuẩn.
Tiến hành định lợng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 1 .
Bảng1 : Kết quả định lợng Beberin clorid trong nguyên liệu
STT
1
2
3
4
5
Chuẩn

Khối lợng cân(g)
0,1971
0,2010
0,2062
0,2090
0,2030

0,2001

Độ hấp thụ(A)
0,269
0,272
0,280
0,285
0,277
0,263

C%
86,50
85,76
86,06
86,42
86,48
83,30

Theo kết quả ở bảng 1, ta có:
ã Giá trị trung bình:

X = 86,24%

ã Độ lệch chuẩn

S = 0,324

:

ã Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%):

∆X(%) = 0,40

20


ã Độ lệch chuẩn tơng đối:

RSD = 0,37%

Kết luận: Hàm lợng Beberin clorid trong bột nguyên liệu là 86,24%
0,40%.
2.2.2. Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin clorid nguyên liệu bằng
phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
2.2.2.1./Tính chính xác :
Nguyên tắc: Độ chính xác của phơng pháp đợc đánh giá bằng độ lệch
chuẩn tơng đối của các phép thử song song.
Cách tiến hành và kết quả đợc trình bày nh trong phần 2.2.1.1
Kết quả thử độ chính xác của phơng pháp cho thấy độ lệch chuẩn tơng
đối của các kết quả (RSD = 0,37% < 2%). Nh vậy phơng pháp là chính xác
2.2.2.2 Tính tuyến tính:
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ
trên chất chuẩn Berberin.
Cân 5 mẫu chÊt chn Berberin clorid cã khèi lỵng tõ 0,1600g→
0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định lợng)
Cách tiến hành tơng tự 2.2.1
Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch
STT
C

1

0,0161

2
0,0180

3
0,0202

4
0,0220

5
0,0240

(mg/ml)
A

0,215

0,239

0,262

0,286

0,315

21

y = 12.5x + 0.013
R = 0.998

0.35

Độ hấp thụ A

0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

C(mg/ml)

Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào
nồng độ dung dịch
- Phơng trình hồi quy biểu thị mối tơng quan giữa mật độ quang và
nồng độ dung dịch là: y = 12,5 x + 0,013;
- Hệ số tơng quan: 0,998
- Độ lệch chuẩn của y_ intercept: Sb = 0,009
- Víi ®é tin cËy 95% ta cã kho¶ng tin cËy cđa y_intercept:
b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay - 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042
Tõ kÕt qu¶ trên cho thấy hệ số tơng quan của đờng hồi quy vợt quá
0,99Tất cả các giá trị nằm trên đờng hồi quy hoặc phân bố đồng đều cả hai
phía của đờng hồi quy.
Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0.
Vậy phơng pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến 120%
nồng độ làm việc.
2.2.2.3. Độ đúng:
. Cân 3 mẫu chất đối chiếu Beberin clorid ( hàm lợng 83,3%) với khối lợng từ 0,1600g 0,2400g (tại các điểm 80, 100, 120% so với lợng cân dùng
khi định lợng)
. Tiến hành tơng tự 2.2.1. Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả trung bình

22


. Tính toán kết quả khảo sát độ đúng dựa vào độ hấp thụ của mẫu chuẩn
là 0,263 ứng với khối lợng cân 0,2001g
Kết quả thu đợc ghi ở bảng 3

Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phơng pháp đo quang phổ
hấp thụ UV-VIS
STT Khối lợng

Độ hấp thụ

Lợng tìm

Phần trăm

chất có thực

trung bình

lại trung

tìm lại

a (g)

cân (g)

Lợng hoạt

(A)

bình b (g)

(b/a.100%)

0,208
0,267
0,313

0,1322
0,1696
0,1984

98,88
100,77
100,86

1
0,1605
0,1337
2
0,2020
0,1683
3
0,2362
0,1967
Từ kết quả bảng 3 ta có:
- Trung bình % tìm lại: 100,17%

- Phơng trình hồi quy về mối tơng quan giữa lợng hoạt chất ban đầu và
lợng hoạt chất tìm lại là: y = 1,052x 0,008
- Hệ số tơng quan: r = 0,999
- Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003
- Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,019
- Với độ tin cậy 95% ta có:
Khoảng tin cËy cđa ®é dèc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992
< a < 1,112
Kho¶ng tin cËy cđa y_intercept: b ± 3,182Sb = - 0,008 ± 0,009
hay - 0,017 < y_intercept < 0,001

23


y = 1.052x - 0.008
R = 0.999

Lượng tìm lại (g)

0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Lượng hoạt chất có thực (g)

Hình 7: Đồ thị biểu diễn phơng trình hồi quy tuyến tính về mối tơng

quan giữa lợng hoạt chất tìm lại và lợng hoạt chất có thực
Kết luận:
- Không có sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của y_intercept
chứa 0.
- Không có sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy độ dốc chứa 1.
- Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,17% nghĩa là nằm trong
khoảng từ 98% đến 102%.
Nh vậy, phơng pháp đa ra là đúng trong khoảng khảo sát.
2.2.2.4. Tính đặc hiệu:
Nh trong phần 1.1.2 đà trình bày, các tạp chất cần xác định trong
Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhng trong điều kiện thí
nghiệm không có chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tôi chỉ tiến hành xác định sự
ảnh hởng của tạp chất Palmatin đối với phơng pháp định lợng
Tiến hành:
+ Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hòa tan trong 200 ml nớc
bằng cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000 ml, thu đợc dunhg
dịch berberin chuẩn 0,2 mg/ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào 4 bình định
mức 100 ml.
+ Pha dung dịch Palmatin 10%, 5% và 2,5% so víi nång ®é cđa
berberin clorid ®em ®o

24


. Cân 0,02 g Palmatin chuẩn và hòa tan trong 20 ml nớc bằng cách đun
nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho
vào bình định mức 100 ml và thêm nớc vừa đủ tới vạch, đợc dung dịch palmatin
chuẩn 0,02 mg/ml
. LÊy 25 ml dung dÞch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50
ml và thêm nớc vừa đủ tới vạch, ta đợc dung dịch palmatin 0,01 mg/ml.

. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,01 mg/ml cho vào bình định mức 50
ml và thêm nớc vừa đủ tới vạch, đợc dugn dịch palmatin 0,005 mg/ml.
. Lần lợt thêm 10 ml dung dịch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml vào 3
bình định mức 100 ml đà chứa berberin clorid chuẩn trên và thêm nớc vừa đủ
tới vạch. Một bình định mức 100 ml không thêm palmatin và thêm nớc tới vạch.
Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch 4 bình này tại bớc sóng 421 nm
Bảng 4: Kết quả thu đợc về sự ảnh hởng của tạp chất palmatin tới
độ hÊp thơ quang cđa berberin clorid
B×nh 1
Berberin clorid 0,2 mg/ml
(ml)
Palmatin 0,02 mg/ml (ml)
Palmatin 0,01 mg/ml (ml)
Palmatin 0,005 mg/ml (ml)
§é hÊp thụ A

Bình 2

Bình 3

Bình 4

10

10

10

10

10
10
0,263

0,282

0,271

10
0.266

Nhận xét: Từ kết quả bảng trên, ta thấy độ hấp thụ quang của dung
dịch tăng theo sự tăng của nồng độ dung dịch palmatin. Khi thêm 2,5%
palmatin, hàm lợng berberin trong bột nguyên liệu định lợng theo phơng pháp
đo quang phổ hấp thụ UV-VIS của DĐVN III tăng 1,14%. Nếu có 2% palmatin
nh trong giới hạn về palmatin mà DĐVN III yêu cầu thì kết quả định lợng tăng
0,91%
Vậy phơng pháp không có tính đặc hiÖu.

25