So sánh hai phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc

đặt vấn đề
Berberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có trong nhiều
loại cây thuốc ở Việt Nam, khoảng 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau.
Berberin chủ yếu ở trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%[1].
Berberin đợc biết đến với tác dụng nổi bật là kìm khuẩn tả và E.coli, điều
trị bệnh lỵ. Thuốc đợc sử dụng phổ biến do giá thành thấp và khá an toàn,
không ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của vi khuẩn có ích ở ruột.
Hiện nay trên thị trờng có các dạng bào chế của Berberin nh: thuốc nhỏ
mắt, viên nén, viên bao. Vì vậy vấn đề kiểm tra chất lợng nguyên liệu làm
thuốc cũng nh thành phẩm là rất quan trọng.
Dợc điển Việt Nam III (DĐVN III) có chuyên luận kiểm nghiệm nguyên
liệu và chế phẩm viên nén Berberin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ tử
ngoại UV- VIS, dợc điển Trung Quốc (2005) định lợng Berberin bằng HPLC.
Để có cơ sở lựa chọn phơng pháp định lợng Berberin thích hợp, chúng tôi đã
tiến hành thực hiện đề tài : So sánh hai phơng pháp định lợng Berberin
nguyên liệu bằng HPLC theo dợc điển Trung Quốc (2005) và bằng đo quang
phổ hấp thụ UV-VIS theo dợc điển Việt Nam III với những mục tiêu sau:
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng HPLC
theo dợc điển Trung Quốc (2005)
Đánh giá phơng pháp định lợng Berberin nguyên liệu bằng đo
quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
So sánh hai phơng pháp định lợng trên để tìm phơng pháp thích
hợp cho việc định lợng berberin trong các cơ sở kiểm tra chất lợng
thuốc trong nớc.
PHầN I. TổNG QUAn
1
1.1. vài nét Về BERBERIN:
1.1.1. Cấu trúc:
Beberin là một alcaloid thực vật thuộc nhóm isoquinolin có khung
protoberberin[1]. Isoquinolin còn đợc gọi là benzo[c] pyridin hay 2- benzamin
là một hợp chất hữu cơ thơm heterocyclic[18]

Cấu trúc của isoquinolin
Công thức cấu tạo:

Công thức phân tử: C
20
H
18
NO
4
+ PTL: 336.36
Tên khoa học : 5,6 dihydro 8,9 dimethoxy 1,3 dioxa 6a
azoniaindeno (5,6-a) anthracen [6]
1.1.2. Nguồn gốc: Berberin thờng có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây
thuộc chi Berberis, Hydrastis candensis, Coptis chinensis [18]. Berberin có nhiều
trong thân và rễ cây vàng đắng với tỷ lệ 1,5-3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so
với alcaloid toàn phần [9].
Berberin thờng có lẫn các tạp chất alcaloid khác nh: palmatin,
jatrorrhizin. Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhizin không quá 5
% [6],[13].
2
1.1.3. Tính chất
- Bột kết tinh màu vàng, không mùi, có vị rất đắng. Tan trong nớc nóng,
khó tan trong ethanol và nớc lạnh, rất khó tan trong cloroform, không tan trong
ether.[6]
1.5. Tác dụng dợc lý:
- Berberin có tác dụng kháng vi trùng nh: vi khuẩn ( shigella, tụ cầu và
liên cầu khuẩn), thể protozoal, vi nấm, candida, virus, nấm men, kí sinh trùng
gây bệnh (kí sinh trùng sốt rét, kí sinh trùng đờng ruột) [12], [17].
- Berberin có tác dụng kìm khuẩn tả và E.coli, đặc biệt khi dùng sẽ không
ảnh hởng tới sự phát triển bình thờng của hệ vi khuẩn có ích ở ruột, khi dùng

phối hợp với một số thuốc kháng sinh sẽ hạn chế tác dụng phụ gây ra bởi các
thuốc kháng sinh đối với hệ sinh vật đờng ruột [17].
- Berberin có tác dụng ức chế sự bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co
cơ, giảm cholesterol và trigycerid, chống tiểu đờng, ức chế cơn nhịp nhanh thất,
giảm viêm cho ngời bị viêm khớp, tăng tiểu cầu của bệnh nhân xuất huyết, giảm
tiểu cầu tiên phát và thứ phát, kích thích sự bài tiết mật và thải trừ bilirubin[17].

Chỉ định: [9],[12],[17]
- Bệnh lỵ trực khuẩn, hội chứng lỵ, viêm ruột, tiêu chảy, viêm ống mật và
đặc biệt là bệnh sỏi mật, vàng da, sốt, sốt rét, mụn nhọt.
- Điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài( do nắng, gió,
lạnh, bụi, khói) và điều trị bệnh đau mắt hột.
- Điều trị bệnh Leishmania, Trichomonas.
1.1.6. Chống chỉ định: [17]
- Phụ nữ có thai vì khả năng gây co bóp tử cung của berberin
- Ngời dị ứng với berberin ( rất hiếm gặp)
1.1.7. Dạng thuốc và hàm lợng: [11]
3
- Dạng viên nén, viên bao, viên nang với hàm lợng 10 mg, hoặc 50-100
mg/ viên
- Dạng thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích
bên ngoài (gió, nắng, lạnh, bụi, khói)
1.2. Một số phơng pháp định lợng Berberin:
1.2.1. Phơng pháp thể tích: [5], [13]
Hòa tan 0,3g chế phẩm (chính xác) vào trong cốc với 150ml nớc đang sôi.
Làm nguội, chuyển dung dịch vào bình định mức 250ml. Lấy chính xác 50ml
dung dịch kali dicromat 0,1N rồi thêm nớc tới vạch. Lắc đều trong 5 phút, lọc
qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc đầu. Lấy chính xác 100ml dịch lọc cho vào
bình nón nút mài 250 ml, thêm 2g kali iodid, lắc cho tan, sau đó thêm 10 ml
dung dịch acid hydrochloric 16%, đậy kín, lắc đều, để vào bóng tối trong 10

phút. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,1N, gần điểm tơng đơng thêm
2ml dung dịch hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ cho đến khi màu xanh biến mất
thì dừng.
Song song tiến hành làm mẫu trắng trong cùng điều kiện.
1ml dung dịch kali dicromat 0,1N tơng ứng với 12,39 mg C
20
H
18
NO
4
Cl.
1.2.2. Phơng pháp đo UV-vis
Phơng pháp 1:[6].
* Dung dịch thử: Cân 0.200 g chế phẩm và hòa tan trong 200ml nớc bằng
cách đun nóng. Sau đó làm lạnh và thêm nớc đến 1000ml. Lấy 10ml dung dịch
này pha loãng với nớc đến 100ml.
* Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,200 g Kali dicromat thuốc thử
chuẩn đã sấy khô ở 110
0
C trong 4 giờ, hòa tan trong nớc. Thêm 10ml dung dịch
acid sulfuric 1N và thêm nớc vừa đủ 1000ml.
* Đo độ hấp thụ: Đo At và As của dunh dịch thử và dung dịch chuẩn ở b-
ớc sóng 421 nm.
* Cách tính: Lợng ( mg) của C
20
H
18
NO
4
Cl đợc tính bằng công thức sau:

4

a
As
At
P
ìì=
006,1
1
a: khối lợng ( mg) kali dichromat.
Phơng pháp 2 [6]
Xác định hàm lợng berberin clorid trong viên nén.
* Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lợng trung bình và nghiền thành bột
mịn. Cân chính xác một lợng bột viên tơng đơng với khoảng 80 mg berberin
clorid, thêm 10ml nớc để thấm đều bột viên, sau đó thêm khoảng 200ml nớc sôi,
khuấy kĩ 5 phút, để nguội rồi chuyển vào bình định mức 500ml, thêm nớc tới
vạch, lắc đều. Để lắng tự nhiên hoặc đem ly tâm. Lấy chính xác 5ml dung dịch
trong ở trên đem pha loãng với nớc cất vừa đủ 100ml.
* Dung dịch chuẩn : pha tơng tự dung dịch thử, dùng chất đối chiếu
berberin clorid.
* Mẫu trắng: nớc cất.
* Tiến hành đo độ hấp thụ của dung dịch thử và chuẩn trong cùng điều
kiện tại bớc sóng cực đại 345 nm, cốc đo dầy 1 cm.
1.2.3. Phơng pháp cân [5]
áp dụng để định lợng viên nén berberin clorid, dựa trên khả năng tạo tủa
của berberin với acid picric.
Cân 20 viên và nghiền thành bột mịn. Cân chính xác một lợng bột viên t-
ơng ứng với khoảng 0.50g berberin clorid, cho vào bình định mức 250ml, thêm
khoảng 200 ml methanol (TT), lắc kỹ để hòa tan berberin, rồi thêm methanol
đến ngấn. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 20ml dịch lọc ban đầu. Lấy đúng

100ml dịch lọc. Làm bay hơi cho đến khô trên cách thủy, thêm 150ml dung
dịch NaOH 0,1N và 90ml nớc, đun nóng. Lắc kỹ để hòa tan. Để nguội rồi lọc
qua giấy lọc đã thấm ớt. Rửa phễu và giấy lọc 3 lần, mỗi lần 10ml nớc.
Gộp dịch lọc và nớc rửa, thêm 10ml dung dịch acid hydroclorid 0,1N rồi
tiếp tục cho ngay và từ từ 30ml dung dịch bão hòa acid picric ( TT). Lắc đều.
5
Để yên qua một đêm, lọc qua phễu thủy tinh xốp có đờng kính lỗ xốp 10
16 àm ( đã cân bì) để lấy tủa. Rửa tủa 3 lần với nớc cất ở khoảng 15
0
C, mỗi
lần 15ml nớc, hút kiệt nớc rồi sấy khô phễu và tủa ở 100
0
C đến khối lợng không
đổi. Khối lợng tủa xác định là P (g).
1 g tủa tơng ứng với 0,6586 g C
20
H
18
NO
4
Cl.
1.2.4. Phơng pháp HPLC
Phơng pháp 1:[14], [15].
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột thép không gỉ ( 25cm x 4 mm) đợc nhồi bởi hạt silicagel đã đ-
ợc octadecylsilan hóa có đờng kính 5 àm.
- Nhiệt độ cột: 40
0
C.
- Pha động: Hòa tan 3,4g kali dihydrophosphat và 1,7g natri laurylsulfat trong

1000 ml hỗn hợp dung môi nớc và acetonitril (1:1).
- Tốc độ dòng: Điều chỉnh tốc độ dòng sao cho thời gian lu của berberin khoảng
10 phút.
- Detector UV ở bớc sóng 345 nm.
- Thể tích tiêm: 10 àl.
- Nồng độ dung dịch thử và chuẩn: 0,1mg/ml và cách tiến hành pha 2 dung dịch
này giống nhau.
* Tiến hành:
Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin
trong các dung dịch thử , chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng
berberin trong chế phẩm.
* Cách tính: Lợng W
t
(mg) của berberin clorid (C
20
H
18
ClNO
4
).
W
t
= W
s
x (A
t
/ A
s
)
W

s
= Lợng (mg) của berberin chuẩn, tính theo lợng khan.
6
Phơng pháp 2: [13]
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột đợc nhồi bởi các hạt silicagel đã đợc octadecylsilan hóa.
- Pha động: Hỗn hợp dung dịch đệm phosphate [ 0,05 mol/L kali
dihydrophosphat với 0,05 mol/L natri heptan sulfonat (1:1) chứa 0,2%
triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,0 bằng acid phosphoric] và acetonitril (60:40).
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút.
- Detector UV ở bớc sóng 263 nm.
- Thể tích tiêm: 20 àl
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 32 àg/ml
* Tiến hành:
Lần lợt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic berberin
trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lợng dung dịch chuẩn, tính lợng berberin có
trong chế phẩm.
Phơng pháp 3: [16]
* Điều kiện sắc ký:
- Cột sắc ký: Cột Hypersil C18 ( 5 àm, 25 cm x 4,6 mm)
- Pha động: Acid phosphoric 0,04 mol/l acetonitril ( 58: 42).
- Tốc độ dòng: 1ml/phút.
- Detector UV ở bớc sóng 349 nm.
* Tiến hành: Tơng tự nh 2 phơng pháp HPLC đã trình bày ở trên.
1.3. Tổng quan Phơng pháp hplc
1.3.1. Nguyên tắc
Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và
định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất
với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu
năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất

7
cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha
động bằng bơm với áp suất cao thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha,
chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị
trên màn hình hoặc đa ra máy in. [8]
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một
tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột.
Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung môi mà quá trình rửa giải tách đợc
các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc
đồ. [8], [11]
1.3.3. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký:
Kết quả của quá trình sắc kí đợc detector phát hiện, phóng đại và ghi
thành sắc ký đồ( hình 1):


t
t
W
b2
0.5-2
W
0.5-1
W
b1
W

R2
R2
t'
t'
R1
R1
t
o
Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trng
8