TỔNG QUAN VỀ TOBRAMYCIN.DOC

Phần 1: Tổng quan
1.1. Tổng quan về Tobramycin
1.1.1. Công thức cấu tạo
C
18
H
37
N
5
O
9
PTL: 467.5
Tên khoa học: 4-O-(3-Amino-deoxy--D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-O-(2,6-
diamino-2,3,6-trideoxy--D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine [21].
1.1.2. Tính chất lý hóa
Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nớc, rất khó tan trong
ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether.
Góc quay cực riêng []
D
20
: +138
0
đến +148
0
[7]
1.1.3. Nguồn gốc
Chiết xuất từ môi trờng nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể bán
tổng hợp từ kanamycin B [7].
1.1.4. Dợc động học
Tobramycin hầu nh không hấp thu qua đờng tiêu hoá nhng hấp thu tốt
qua đờng tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. Thuốc ít liên kết với protein huyết tơng. Do

3
phân tử phân cực mạnh nên khó đi vào các mô kể cả não. Thuốc đạt nồng độ
cao trong vỏ thận. Khi sử dụng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai
gây độc cho cả mẹ và con. Tobramycin đào thải chủ yếu qua thận nên phải
giảm liều khi suy thận, thờng dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính.
Hiện nay, tobramycin đợc dùng với chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày.
Cách dùng này cho thấy hiệu quả điều trị cao hơn và ít độc tính hơn so với dùng
liều nhỏ và nhiều lần trong ngày nh trớc đây. Đối với các ca nặng (nhiễm Pseu.
aeruginosa ở ngời giảm neutrophile và các ca suy thận) cần khoảng cách liều
dài hơn 24 giờ. Thời gian bán thải của tobramycin: 2 - 5 giờ [6]
1.1.5. Tác dụng và cơ chế tác dụng
Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên
nhiều vi khuẩn Gr (-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr (+) hiếu khí. Thuốc không
có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí.
Tobramycin rất giống gentamycin về tính chất sinh học và độc tính:
chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với
protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận.
Điểm quan trọng nhất của tobramycin là có hoạt tính đối với phần lớn
các chủng Pseudomonas aeruginose, mạnh hơn cả gentamycin.
Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn
nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch với các tiểu phân 30S của ribosom
[2], [11].
1.1.6. Chỉ định
Đợc chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tới tính mạng, đặc
biệt với các bệnh mà nguyên nhân cha rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi
khuẩn Gr (-).
Trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nặng, hoặc trong các bệnh nhiễm
khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas sp. gây ra, tobramycin có thể dùng phối
hợp với một kháng sinh nhóm beta-lactam.
4

Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha -
Streptococcus gây ra, có thể dùng tobramycin phối hợp với ampicilin hoặc
benzylpenicilin nhng phải tiêm riêng rẽ. [2]
1.1.7. Chống chỉ định
Ngời có tiền sử dị ứng với các kháng sinh loại aminoglycosid, ngời nghe
kém và ngời có bệnh thận. [2]
1.1.8. Dạng bào chế và liều lợng
Tobramycin sulphat: Dung dịch tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch 40 mg/ml (ngời
lớn), 10 mg/ml (trẻ em). Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ.
Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %.
Dạng thuốc hít qua đờng miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P.
aeruginosa đờng hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [11]
1.2. Một số phơng pháp định lợng Tobramycin
1.2.1. Định lợng tobramycin bằng phơng pháp vi sinh
1.2.1.1. Phơng pháp 1 [15]
- Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501.
- Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 0,1
Dikali hydrophosphat : 5,59 g
Kali dihydrophosphat : 0,41 g
- Môi trờng định lợng:
Pepton : 5,0 g
Cao thịt : 3,0 g
Dikali hydrophosphat : 3,0 g
Thạch : 15,0 - 20,0 g
Nớc cất : 1000 ml
pH sau khi tiệt trùng : 7,8 0,2
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả
theo [15]
5
1.2.1.2. Phơng pháp 2 [3]

- Chủng vi khuẩn: Bacillus pumilus NCTC 8241.
- Dung dịch đệm phosphat pH 8,0 0,1
Dikali hydrophosphat : 16,75 g
Kali dihydrophosphat : 0,523g
- Môi trờng định lợng:
Cao men bia : 3,0 g
Pepton : 6,0 g
Casein pancreatic : 4,0 g
Glucose : 1,0 g
Cao thịt : 1,5 g
Thạch : 15,0 g
Nớc cất : 100 ml
pH sau khi tiệt trùng : 8,2 0,2
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử
Cân chính xác khoảng 25,0 mg tobramycin hòa tan trong dung dịch
đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml; 20
IU/ml và 40 IU/ml.
- Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phơng pháp hoạt lực kháng sinh
- DĐVN III.
1.2.1.3. Phơng pháp 3:[14], [20]
- Xác định hoạt lực kháng sinh của tobramycin bằng phơng pháp vi sinh
vật theo BP 2000 hay JP14
- Chủng vi khuẩn : Bacillus subtilis ATCC 6633
- Môi trờng nuôi cấy : Môi trờng đặc
- Dung dịch chuẩn
Cân chính xác một lợng tobramycin chuẩn, tơng đơng khoảng 25 mg
(hiệu lực), hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính
6
xác 25 ml và đó chính là dung dịch chuẩn gốc. Giữ dung dịch chuẩn gốc ở nhiệt
độ từ 5

C đến 15

C và sử dụng trong vòng 30 ngày. Pha loãng dung dịch bằng
dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc các dung dịch có nồng độ
8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực).
- Dung dich thử:
Cân chính xác một lợng tobramycin, tơng đơng khoảng 25 mg (hiệu lực),
hoà tan trong dung dịch đệm phosphat 0,1 mol/l, pH 8 thành chính xác 25ml.
Pha loãng dung dịch bằng dung dịch chuẩn đệm phosphat 0,1M, pH 8 để đợc
các dung dịch có nồng độ 8àg/ml và 2àg/ml (theo hiệu lực).
1.2.2. Định lợng tobramycin bằng phơng pháp đo quang phổ hấp thụ UV-
VIS
1.2.2.1. Phơng pháp 1: [4]
Cân một lợng tobramycin sulfat tơng ứng với khoảng 0,3 g tobramycin
nguyên liệu , cho vào bình định mức có dung tích 100 ml, bổ sung nớc cất 2 lần
vừa đủ đến vạch, trộn đều. Lấy 1 ml dung dịch này cho vào bình định mức có
dung tích 20 ml, thêm 5 ml dung dịch NaOH 0,01N, 2 ml dung dịch KMnO
4
.
Dung dịch vừa pha đem đun cách thuỷ ở 40
0
C trong 60 phút.
Song song tiến hành điều chế dung dịch chuẩn bằng cách dùng chất đối
chiếu tobramycin.
Mẫu trắng tiến hành nh mẫu thử nhng không có tobramycin.
Sau khi đun cách thuỷ ở 40
0
C, thời gian 60 phút, đem đo mật độ quang
của các dung dịch này ở bớc sóng 425 nm, cuvet dày 1cm.

1.2.2.2. Phơng pháp 2: [19]
Dựa trên cơ sở tạo ra sản phẩm mầu xanh với 3-methyl-2
benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid và FeCl
3
. Sản phẩm có độ hấp thụ lớn
nhất ở 645 nm. Định luật Lambert-Beer đợc áp dụng trong khoảng nồng độ từ
50-500 mUI/ml.
1.2.3 Định lợng tobramycin bằng phơng pháp HPLC
1.2.2.1 Phơng pháp 1 [14]
7
- Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 x 250 mm, 8àm).
- Nhiệt độ cột: 55
0
C.
- Pha động: Hỗn hợp pha trong 1l nớc đã loại CO
2
gồm: 52 g natri sulfat
khan; 1,5 g natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml dung dịch kali
dihydrophosphat 0,2 M đã đợc chỉnh pH về 3,0 bằng acid phosphoric.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Dung dịch thêm vào sau cột: Dung dịch natri hydroxyd 2% pha trong n-
ớc đã loại CO
2
. Tốc độ 0,3 ml/phút.
- Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tơng tự.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 0,1 mg/ml.
1.2.2.2 Phơng pháp 2 [20], [23]
- Cột RP 18 (3,9 mm x 30 cm).
- Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan trong

khoảng 800 ml nớc, thêm vào dung dịch này 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N,
sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 ml, lắc đều.
- Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Dung dịch 2,4dinitrofluorobenzen
1% trong ethanol 96%.
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút.
- Detector UV: 365 nm.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,22 mg/ml trong dung dịch
acid sulfuric 0,004 N.
- Các dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với các thuốc thử 2,4-
dinitrofluorobenzen và tris (hydroxymethyl) aminomethan trớc khi tiêm sắc ký.
1.2.2.3 Phơng pháp 3 [15]
- Cột Purospher

STARRP-18e (4 x 55 mm, 3 àm, Merck).
- Pha động: Acetonitril - nớc (50:50).
8
- Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút.
- Detector UV: 230 nm.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 5 àg/ml trong nớc.
- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử đợc tạo dẫn xuất với dung dịch thuốc
thử 1-naphthyl isothiocyanat trong pyridin ở 70
0
C.
1.2.2.4 Phơng pháp 4 [16]
- Cột Xterra

RP - 18 (2,1 x 250 mm, 5 àm).
- Nhiệt độ cột: 30
0

C.
- Pha động A: Thêm 0,7 ml dung dịch amoni hydroxyd 28 - 30 % vào 1
lít nớc Milli - Q

. Sử dụng dung dịch natri hydroxyd 2,5 N để chỉnh pH pha
động A đến 11,0.
- Pha động B: Acetonitril.
- Tiến hành sắc ký theo chơng trình gradient dung môi nh sau:
Thời gian
(phút)
Pha động A
(%)
Pha động B
(%)
0 100 0
10 0 100
- Tốc độ dòng: 0,2 ml/phút.
- Detector: Khối phổ.
- Thể tích tiêm: 4àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,35 mg/ml trong dung dịch
NaCl 0,9 %.
1.2.2.5 Phơng pháp 5 [15]
- Cột Ultrasphera RP 8 (4,6 x 250 mm, 5àm).
- Pha động: Acetonitril - đệm phosphat 0,05 M pH 3,5 [62:38]
- Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút.
- Thuốc thử tạo dẫn chất: Acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic.
9
- Detector UV: 340 nm.
- Thể tích tiêm: 20 àl.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: Khoảng 0,02 mg/ml trong đệm

phosphat pH 7,4.
- Dung dịch chuẩn và thử đợc tạo dẫn xuất với thuốc thử acid
2,4,6-trinitrobenzen sulfomic ở 70
0
C.
1.2.2.6. Phơng pháp 6 [5]
- Cột : RP -18 brava ODS (150 x 4,6 mm,5àm)
- Detector huỳnh quang : Ex/Em= 338 nm/ 455 nm
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Tốc độ thuốc thử: 0,7ml/phút
- Thể tích tiêm: 20 àm
- Pha động: Hoà tan 17,75 g natri sulfat khan ; 3,05g natri pentansulfonat
và 1ml acid acetic băng trong 1000 ml nớc, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45àm.
- Thuốc thử tạo dẫn xuất sau cột: Hoà tan 0,5g o-phthalaldehyd trong 100
ml methanol, thêm 1,0 ml 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút. Thêm 1,5 ml dung
dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 ml dung dịch đệm borat pH 10,4
lắc đều.
- Dung dịch đệm borat pH 10,4: Hoà tan 24,64 g acid boric trong 900 ml
nớc. Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch NaOH 40%, thêm nớc tới vừa đủ
1000 ml, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 àm (pha theo BP 2005).
1.2.2.7. Phơng pháp 7 [9]
Dung dịch thử
Cân chính xác khoảng 20,0 mg tobramycin nguyên liệu cho vào bình
định mức 20,0 ml. Hòa tan và pha loãng bằng nớc vừa đủ đến vạch. Lấy chính
xác 5,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 20,0 ml. Thêm 0,5 ml thuốc
10
thử X, đem đun cách thủy ở 80
0
C trong 60 phút. Thêm dung môi vừa đủ đến
vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 àm.

Dung dịch chuẩn (đối chiếu)
Tiến hành tơng tự nh dung dịch thử nhng thay tobramycin nguyên liệu
bằng tobramycin chuẩn (đối chiếu).
- Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5àm).
- Detector UV : = 215 nm.
- Pha động: Methanol : Đệm phosphat 0,01 M pH 3 = 20 : 80
- Thể tích tiêm: 10 àl.
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút.
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.
* Nhận xét: Qua các phơng pháp định lợng nêu trên, chúng tôi nhận thấy:
- Định lợng bằng phơng pháp vi sinh: Rẻ, đơn giản, không cần trang thiết
bị phức tạp nhng có nhợc điểm lớn là mất nhiều thời gian và kém dặc hiệu do sự
có mặt của các chất kháng vi sinh vật khác, tính chính xác không cao.
- Định lợng bằng phơng pháp đo độ hấp thụ UV-VIS: Có độ chính xác cao,
tiến hành đơn giản, không yêu cầu máy móc quá phức tạp, hoá chất thông dụng
và có thể áp dụng định lợng ở các cơ sở kiểm nghiệm trong cả nớc. Tuy nhiên,
nhợc điểm của phơng pháp là: Tính đặc hiệu cha cao (sự có mặt của chất khác
có khả năng hấp thụ tử ngoại khả kiến nh benzalkonium clorid, một chất bảo
quản hay dùng, sẽ ảnh hởng kết quả định lợng), hoặc phải dùng thuốc thử nhập
ngoại để tạo dẫn chất.
- Định lợng bằng phơng pháp HPLC :
u điểm: Nói chung có tính đặc hiệu cao, tách riêng đợc hoạt chất.
Nhợc điểm: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt
tiền vì detector UV thờng không dùng đợc mà thờng phải tạo dẫn chất.
11
Phơng pháp HPLC pha đảo với detector UV rất hay sử dụng để phân tích
các hợp chất phân cực và hấp thụ UV. Nhng với các hợp chất hấp thụ UV yếu
nh tobramycin thì thờng phải tạo dẫn chất, hoặc phải sử dụng detector loại đặc
biệt đắt tiền.
Vì vậy, với các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt

vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lợng tobramycin bằng phơng
pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn, không sử dụng thuốc
thử tạo dẫn xuất nh các phơng pháp hiện nay với hi vọng có thể đa vào sử dụng
trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lợng các sản phẩm chứa
tobramycin.
1.3. Tổng quan về phơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng
cao (HPLC)
1.3.1. Nguyên tắc
Phơng pháp HPLC là 1 phơng pháp phân tích hóa lý, dùng để tách và
định lợng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất
với 2 pha luôn tiếp xúc nhng không hòa lẫn vào nhau: Pha tĩnh (trong cột hiệu
năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn hợp các chất
cần phân tích đa vào cột, chúng sẽ đợc hấp phụ hoặc phân bố vào pha tĩnh tùy
thuộc vào bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi ta bơm dung môi pha
động vào cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với hai pha, chúng sẽ di
chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ đợc phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
detector và đợc chuyển qua bộ xử lý kết quả. Kết quả cuối cùng đợc hiển thị
trên màn hình hoặc đa ra máy in [8].
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một
tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lu giữ ra khỏi cột.
12
Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách đợc
các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký, chúng ta có sắc
đồ [8], [11].
1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm
6 bộ phận chính sau:

1.3.3.1. Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh đợc áp suất (0 -
400 bar)
1.3.3.2. Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thờng bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung môi
chạy sắc ký đợc lọc qua màng lọc (thờng màng lọc cỡ lỗ 0,45 àm ) và đuổi khí
hòa tan.
1.3.3.3. Hệ tiêm mẫu
Để đa mẫu phân tích vào cột.
Có nhiều phơng pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng một
van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.
Mẫu thử (dạng lỏng hay dạng rắn) đều phải hoà tan trong dung môi thích hợp
rồi lọc qua màng lọc 0,45àm trớc khi tiêm.
1.3.3.4. Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột đợc chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu đợc với áp suất
cao đến vài trăm bar.
- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha tĩnh có đ-
ờng kính rất nhỏ (3, 5, 10 àm).
- Đờng kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.
Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách. Nếu
sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm. Ví dụ dung môi có tính chất
acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay nguyên
liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm.
13
1.3.3.5. Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần phân
tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp thụ
UV - VIS.
Nguyên lý hoạt động của detector UV - VIS dựa trên nguyên lý hoạt
động của phơng pháp đo quang phổ hấp thụ. Ngoài ra còn có detector khúc xạ,

huỳnh quang, điện hóa.
1.3.3.6. Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại, nhng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi các tín hiệu
dới dạng pic [8], [14].
Sơ đồ khối hệ thống HPLC đợc tổng quát ở hình 1.1
Hình 1.1: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.3.4. Các thông số đặc trng của quá trình sắc ký
14
Cột
Binh
chứa
pha
động
Bơm
Detector
Bộ phận tự ghi
Van tiêm
mẫu
t
t
W
b2
0.5-2
W
0.5-1
W
b1
W
R2
R2

t'
t'
R1
R1
t
o
Hình 1.2: Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trng
Kết quả của quá trình tách các chất đợc detector phát hiện, phóng đại và
ghi thành sắc ký đồ với các thông số:
* t
R
(Thời gian lu): thời gian kể từ khi chất phân tích đợc bơm vào cột cho đến
khi đợc phát hiện ở nồng độ cựu đại của nó.
* t
0
(Thời gian chết): thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký.
* t
R

(Thời gian lu thực): t
R

= t
R
- t
0
* W
0.5
: Độ rộng của pic ở nửa chiều cao.
* W

b
: Độ rộng ở đáy pic.
Thời gian lu là thông tin về mặt định tính của sắc đồ, nó là một hằng số
đối với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong điều kiện không đổi.
1.3.4.1. Hệ số dung lợng k

[8],[14]
Nếu k' nhỏ thì t
R
cũng nhỏ và sự tách kém. Trong thực tế k' nằm trong khoảng 2 - 5 là tốt nhất.
Hai chất chỉ đợc tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá trị khác nhau. Trong phân
tích thờng chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1 < k' < 8
1.3.4.2. Độ chọn lọc

(selectivity - factor)
15
1
t
t
t
tt
t
't
'k
0
R
0
0R
0
R

=

==
=
tt
tt
'k
'k
01R
02R
1
2


=
(k
2
'
> k
1
'
) [8], [14]
khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối u từ 1,5 đến 2.
1.3.4.3. Độ phân giải (resolution)
Đặc trng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau đợc tính theo công thức:
=
R
( ) ( )

=
+

=
+

+
'k1
'k
ww
tt
ww
tt
B
B

A2/1B2/1
A,RB,R
AB
A,RB,R
1
4
N
18,12
[8], [14]
Độ phân giải cơ bản đạt đợc khi R = 1,5
1.3.4.4. Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó đợc tính theo công thức:
a2
AF
w
20/1
=
[8], [14]
Trong đó:
W
1/20
: là chiều rộng của pic đợc đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đờng vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đờng
cong phía trớc tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
Trong phép định lợng, yêu cầu: 0,9 AF 2 [1], [18], [22].
1.3.4.5. Số đĩa lý thuyết N
Đặc trng cho hiệu lực cột.
N = 16

w
t
B
R
2
hay N=5,54






w
t
B2/1
R
2
[8], [12], [22]
Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H đợc
tính bằng công thức:
=H
N
L
1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.3.5.1. Lựa chọn cột (pha tĩnh) [12], [18]
16