di truyền phân tử 03

Chơng 4 Biến dị Mutation
4.1 Đột biến gen
Đột biến (mutation) là sự biến đổi xuất hiện ngẫu nhiên (spontan) hay những
thay đổi số lợng và chất lợng rút ra qua thực nghiệm nhờ các gen đột biến
(mutagene). Ngời ta phân biệt các dạng đột biến: Đột biến gen (genmutation, đột
biến nhiễm sắc thể (chromosommutation), đột biến hệ gen (genommutation), đột
biến bào tơng (plasmonmutation) và đột biến bào quan (plastidenmutation).
Các tác nhân đột biến (mutagene) là những tác nhân (agent) hóa lý có khả
năng khởi phát đột biến gen và đột biến nhiễm sắc thể, và khả năng gia tăng tỷ
lệ đột biến ngẫu nhiên (spontane mutation rate). Thuộc vào những tác nhân đột
biến hóa học phải kể tới số nhiều các hợp chất có cấu trúc và hiệu quả khác
nhau nh nitrite, urethan, foraldehyd, peroxide. Thuộc về những tác nhân đột biên
lý học cần nói tới gồm tia ion hóa (tia X, tia tia

, tia neutron), ánh sáng tử
ngoại, sốc nhiệt độ (ABC Biologie, 1967, tr. 567).
Gen đột biến (mutatorgene) là hững gen có thể làm tăng tỷ lệ đột biến các
gen khác của hệ gen ở mức độ khác nhau.
Cá thể đột biến (mutant) là một cá thể mà kiểu gen (genotyp) của nó ít nhất
một vị trí bị biến đổi dẫn đến những sai khác kiểu hình (phenotyp) nhận biết đợc
hay đo lờng đợc so với kiểu hình bình thờng.
áp lực đột biến là sự gia tăng tần số các allen của gen trong quần thể bắt
nguồn từ tỷ lệ đột biến khác nhau của các allen của một gen. Khi tần số các đột
biến A sang a lớn hơn là từ a sang A thì tồn tại một áp lực đột biến đối với allen a.
Bởi các đột biến có giá trị chọn lọc (selection value) âm nên áp lực chọn lọc có
tác dụng chống lại áp lực đột biến [ABC Biologie, 1967, tr. 567].
Tỷ lệ đột biến là thành phần tơng đối những giao tử có đôt. biến gen hoặc đột
biến mới xuất hiện trong tổng số giao tử đợc kiểm tra của một thế hệ
(generation). Theo Timofeeff-Resovsky, mỗi thế hệ ruồi Drossophila có 2-3% số
con là chủ mang mang một hay vài gen đột biến mới. Theo Muller, ở ngời trong
mỗi thế hệ có 10-40% tế bào sinh dục là thể mang một đột biến mới xuất hiện

[ABC Biologie, 1967, tr. 567]. Tăng nhiệt độ thờng gây tăng tỷ lệ đột biến.
Tần số các đột biến gen ngẫu nhiên ở ngô (theo Stadler)
Gen Các tính trạng của hạt
Tế bào sinh dục
đã qua kiểm tra
Số đột biến
quan sát đợc
Tần số đột biến
trong 1 triệu tế bào
sinh dục
R
J
Pr
su
Y
Sh
Wx
(nhân tố nền mầu)
(nhân tố kìm mầu)
Rote Aleuronschicht
Zuckerhaltiges
Endospenn Gelbes
Endosperm
Geschrumpftes Kom
Wachsartiges Endosperm
554768
265391
647102
1678736
1745280

2469285
1503744
273
28
7
4
4
3
0
492
106
11
2,4
2,2
1,2
0
Trích từ ABC Biologie, 1967, tr. 567
Đơn vị đột biến (muton) là phần tử nhỏ nhất (nucleotid) của vật chất di truyền
mà sự biến đổi nó dẫn đến xuất hiện đột biến gen.
4.1.1 Biến dị không di truyền và di truyền
Biến dị không di truyền là những khác biệt tính trạng của cá thể không xuất
hiện ở những cá thể sau do cá thể đó sinh ra. Nguồn gôc những biến dị này
không do đột biến gen hay đột biến nhiễm sắc thể biểu hiện ra.
1
Biến dị di truyền là những tính trạng sai khác trên cá thể so với những cá thể
cùng thế hệ và thuộc thế hệ trớc vẫn lặp lại ở những cá thể các thế hệ sạu.
Sơ đồ hệ phả của một tính trạng lặn (bệnh gen lặn)
Thẹo.W. Harms, 1965, tr. 286
4.1.2 Phân loại đột biến
Đột biến gen (genmutation là những biến đổi xuất hiện ngẫu nhiên hoặc gây

ra bằng thực nghiệm trong thành phần phân tử của gen; chúng làm biến đổi hàm
lợng thông tin di truyền mã hóa hóa học (mã di truyền) và dẫn đến xuất hiện
những allen mới.
Đột biến nhiễm sắc thể (chromosommutation) là những biến đổi cấu trúc
NST xảy ra ngẫu nhiên hoặc nhận đợc qua thí nghiệm dới tác động của gen đột
biến dẫn đến đảo lộn đoạn NST nội trong một NST (đột biến NST nội tại:
intrachromosomal chromosommutation), giữa các NST khác nhau (đột biến NST
trao đổi: interchromosomal chromosommutation) hoặc do mất đoạn NST.
Tiền đề cho những đột biến NST là sự hình thành cầu nối giữa các cấu trúc
dọc của NST theo học thuyết Bruch-Reunion [ABC Biologie, 1967, tr. 165].
1: Xuất hiện vết cắt bỏ đoạn NST hoặc sự phục hồi đứt gẫy
2: Xuất hiện 2 dạng chuyển vị chromatid (bất đối xứng và đối xứng) hoặc sự phục hồi đứt gẫy.
Theo ABC Biologie, 1967, tr. 165
Đột biến hệ gen (genommutaion) là những biến đổi số lợng nhiễm sắc thể
dẫn đến đa bội chỉnh (polyploid: tất cả NST đợc nhân đôi) và đa bội lệch
(aneuroploid: chỉ một hay vài NST trong bộ NST đợc nhân đôi trong tế bào).
Đột biến kiểu bào tơng (plasmonmutation) là những biến đổi của vật chất di
truyền (plasmid = plasmagen) trong bào tơng hoặc ngẫu nhiên hoặc do những gen
đột biến. Đột biến kiểu bào tơng có nhiều nội dung khác so với những đột biến của hệ
gen. Một trong những khác biệt chính là số lợng đông các phần tử di truyền thuộc bào
tơng (plasmid = plasmagen) giống nhau, nh rất nhiều ty thể nh nhau (ở tế bào động
vật thực vật), hay nhiều lục lạp (ở ttế bào thực vật). Sự đột biến ở các phần tử di
truyền chỉ có thể đợc nhận biết sau sự làm giàu chọn lọc các đơn vị đột biến. Tiền đề
cho sự làm giàu kiểu này ìa giá trị chọn lọc dơng của các đơn vị đột biến. Không có gì
đáng ngạc nhiên là đột biến kiểu bào tơng rất khó phát hiện. Hơn nữa sự di truyền
kiểu bào tơng dựa trên 3 cơ sở chính: (1) Hệ thống di truyền các tính trạng quan sát
không tuân theo các định luật Mendel; (2) Những lai ghép thuận nghịch cho kết quả
những hậu duệ khác nhau vì bào tơng đợc truyền sang thực ra từ phía giới cái (trứng);
(3) do sự phân bố không đều các phần tử bào tơng khác nhau trong quá trình phân
bào nên có thể đa đến sự pha trộn vật chất di truyền (plasmagen) trong quá trình

phát triển cá thể.
2
4.1.3 Các phơng pháp phát hiện đột biến
Những đột biến gen hầu hết đều gây ra biến đổi phân tử phân tử protein đợc
biểu hiện thành tính trạng ở những cá thể đột biến của thế hệ sau. Để phát hiện
đột biến cần thiết các phơng pháp xác định trình tự nucleotid và xác định trình tự
acid amin ở các cá thể thế hệ trớc và thế hệ sau.
Các phơng pháp xác định trình tự nucleotid
Phơng pháp hóa học Maxam-Gilbert
Trớc hết đánh dấu phân tử ADN sợi kép tại đầu 5 , rồi dùng nhiệt phân
tách thành các sợi đơn. Sau đó xử lý hóa chất phá hủy nucleotid (ví dụ nu-A).
Kết qua đợc hàng loạt đoạn ADN kích thớc khác nhau. Các đoạn này đợc phân ly
trên gen polyacrylamid và chỉ những đoạn có gắn chất phát màu mới đợc phát
hiện trên phim (do nhuộm màu phim).
Xác định trình tự nucleotid bằng phơng pháp Maxam-Gilbert
-tiến hành 4 phản ứng độc lập dùng 4 hóa chất khác nhau
-Chạy điện di đồng thời sản phẩm trên 4 vị trí phân biệt của màng acrylamide
Đọc trình tự các đoạn nucleotid từ 5 lên 3
Phơng pháp men Sanger (tạo đầu tận của chuỗi: chain terminator method)
Sử dụng dideoxynucleotid không có OH ở vị trí 3 trong phản ứng tổng hợp
ADN. Do đó khi men ADN polymerase gắn chúng vào sợi ADN thì vì thế quá trình
tổng hợp bị dừng lại. Vì vậy còn gọi là phơng pháp dideoxy (dideoxy method).
3
Đầu tiên sợi đúp ADN (cần đọc trình tự nuc leotid) biến tính bởi nhiệt thành
hai sợi đơn và đợc lai với mồi (ddA-TP, ddT-TP.ddC-TP hay ddG-TP = dideoxy A-,
T-, C- hay G-triphosphat) có sự tham gia của men ADN-polymerase. Mỗi phản
ứng gồm (sợi khuôn ADN, mồi, men, 1 loại ddN-TP) và 4 loại dN-TP theo tỷ lệ
1/100. Sản phẩm của 4 phản ứng độc lập đợc đồng thời điện di trên gel
polyacrylamid tại 4 vị trí khác nhau. Các vạch ADN quan sát đợc nhờ có gắn P
32

vào mồi hoặc vào một trong 4 loại nucleotid (A, T, C và G) bình thờng.
Xác định trình tự nucleotid trên máy tự động
Trong những năm gần đây đã xuất hiện một số phơng pháp mới xác định
trình tự nucleotid bên cạnh phơng pháp thông thờng sử dụng các gel để phân ly
các đoạn ADN có độ dài khác nhau vài hoặc chỉ một nucleotid:
- Phát hiện huỳnh quang các nucleotid bị đánh dấu
- Xác định trình tự ADN bằng khối phổ
- Xác định trình tự ADN bằng lai với oligonucleotid nhân tạo
- Quan sát bề mặt ADN, phân biệt nucleotid bằng kính hiển vi điện tử
- Sử dụng tấm chip gắn các oligonucleotid (phân biệt > 50.000 pt ADN khác
nhau). Tơng lai có thể gắn hàng nghìn oligonucleotid lên một chíp nhỏ đa vào
phần mềm máy tính.
Phơng pháp tạo đầu tận cùng của chuỗi cải tiến cho phép đọc tự động trình
tự trên máy (automagic sequencing). Sử dụng các KIT khác nhau, trong đó đầu
tận cùng đợc gắn chất phát huỳnh quang (dye terminator sequencing). Phản ứng
gắn các nucleotid đánh dấu vào sợi ADN tổng hợp đợc tiến hành trên máy PCR
(còn gọi kỹ thuật chuỗi đọc trình tự: cycle sequencing). Sản phẩm từ PCR đợc
điện di bằng máy tự động trên gel acrylamid cho phép phân biệt các đoạn ADN
hơn kém nhau 1 nucleotid. Kết quả đợc phân tích bằng phần mềm máy tính
chuyên dụng.
Thông thờng 4 loại nucleotid đợc đánh dấu bằng các chất phát huỳnh
quang khác nhau. Đầu đọc laser kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và
phát màu; mỗi màu ứng với một loại nucleotid và đợc hiển thị bằng một đỉnh đồ
thị điện di. Phản ứng gắn nucleotid vào sợi ADN tổng hợp trên sợi khuôn đợc
thực hiện trên máy PCR (.). Hai loại nucleotid dG-TP và dT-TP đợc thay thế bởi
dI-TP và dU-TP nhằm hạn chế sự trùng lặp đỉnh. Sản phẩm PCR đợc tinh sạch,
loại bỏ nucleotid và primer (chất đệm) thừa trớc khi đa vào máy đọc. Các trình tự
đọc đợc trên máy tự động thờng dài 600-1000 bp.
u điểm của phơng pháp là kết quả đợc đa trực tiếp vào máy tính, giảm bớt
lỗi đọc bằng mắt; không đòi hỏi lợng ADN khuôn (dạng sợi kép) nhiều nhng các

sợi đơn cần đọc đợc khuyếch đại lên rất nhiều lần.
Trong chơng trình nghiên cứu hệ gen (của ngời hay arabidopsis ), hệ gen
đợc cắt bởi men giới hạn thành những đoạn lớn có đầu gối lên nhau. Chúng đợc
đa vào vector (plasmid hoặc BAC) và đợc lấy ra ngẫu nhiên để xác định trình tự.
Số liệu đọc đợc phân tích trên máy để tìm ra các đoạn trùng nhau. Khoảng trống
gap bất kỳ giữa các đoạn đã biết đ ợc xác định khi thiết kế primer dựa vào trình
tự hai đầu tận cùng của khoảng trống.
Trình tự hệ gen, các loại ADN (các đoạn ADN hệ gen, các cADN, các đoạn
đích EST expressed sequence tags của cADN ) đ ợc xác định ngày càng
4
nhiều đã thúc đẩy hớng nghiên cứu mới bio.informatic (tin sinh). Ba ngân hàng
dữ liệu chính lu giữ hầu hết các thông tin về ADN là EMBL (thuộc viện tin học
châu âu European informatic institude ), Genbank (thuộc trung tâm công nghệ
sinh học Mỹ US National Centre for Biotechnology) và DDBS (thuộc ngân
hàng dữ liệu của nhật DNA DataBase of Japan)
Phơng pháp ADN footprint
Phát triển dựa trên phơng pháp xác định trình tự, phơng pháp ADN
footprint cho phép xác định vị trí protein (protein điều khiển, factor phiên mã )
liên kết với ADN. Thông thờng các đoạn ADN ngoài vùng chứa mã di truyền có
protein bám dính giữ vai trò quan trọng (kiểm soát hoạt động của gen).
Tại vị trí liên kết có protein bám dính, đoạn ADN này không tạo ra sợi đơn
nên không quan sát đợc trên gen (khoảng trống = dấu vết
footprint ) trên băng điện di hiển thị vạch mầu.
Các phơng pháp xác định trình tự protein
Phơng pháp điện di trên thạch polyacrylamid chứa SDS (SDS-PAGE)
Điện di trên thạch polyacrylamid: với sự có mặt của sodium dodecylsulfat
(SDS) cho phép phân ly các phân tử protein có khối lợng khác nhau. SDS có
điện tích âm lớn khi ghép nối vào liên kết peptid tạo phức SDS-protein. Phức này
có độ âm điện khác nhau và đi chuyển khác nhau trên thâch polyacrylamid. Nh
vậy số lợng SDS tỷ lệ với khối lợng phân tử protein. Kết quả có thể phân lập các

protein có khối lợng phân tử khác nhau.
Điện di đẳng điện: Mỗi protein có điểm đẳng điện khác nhau nên có thể điện
di các mẫu protein trong du7ng dịc đệm có pH biến thiên liên tục.
Điện di hai chiều (2-D electrophoresis): Kết hợp hai phơng pháp trên chpo
phép phân đoạn, phân lập và xác định khối lợng protein.
Sắc ký khối phổ (mass spectrometry): protein đợc bơm vào cột sắc ký chứa
đệm dễ bay hơi.
Phơng pháp phân tích protein bằng phản ứng kháng nguyên-kháng thể
Phản ứng này có tính đặc hiệu cao, dùng để phát hiện và tinh sạch protein.
Kháng thể đợc tạo ra khi đa kháng nguyên vào thỏ và đợc tinh sạch từ máu thỏ
sau khi nhiễm. Đấy là những kháng thể đa dòng (polyclonal antibody; nhận biết
một số kháng nguyên) trong khi kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody) chỉ
nhận biết một kháng nguyên nhất định.
Kháng thể đợc đánh dấu bằng phóng xạ hoặc chất phát huỳnh quang để
phát hiện protein đặc hiệu nhờ kỹ thuật Western blot, immunoblot. Sự phân bố
của protein đặc hiệu trong tế bào, tổ chức mô có thể đợc phát hiện nhờ kỹ thuật
5
lai in situ (giống nguyên tắc của Western blot). Ngoài ra kháng thể còn đ ợc
dùng để tinh sạch protein đặc hiệu nhờ phản ứng kết tủa miễn dịch hoặc bằng
sắc ký ái lực. Kháng thể đánh dấu đợc dùng để đánh giá về số lợng kháng
nguyên trong kỹ thuật ELISA (enzymelinked immunosorbent asay)
Phơng pháp xác định trình tự acid amin (cấu trúc bậc I của protein
Gián tiếp qua phân tích trình tự cADN tơng ứng chuỗi peptid đó. Phơng pháp
này thờng không thật chính xác do tính bị thoái hóa của ADN t ơng ứng protein
đó.
Phơng pháp phân hủy Edman (Edman degradation) cho phép trực tiếp xác
định cấu trúc bậc I của protein. Trong đó acid amin cuối cùng đợc đánh dấu và
cắt ra để xác định. Mỗi phản ứng thờng 50 acid amin/chuỗi, do vậy trớc khi đọc,
các chuỗi dài thờng đợc cắt ngắn bằng protease đặc hiệu hoặc hóa chất đặc
hiệu; ví dụ hydroxylamin cắt đặc hiệu liên kết asparagin-glycin.

Máy đọc trình tự acid amin đợc kết nối với sắc ký lỏng cao áp cho phép xác định
trình tự của protein cỡ pM (tơng đơng lợng protein có thể thu đợc từ điện di trên thạch
acrylamid) [Võ Thị Thơng lan, sinh học phân tử, 2002, tr.201-202.
4.1.4 Cơ chế phân tử của đột biến
Chuỗi kép polynucleotid là cấu trúc cơ sở của một gen. Cơ chế phân tử của
đột biến gen dựa vào sự biến đổi tại một nucleotid của chuỗi đơn mang mã di
truyền (bộ ba nucleotid = triplette). Do đặc điểm cấu tạo hóa học nên chỉ có sự
thay thế giữa nucleotid AG và TC, trong khi sự chèn thêm hay cắt bỏ
nucleotid không lệ thuộc vào loại A, G, T hoặc C.
Để tiện theo dõi cơ chế phân tử của đột biến gen cần dựa vào bảng mã phiên
đợc đa ra dới đây.
U C A G
u
uuu
Phe UCU Ser UAU Tir UGU Cys
U
uuc
Phe UCC Ser UAC Tir UGC Cys
C
UUA Leu UCA Ser UAA KT UGA KT
A
UUG Leu UCG Ser UAG KT UGG Trp
G
c
CUU Leu ecu Pro CAU His CGU Arg
U
cuC Leu CCC Pro CAC His CGC Arg
C
CUA Leu CCA Pro CAA Gin CGA Arg
A

CUG Leu CCG Pro CAG Gin CGG Arg
G
A
AUU Ile ACU.
Thr
AAU Asn AGU Ser
U
AUC Ile ACC Thr AAC Asn AGC Ser
C
AUA Ile ACA Thr AAA Lis AGA Arg
A
AUG Met
ACG
Thr AAG Lis AGG Arg
G
G
GUU Val GCU Ala GAU Asp GGU Gli
U
GUC Val GCC Ala GAC Asp GGC Gli
C
GUA Val GCA Ala GAA Glu GGA Gli
A
GUG Val GCG Ala GAG Glu GGG Gli
G
6
Tùy theo hậu quả của đột biến gen có thể phân biệt những dạng đột biến:
đột biến sai nghĩa, đột biến vô nghĩa, đột biến thoái hóa và đột biến dịch khung.
(1) Đột biến sai nghĩa: Khi thay thế một cặp nucleotid (ví dụ cặp G-C bằng
cặp A-T) dẫn đến thay đổi loại acid amin tại vị trí tơng ứng với bộ ba mã
cho acid amin tại vị trí đó.

Chuỗi Trình tự cha đột biến Trình tự sau đột biến
Gen 3AGT-CAA-GGT-TGC-CAT-5 3AGT-CAA-GGT-TAC-CAT-5
m-ARN 5UCA-GUU-CCA-ACG-GUA-3 5UCA-GUU-CCA-AUG-GUA-3
Protein
Ser-Val-Pro-Thr-Val- Ser-Val-Pro-Met-Val-
(2) Đột biến vô nghĩa: Thay thế cặp A-T bằng cặp G-C tại bộ ba thứ 3 trên
ADN dẫn đến thay đổi mã bộ ba có cặp nucleotid bị thay đổi. Bộ ba mới
vẫn mã cho acid amin nh bộ ba cũ.
Chuỗi Trình tự cha đột biến Trình tự sau đột biến
Gen 3AGT-CAA-GGT-TGC-CAT-T5 3AGT-CAG-GGT-TGC-CAT-T5
m-ARN 5UCA-GUU-CCA-ACG-GUA-3 5UCA-GUC-CCA-AUG-GUA-3
Protein
Ser-Val-Pro Thr Val-
Ser-Val-Pro Thr Val-
(GUC cũng mã cho Val nh GUU)
(3) Đột biến thoái hóa: Do mất cặp (ví dụ cắt bỏ cặp G-C) trong ADN dẫn đến
tổ chức mới trình tự các bộ ba từ vị trí mất cặp G-C và có thể xuất hiện
mã kết thúc làm thay đổi loại và trình tự amin cũng nh giảm số lợng acid
amin trong protein mới.
Chuỗi Trình tự cha đột biến Trình tự sau đột biến
Gen 3AGT-CAA-GGT-TGC-CAT-T5 3AGT-CAA-GTT-GCC-ATT5
m-ARN
5UCA-GUU-CCA-ACG-GUA-A3
5UCA-GUU-CAA-UGG-UAA3
(UAA là mã kết thúc)
Protein
Ser-Val-Pro-Thr-Val-
Ser-Val-Gln-Trp
(thay đổi loại và ít hơn 1 a. amin)
(4) Đột biến dịch khung: cắt bỏ cặp C-G của bộ ba thứ 3 trên gen dẫn đến tổ

chức lại các bộ ba kể từ vị trí đó; hậu quả là làm thay đổi loại, số l ợng các
acid amin trong chuỗi polypeptid ban đầu.
Chuỗi Trình tự cha đột biến Trình tự sau đột biến
Gen
3AAC-ACA-CAG-GTT-CAA-AGG-AGC5 3AAC-ACA-AGG-TTC-AAA-GGA-GC5
m-ARN
5UUG-UGU-GUC-CAA-GUU-UCC-UCG3 5UUG-UGU-UCC-AAG-UUU-CCU-CG3
Protein
Leu-Cys-Val-Gly-Val-Trp-Ser-
Leu-Cys-Ser-Lys-Trp-Pro-
(thay đổi loại và ít hơn 1 a. amin)
Cơ chế đột biến gen trên một nhiễm sắc thể có thể phân làm các bớc:
1)- Men topoisomerase mở xoắn chuỗi kép ADN
2)- Một men giới hạn (nuclease) cắt liên kết peptid giữa hai nucleotid tại một
hoặc hai vị trí trên gen.
3)- Tách rời liên kết hydro giữa hai mạch, gỡ nucleotid ra và thay thế, ghép
thêm hoặc loại bỏ nucleotid ban đầu.
4)- Men ligase nối lại mạch nucleotid đã bị cắt đứt .
4.1.5 Đột biến nhân tạo hay cảm ứng và hồi biến
7
4.2 Đột biến cấu trúc và số lợng nhiễm sắc thể
4.2.1 Đột biến cấu trúc trên một nhiễm sắc thể (ADN)
Đột biến gen thờng rất hay là hậu quả của những biến đổi của một cặp
nucleotid duy nhất nội trong đoạn acid nucleic diễn đạt gen chức năng. Khi đó
hoặc một purin base hay một pyrimidin base bị thay thế bởi purin hoặc
pyrimidin base khác (transition: chuyển đổi). Cũng có thể một purin base đợc
đổi (transversion: trao đổi) bằng một pyrimidin base (hay ngợc lại). ở cả hai tr-
ờng hợp, trật tự nucleotid bị biến đổi trong sự bảo tồn số lợng nucleotid nguyên
thủy. Sự mất đi (-) hay sự chèn thêm (+) các nucleotid trong vùng một gen cùng
khởi sinh những đột biến gen dẫn đến sơ đồ đọc từ một điểm bắt đầu cố định của

mã di truyền bị thay đổi [ABC Biologie, 1967, tr.295].
Thay thế nucleotid
Thêm nucleotid
Bớt nucleotid
Đảo đoạn nucleotid trong một gen
8
Trao đổi đoạn nucleotid
4.2.2 Đột biến cấu trúc giữa các nhiễm sắc thể
Tùy theo dạng biến đổi cấu tạo mà những đột biến NST đợc gọi là đột biến
đảo vị (inversion: đảo vị một đoạn tại chỗ), đột biến đổi vị (translocation: chuyển
vị một đoạn sang NST khác), đột biến mất đoạn (deletion: mất một đoạn ở giữa
NST), đột biến cắt đuôi (deficiency) và đột biến nhân đôi (duplication: tái bản
một đoạn của NST đơn bội).
Thêm đoạn NST
Tái tổ hợp đặc hiệu phát hiện lần đầu tiên ở E. coli. Khi xâm nhập tế bào chủ,
men integrase của phage (thể thực khuẩn) và protein IHF của tế bào chủ liên kết
với vị trí đặc biệt trên -ADN (của phage) và bám vào hệ gen của tế bào vi
khuẩn. Lúc này xảy ra trao đổi chéo giữa hai genomee (phage và E. coli); Phage
có thể ở dạng tiềm tan.
Tùy theo chiều sắp xếp của các vị trí đặc hiệu trên ADN mà trao đổi chéo
đặc hiệu có thể diễn ra theo 3 cách khác nhau:
Trao đổi chéo đặc hiệu ngoại phân tử (intermolecular site-specific recombination):
sự ghép vào hoặc tách ra giữa hai phân tử ADN (ví dụ nh ghép -ADN vào
genome của E. coli).
Cơ chế tái tổ hợp đặc hiệu ở E. coli
Trao đổi chéo đặc hiệu nội phân tử (intramolecular site-specific recombination):
giữa các đoạn nucleotid lặp lại cùng chiều hay ngợc chiều của một phân tử ADN.
Ví dụ sự trao đổi chéo đặc hiệu tại vùng G (3000 bp) của phage Mu. Đoạn G (có
34 nucleotid lặp lại ngợc chiều ở hai đầu) có khả năng đổi chiều ngay tại vị trí của
9

mình. Sự đổi chiều của G phụ thuộc hai đoạn lặp lại này và protein GIN (mã bởi
gen gin).
Trao đổi chéo giữa hai chuỗi lặp lại ngợc chiều gixL và gixR gây ra sự đổi
chiều đoạn G. Do vậy hoạt động của các gen S và U bị thay thế bởi S và U .
Sản phẩm của hai cặp gen này của Mu qui định giới hạn tế bào chủ E. coli.
Bớt đoạn NST
Trao đổi gen do tái tổ hợp chung
Trao đổi chéo đoạn NSTử (gen E) giữa hai NST tơng đồng
Đoạn e không bổ sung với E, đ ợc cắt bỏ
Đoạn E đợc dùng làm khuôn tổng hợp E
Trao đổi gen do tổng hợp ADN có giới hạn
Thay thế gen giữa hai NSTử của một NST
do tổng hợp ADN có giới hạn
Trao đổi đoạn NST
Sự trao đổi chéo đoạn ADN (crossing-over) cũng dựa trên thuyết Bruch-Reunion
và diễn ra ở cuối kỳ đầu của phân bào giảm phân (meiose). Hiện tợng này diễn ra
theo nhiều dạng khác nhau, tùy xem NST nào trong thể tứ bắt chéo nhau.
10
Theo ABC Biologie, 1967, tr. 169
Quá trình tơng tự nhau ở virus, vi khuẩn cũng nh ở nấm và gồm các bớc chính:
(1) Hai phân tử ADN bị bẻ gẫy, (2) Vị trí đứt gẫy nằm bất kỳ trên đoạn nucleotid tơng
đồng, (3) trao đổi hai sợi đơn của hai phân tử ADN, (4) cắt nối mạch bổ sung giữa hai
đoạn sợi đơn ADN để hoàn chỉnh hai phân tử ADN dị hợp kép (heteroduplex join).
Trao đổi đoạn ADN ở Eucaryota
Tại vị trí nối dị hợp có thể xảy ra lỗi tạo cặp base; Lỗi này đợc khắc phục nhờ cơ
chế sửa chữa ADN. Nhóm protein RAD (trong đó có RAD51 rất tơng đồng với RecA
của E. coli) tham gia trao đổi chéo ở Eucaryota đợc phân lập đầu tiên từ tế bào nấm
không có khả năng sửa chữa ADN hoặc bị rối loạn phân bào nguyên phân. Sau đó
các dạng tơng đồng với RAD51 tìm thấy ở ruồi giấm, chuột và ngời. Gen mã cho các
dạng RAD51 đều đợc hoạt hóa khi ADN bị tổn thơng.

Gen DST1 (thuộc họ gen rad51) mã cho sản phẩm chỉ có vai trò trong mitose.
Gen rad50 mã cho protein tơng tác với ADN (sửa chữa ADN bị đứt gẫy của tế bào
soma nhng kích thích đứt gẫy ADN trong tế bào meiose).
Gen rad52 mã cho protein RAD52 cần cho tái tổ hợp chung ở cả tế bào soma và
tế bào sinh dục.
Trên vi khuẩn E. coli phức protein Rec-BCD (có hoạt tính nuclease và
helicase) có khả năng tạo vết đứt trên sợi đơn ADN và giải phóng sợi này khỏi
cấu trúc kép (cần ATP).
11
Trao đổi đoạn mạch đơn ở Eucaryota
Trao đổi chéo thờng đợc khởi động tại vị trí Chi (trình tự GCTGGTGG); cứ
khoảng 5 kb lại có một vị trí nh vậy. Phức Rec-BCD nhận biết vị trí này và cắt
liên kết bổ sung cách đấy khoảng 5 nucleotid về phía đấu 3 . Sau đó helicase t -
ơng tác với ADN để mở xoắn tạo sợi đơn. Protein Rec-A nhận biết sợi đơn tạo
phức nucleo-protein. Khi tìm thấy đoạn tơng đồng trên NST, phức này (Rec-
AADN dạng đơn) mở xoắn và tạo liên kết bổ sung giữa sợi đơn của phức với
một trong hai sợi đơn của NST.
Trao đổi chéo sợi đơn giữa hai đoạn ADN tơng đồng ở Procaryota
4.2.3 Đa bội thể chỉnh (polyploid) và đa bội thể lệch (aneuploid)
Đa bội thể chỉnh
Tế bào hợp tử do lai 2 loài khác nhau nên các nhiễm sắc thể không tạo cặp t-
ơng đồng. Các NST đơn tái bản tạo thành thể tứ (cặp NST với 4 sợi nhiễm sắc)
Lai cá thể 2 loài A x B
Xuất hiện con lai loài
lỡng bội gầy nhỏ
Nhân đôi ngẫu nhiên hay nhân tạo số lợng NST
tạo dạng đa bội khác loài (alloploid) béo tốt
Phỏng theo ABC Biologie, 1967, tr.295
Đa bội thể lệch
Nguồn gốc của đa bội lệch (aneuploid) chủ yếu do rối loạn phân ly cặp NST kép

tơng đồng trong phân bào (meiosis và mitose). Hiện tợng này gọi là non-disjunction.
12
Meiose diễn biến bình thờng
Mitose diễn biến bình thờng
Meiose diễn biến bất thờng
Mitose diễn biến bất thờng
Phỏng theo ABC Biologie, 1967, tr.295
4.3 Cơ chế sửa sai và bảo vệ nhiễm sắc thể
Đột biến tự phát ở mức ADN đợc đánh giá thông qua xác định mức sai khái
về tỷ lệ các acid amin của một loại protein ở những loài sinh vật khác nhau hoặc
gần đây bằng xác định trình tự nucleotid ở một số vùng genome không chứa mã
di truyền. Cả hai phơng pháp đều cho kết quả thời gian cần thiết cho đột biến tự
phát mức ADN (đột biến tự phát 1 acid amin của protein với 400 acid amin) là
200.000 năm.
Tỷ lệ cá thể đột biến mức ADN (ruồi giấm, vi khuẩn nuôi cấy, ) là 10
-9
/thế
hệ. Ngay với tỷ lệ đột biến rất thấp thì số loại protein quan trọng trong tế bào đã
là 60.000 loại khác nhau. Khi tỷ lệ đột biến tăng gấp 10 thì số loại protein chỉ còn
6.000 loại khác nhau.
Để bảo toàn đặc tính của loài nhất thiết bảo vệ ADN chứa trong tế bào sinh
dục (không để xảy ra đột biến tự phát với tần số cao) cũng nh trong tế bào sinh
trởng (soma-cyte) tránh gây rối loạn phát triển hay chết do ung th.
Theo quan điểm hóa lý thì ADN chịu rất nhiều đột biến tự phát do biến động
nhiệt hoặc do tác động của các phân tử dung môi: mỗi ngày, ADN của một tế bào
mất đi 5000 purin (adenin và guanin), và 1000 cytosin chuyển thành uracin.
Ngoài ra dới tác động tia tử ngoại rất nhiều dimer (giữa hai thymin, ). Rõ ràng
cấu trúc ADN phải chịu đột biến tự phát với tần số khá cao.
4.3.1 Khái quát về cơ chế sửa sai
Do những nhân tố bên ngoài và bên trong mà cấu trúc và hoạt động của gen

để lại những sai lầm, thiếu sót ảnh hởng khác nhau tới sự tồn tại và phát triển
của cơ thể nói chung và của tế bào nói riêng. Ngay trong tế bào, ngoài những
đoạn ADN tham gia vào hệ thống điều hòa hoạt động của gen còn có những men
đợc tổng hợp từ tế bào (của nhiều loài khác nhau) có khả năng khác nhau, trong
đó có những khả năng tham gia vào hệ thống sửa chữa ADN.
ADN trong trạng thái không tái bản (nhân đôi) thờng xuyên đợc kiểm soát bởi
gần 50 loại men chuyên phát hiện và sửa chữa các sai sót trong ADN. Những sai
sót cha kịp sửa chữa trở thành vật liệu đột biến gen gây ảnh hởng tới sự biểu
hiện của gen (sinh ra tế bào đột biến hay ca sthể đột biến) khi tham gia phân
bào.
Nhằm bảo vệ chính mình và các thế hệ sau, ADN có cơ chế tái bản và tự sửa
chữa bằng nhiều cách thức khác nhau: (1) phục hồi trực tiếp direct reveral
repair ; (2) cắt bỏ sai hỏng và sửa chữa theo trình tự bổ sung damage excision
ADN repair using complimentar sequence ; (3) chống chịu các tổn th ơng có thể
có inducible damage tolerance .
13
Tổng hợp các enzym sửa chữa ADN
Các enzym tham gia sửa chữa đợc tổng hợp ngay sau khi đột biến xảy ra
Cơ chế đáp ứng các tín hiệu cấp cứu (SOS response) ở E. coli đợc nghiên cứu
khá chi tiết. Dừng tổng hợp ADN do lỗi ở ADN khuôn đều tạo ra tín hiệu làm tăng
cờng hoạt động của hơn 15 gen bao gồm các gen tham gia sửa chữa ADN. Quá
trình diễn ra nh sau:
+ Đầu tiên các tín hiệu hoạt hóa protein RecA
+ RecA hoạt hóa phân giải protein ức chế các gen thuộc cơ chế SOS giúp
tăng cờng phiên mã các m-ARN tơng ứng các gen này.
+ Protein đợc tổng hợp thông qua dịch mã các m-ARN này có hai tác dụng:
một là tăng lợng enzym của các quá trình sửa chữa ADN; hai là tăng lợng protein
thuộc cơ chế SOS làm tăng tỷ lệ đột biến (do các gen mã cho chúng cũng chịu
đột biến). Điều này không có lợi trớc mắt nhng về lâu dài lại có lợi vì làm tăng
tính đa dạng di truyền trong quần thể vi khuẩn. Nhờ đó tỷ lệ tế bào đột biến khỏe

mạnh và thích ứng môi trờng cũng tăng theo.
Dù cơ chế sửa sai thế nào nhng vẫn phải sử dụng nhiều loại men cho mỗi
khâu của từng cơ chế. Hệ thống men có thể chia thành các nhóm chính:
- Nhóm nuclease: cắt và phá hủy ADN
- Nhóm ADN-ligase: nối các sợi đơn ADN với nhau
- Nhóm ADN-polymerase: tổng hợp sợi polynucleotid
- Nhóm topoisomerase: mở xoắn ADN
- Nhóm reverse-transcriptase: phiên mã ngợc từ mARN thành cADN
Nhóm mở xoắn ADN-topoisomerase: mở xoắn ADN
Nhóm men tổng hợp ADN và ARN
Tham gia phiên mã ARN và tái bản ADN theo chiều từ 5 =>3 , gồm các men:
1)- Taq-polymerase (tách từ vi khuẩn suối nớc nóng : T

hermus aq

uticus) có
khả năng chịu nhiệt. Hiên nay đã tách dòng và biểu hiện gen mã cho men này,
do vậy có thể tạo ra lợng lớn men này bằng công nghệ ADN tái tổ hợp.
2)- ADN-polymerase I: ngoài chức năng tổng hợp còn có chức năng
exonuclease phân hủy sợi không làm khuôn trong thời điểm polymerase đang
tổng hợp sợi mới trên sợi khuôn.
3)- Men phiên mã ngợc (reverse Transcriptase): dùng ARN làm khuôn tổng
hợp cADN để tách dòng.
4)- T4-ADN-polymerase (nguồn gốc từ phage T4, hoạt tính giống hoạt tính
đoạn Klenow) để tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao vì hoạt tiónh
exonucleasse 3 -5 có hoạt tính mạnh hơn T4-ADN-polymerase.
5)- Terminal transferase (chiết từ tuyến ức bò): xúc tác gắn deoxynucleotid
vào đầu 3 -OH tự do của ADN, đ ợc sử dụng để thêm đuôi polynucleotid tạo đầu
so le cho ADN khi tạo dòng.
6)- Alkali-phosphatase: chiết từ E. coli hoặc từ ruột bò, có nhiệm vụ cắt nhóm

5 phosphat của ADN, ARN và của các nucleotid tự do để sau đó đánh dấu phóng xạ
bằng
32
P; để cản không cho vector ghép trở lại khi đã bị để lộ bởi men giới hạn.
7)- T4-polynucleotid-kinase có nguồn gốc từ phage T4, xúc tác cho phản ứng
thêm gốc phosphats vào đầu 5 của ADN, ARN. Đ ợc dùng để đánh dấu phóng xạ
(kỹ thuật xác định trình tự ADN) và phosphoryl hóa đầu 5 ADN (chuẩn bị cho
phản ứng nối của kỹ thuật tạo dòng).
Nhóm men nối đoạn - ADN-ligase:
14
Nối đoạn để sửa chữa các ADN bị đứt trong lỗi ngẫu nhiên hoặc, tái bản và
tái tổ hợp ADN. Thờng các ADN-ligase đợc sử dụng phối hợp với Alkali-
phosphatase và T4 polynucleotid-kinase. Hoạt động tốt ở 37
0
C (cả ở 4-15
0
C).
1)- E. coli-ADN-ligase (tách chiết từ E. coli) xúc tác cho phản ứng nối ADN có
đầu dính (sole)
2)- T4-ADN-ligase từ phage T4 kí sinh trong E. coli, nối ADN đầu bằng, sử
dụng nhiều trong kỹ thuật tạo dòng.
3)- T4-ARN-ligase từ phage T4 ký sinh trong E. coli, nối hai đoạn ARN bằng
liên kết phosphodiester, sử dụng nhiều trong đánh dấu phóng xạ đầu 3 trong kỹ
thuật sản xuất mẫu dò (probe)
Nhóm nuclease các nhóm men giới hạn
Gồm 3 nhóm I, II và III; trong đó các men giới hạn đợc dùng phổ biến ngày
nay thuộc nhóm II với cơ chế tác động đợn giản nhất (cắt tại vị trí nằm bên trong
sợi ADN) và không phân hủy từ hai đầu nên còn đợc gọi là endonuclease.
Đặc điểm của các loại men giới hạn
Đặc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III

Khả năng metyl hóa
gốc Adenin
+ _ +
Điều kiện để cắt
ATP, Mg
++
,
S-Adolmet
Mg
++
hoặc Mn
++
Mg
++
,
S-Adolmet
Cấu trúc của men
(số chuỗi polypeptid)
Khác nhau Giống nhau Khác nhau
Gọi tên các men giới hạn theo quy ớc quốc tế: chữ cái đầu tên chi- 2chữ cái
tên loài-chữ cái tên dòng-chữ số của nhóm sinh vật:
Ví dụ: EcoRI :men giới han (RE = restriction enzym) tách từ E. coli, dòng R, nhóm I
BamHI: tách từ Bacillus amiloliquefaciens, dòng H, nhóm I
Hin DIII: tách từ Haemophilus influencae, dòng D, nhóm III
Men giới hạn có tính đặc hiệu. Mỗi men cụ thể nhận biết một đoạn trình tự
đặc hiệu trên ADN. Các bđoạn ADN đặc thù này có chiều dài 4-8 bp (bp: base
pair = cặp bazơ). Các đoạn này đợc lặp lại dọc phân tử ADN; khoảng cách lặp lại
là 4
4
= 256 bp (với đoạn nhận biết dài 4 bp), là 4

5
= 1024 bp (với đoạn nhận biết
dài 5 bp) hay là 4
6
= 4096 bp (với đoạn nhận biết dài 6 bp),
Loại hình của các đoạn ADN do men giới hạn tạo ra tùy thuộc trình tự đoạn
nhận biết và vào vị trí cắt trong trình tự này. Có hai dạng đầu tận của đoạn ADN
bị cắt ra là đầu bằng (blunt end) và đầu so le (sole-cobesive end, còn gọi là đầu
dính với đầu 3 nhô ra hoặc đầu 5 nhô ra).
Tính năng cắt của một số men nuclease
Đầu bằng Đầu dính 5
Men Đoạn nhận biết điểm cắt Men Đoạn nhận biết điểm cắt
AfuI AG.GCT => AG + GCT BanhI G.GATCC => G + GATCC
HeaII GG.CC => GG + CC BgII A.GATCT => A + GATCT
HndII GTPy.PuAC => GTPy + PuAC CfaI AT.CGAT => AT + CGAT
SmaI CCC.GGG => CCC + GGG Ecofd G.AATTC => G + AATTC
HndII A.ACCTT => A + ACCTT
HpaII C.CGG => C + CGG
MboI .GATG => . + GATG
15
Men Đoạn nhận biết điểm cắt
PruI CGAT.CG => CGAT + CG
Đầu dính 3 AruI CGAT.CG => CGAT + CG
KpnI GGTAC.G => GG TAC + G XmaI C.CCGGG => C + CCGGG
PstI CTGCA.G => CTGCA + G NotI GC.GGCCGC => GC + GGCCGC
Cho đến nay đã tách đợc hơn 1200 men giới hạn nhóm II. Sau khi sử dụng
men giới hạn có thể đa các mẫu vào chạy điện di trên thạch sẽ thu đợc các băng
hiển thị các đoạn ADN với chiều dài (kích thớc) khác nhau. So sánh với băng
điện di mẫu ADN chuẩn và kết quả phân tích sẽ cho trình tự các đoạn nhỏ ADN
cấu tạo nên phân tử ADN cần kiểm tra. Ngoài sử dụng men giới hạn để lập bản

đồ giới hạn còn để tạo ADN tái tổ hợp.
Quy trình lập bản đồ cắt hạn chế
1)- mục tiêu: sự đa dạng KH ở 1 quần thể
2)-Tách chiết ADN từ các mẫu
3)- Sử dụng men giới hạn cắt mẫu ADN
4) Điện di trên thạch polyacrylamid
Một tính chất cắt khác của men nuclease là khi sử dụng riêng rẽ một loại men
thì ADN bị cắt thành 2 mảnh với độ dài khác nhau. Nhng khi sử dụng phối hợp nhiều
loại men thì ADN bị cắt thành rất nhiều mảnh nhỏ hơn kích thớc khác nhau.
1)- ADNse-I: cắt liên kết ngay sau các base pyrimidin (T, C) trên mạch đơn
hay kép, dùng để phá hủy (loại bỏ) ADN trong chế phẩm ARN và protein, tạo
điểm đứt trong kỹ thuật mẫu dò.
2)- Nuclease SI (tách từ Aspergillus orycae) phân giải ADN mạch đơn hoặc
kép, dùng để phân tích đặc điểm cấu trúc phân tử lai ADN-ARN, loại bỏ đầu so le
để tạo đầu bằng, loại bỏ các nút vòng trên ARN trong phản ứng phiên mã ngợc
tạo cADN.
3)- Exonuclease III (từ E. coli) phân giải lần lợt các nucleotid từ đầu 3 -OH tự
do của ADN theo chiều từ 3 -5 tạo ra vùng mạch đơn trên ADN tạo đột biến mất
đoạn khi phối hợp với nuclease SI.
4)- ARNse-A có hoạt tính mạnh, chịu đợc nhiệt độ 90
0
C trong 60 phút, cắt
liên kết phosphodiester ngay sau base pyrimidin (C, U) của ARN, dùng để loại
bỏ ARN trong chế phẩm ADN hoặc protein, loại hỏ các đoạn không ghép cặp
trên phân tử lai ARN-ADN.
5)- Loại bỏ ARN trong phân tử lai ARN-ADN, dùng để loại bỏ ARN trong
phiên mã ngợc trớc khi tiếp tục tổng hợp mạch thứ hai của cADN tạo ADN mạch
kép.
16
4.3.2 Các kiểu sửa sai

Phục hồi trực tiếp
[1] Sử dụng photolyase: Tia tử ngoại gây ra hai sai hỏng là cyclobuta-
pyrimidin dimer (CPDs) và pyrimidine 6-4
pyrimidone (6-4PPs). Các enzym photolyase
nhận biết sai hỏng này và sửa chữa nhờ năng l-
ợng ánh sáng để hóa giải cấu trúc dimer thành
cấu trúc bình thờng. Phơng thức này cha phát
hiện ở động vật có vú và ở ngời.
[2] Sử dụng ADN polymerase và protein

: vợt
qua đợc sai hỏng trong quá trình tái bản ADN. Tuy
nhiên tính chính xác của phơng thức có nhiều hạn
chế.
[3] Sử dụng trình tự nucleotid: Sai sót trên
một mạch thì sửa chữa dựa trên trình tự
nucleotid mạch bổ sung; sai sót cả đoạn 2 mạch thì
dựa trên đoạn tơng đồng trong ADN. Phơng
thức gồm các bớc:
+ ADN nuclease nhận biết và cắt bỏ sai
hỏng
+ ADN polymerase nhận biết gốc 3 -OH (vị trí cắt bỏ) và gắn nucleotid (t ơng
ứng mạch bổ sung).
+ ADN ligase nối sợi ADN với đoạn nucleotid mới hình thành.
Phơng thức loại bỏ base hỏng:
Mỗi loại enzym ADN glycosylase nhận biết một loại base đột biến (nh vậy có
tới 6 loại men). Cắt base hỏng (bị khử amin, vỡ liên kết vòng, liên kết đôi C=C-
biến đổi thành liên kết đơn C-C-) ra khỏi ADN nhờ phân hủy liên kết N-
glycosidic giữa đờng và base. Khi ấy phần tử đờng bị bộc lộ và vị trí đó gọi là AP
vì nó đợc nhận biết bởi men AP-endonuclease. Sau đó ADN đợc sửa chữa bởi

ADN polymerase và ADN ligase. Ví dụ mô tả trong hình dới đây:
Cơ chế sửa chữa base hỏng (BER = base excision repair)
Phơng thức loại bỏ nucleotid hỏng (NER = nucleotid excision repair):
Chỉnh sửa các liên kết dimer T-T, T-C hoặc C-U, thậm chí chỉnh sửa cả một
đoạn nucleotid sai hỏhongrCaanf nhiều enzym để phát hiện lỗi, clooixhai đầu
đoạn lỗi bằng enzym heliase và cuối cùng đoạn trống đợc gắn các nucleotid bổ
sung theo mạch ADN không lỗi bởi các enzym ADN polymerase và ADN ligase.
ở Procaryota: vi khuẩn có 3 men là UvrA, UvrB và UvrC liên quan đến cơ
chế NER. 2 UvrA tạo phức với 1 UvrB giúp UvrB bám dính vào ADN. Phân giải
ATP tạo năng lợng làm cho UvrA tách khỏi ADN. UvrC phối hợp với phức UvrB-
ADN làm cấu trúc ADN thay đổi và nhờ thế UvrB cắt mạch ở đầu 3 và UvrC cắt
mạch ở đầu 5 của vị trí h hỏng. Nh vậy phức UvrA B C cắt một đoạn mạch gồm
12 nucleotid. Đoạn này bị loại khỏi ADN bởi UvrD có hoạt tính heliase.
17
Cơ chế sửa chữa NER ở vi khuẩn (Procaryota)
Phức endonuclease UvrA-B-C phối hợp với protein mã bởi gen thuộc cơ chế
SOS có thể cắt bỏ đoạn ADN chữa lỗi dài từ 12 đến 2000 bp. Phức UvrA-B-
C//protein mfd phối hợp với phc ARN-polymerase//ADN chứa lỗi có thể giúp phức
này vợt quavị trí lỗi. Phức protein mfd//UvrA có thể thúc đẩy UvrA-B bám dính
vào vị trí ADN Lỗi.
ở Eucaryota: cơ chế NER tơng tự nh ở vi khuẩn. Tuy nhiên thờng đoạn ADN
bị cắt bỏ dài 30 bp và hiếm trờng hợp dài đến 1500 bp.
Cơ chế sửa chữa nucleotid hỏng (NER = nucleotid excision repair)
sửa chữa adn lỗi ghép cặp mismatch repair
Nguyên nhân lỗi: trong sự tái bản và trao đổi chéo ADN
Khi bị lỗi, một số protein đặc biệt làm nhiệm vụ dừng tổng hợp ADN.
Sửa lỗi cần các protein MutS, MutL, MutH và UvrD
+ Protein MutS: nhận biết vị trí lỗi, tạo phức MutS-MutL-MutH
+ Protein MutL: cùng phức MutS-MutL-MutH bám dính vào vị trí lỗi
+ Protein MutH: cắt đầu 5 tại ví trí G của chuỗi GATC (không chứa CH

3
)
Phối hợp tao phức MutS-MutL-MutH và cần cả ATP (năng lợng)
+ Protein UvrD: (helicase) dỡ bỏ đoạn có lỗi theo chiều 3 5
18
Tiến trình sửa chữa ADN lỗi ghép cặp
sửa chữa lỗi đúp aDn theo cơ chế error prone
Nguyên nhân lỗi: tia tử ngoại hay chất gây ung th (carcinogen), lỗi cả 2 mạch
trong gen nên không còn khuôn để sửa chữa theo các cơ chế thông thờng.
Cơ chế sửa chữa: vợt qua lỗi đúp để quá trình tái bản ADN vẫn tiếp tục (cứu sống
tế bào) nhng tạo ra những ADN có biến đổi. Cơ chế này đòi hỏi các protein UmuC và
UmuD (gắn nucleotid vào sợi ADN bất chấp không có sợi khuôn).
UmuC và UmuD có thể ức chế hoạt tính tự sửa exonuclease 35 của ADN-
polymerase hoặc chính chúng là ADN-polymerase đặc hiệu. Khi đột biến trên
gen mã cho hai protein này, các tế bào vi khuẩn sống sót ít hơn các tế bào bình
thờng dới tác dụng của tia tử ngoại.
Ngoài ra, khi mà cả hai sợi ADN đều có lỗi và nếu trong hệ gen (genome)
còn có một copy cha bị lỗi thì có thể dùng các sợi đơn từ bản copy sau khi trao
đổi chéo làm khuôn để sửa chữa các lỗi đó.
4.3.3 Bảo vệ ADN: hệ thống Restriction
Để bảo vệ ADN trớc những tác động môi trờng nh ánh sáng, nhiệt độ, hóa
chất, tế bào đã tạo ra rất nhiều protein chức năng cho nội dung này. Thuộc trong
số chúng có nhóm protein chống chịu và protein ức chế ribosome.
Trớc hết cần nắm bắt những tơng quan các yếu tố bên ngoài và hoạt động t-
ơng thích của các vùng tế bào.
Vùng ngoại bào và thành tế bào
- Ngăn cản ion
- Thải ion
- Biến đổi thành tế bào
Chức năng các vùng tế bào khi thiếu nớc

(theo Bohnert, 1996 và Đinh Thị Phòng, 2001)
Cô lập ion
19
Hoạt động các gen liên quan đến sự mất nớc
(theo Bray,1993 và Trần Thị Phơng, 1999)
Protein chống chịu
Protein sốc nhiệt (HSP)
HSP có ở hầu hết thực vât (khoảng 1% protein tổng số) và đợc phát hiện ở vi
khuẩn, động vật bậc cao. Chúng đợc tạo ra khi tế bào gặp điều kiện môi trờng
cực đoan nh hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao.
Có thể phân chia HSP theo khối lợng phân tử thành 6 nhóm với MW
(molecular wight) = 110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong số này HSP70 và HSP60
còn có khả năng môi giới phân tử (gọi là chaperonin); trái lại HSP8,5 có khả năng
bảo vệ tế bào nhng không phải là môi giới phân tử (gọi là ubiquytin). Ubiquytin
phân giải những protein không có hoạt tính men, ngăn chặn khả năng gây độc tế
bào của những protein này. Do ubiquy tin có MW thấp nên có vai trò giúp tế bào tự
sửa chữa khi gặp yếu tố cực đoan (nhiệt cao) [Chu Hoàng Mởu, 2005].
Protein bảo dỡng (protein môi giới)
Protein bảo dỡng gồm nhiều loại protein khác nhau; chức năng của chúng
thể hiện ở những nội dung sau:
- Giữ ổn định chuỗi polypeptid khi đang tổng hợp và tạo cấu trúc không gian
đúng cho chúng.
- Tái tạo cấu trúc không gian cho protein sau khi qua màng.
- Lắp ráp các chuỗi polypeptid tạo cấu trúc bậc IV.
- Đợc tăng cờng tổng hợp khi xuất hiện điều kiện cực đoan
Protein môi giới đợc nghiên cứu đầu tiên ở thực vật liên quan đến men
Rubisco (ribulose biphosphat carboxylase/oxygenelase) xúc tác các phản ứng
tổng hợp chất hữu cơ có sử dụng CO
2
tự do trong quang hợp. Cấu trúc bậc IV

của RUBISCO gồm 4-8 tiểu phần lớn (MW52) và 8 tiểu phần nhỏ (MW14).
Protein bảo dỡng cónnhững khả năng
- Tạo cấu trúc không gian đúng cho protein vừa đợc tổng hợp.
- Chuyển protein qua màng.
- Duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein đặc hiệu nhờ liên kết tạo phức với
RBP (RUBISCO-binding protein).
- Khởi phát phân hủy protein đã biến tính.
Một số nhóm protein bảo dỡng chủ yếu:
20
- HSP70: Có hoạt tính ATP-ase, ngăn chặn co cụm và kết tụ protein trong
điều kiện cực đoan.
- HSP60 (còn gọi chaperonin) cấu tạo từ nhiều tiểu phần với MW 60 kDa
gồm 2 vòng, mỗi vòng có 7-8 tiểu phân, có hoạt tính ATP-ase. Chaperonin
(GroEL, GroES) ở Procaryota giống với chaperonin (CCT) ở ty thể và lục
lạp của Eucaryota. Gần đây Nông Văn hải và cộng sự (1998), Trần Thị
Phơng Liên và cộng sự (1999) đã công bố kết quả phân lập và tách đợc
dòng gen CCT từ cây đậu tơng.
- HSP100, HSP90, sHSP có tính bảo thủ cao, đợc tổng hợp khi gặp nhiệt độ
cao, ngăn chặn kết tụ protein và tấi hoạt protein đã biến tính.
Protein chịu hạn LEA (late embryogenesis abundant)
Đợc tổng hợp trong giai đoạn cuối phát triển phôi-mầm, có khả năng chịu khô
hạn, không chứa cystein và tryptophan, giàu acid amin a nớc, phân tử có vùng
xoắn , có khả năng chịu nhiệt. Trong điều kiện cực đoan, chúng có nhiệm vụ cô
lập các ion, bảo vệ màng, phân hủy protein biến tính và điều chỉnh áp suất thẩm
thấu.
LEA chia làm 6 nhóm Dehydrin (D): D19, D11, D7, D113, D29, D95. Nhiều
gen LEA đã đợc nghiên cứu, phân lập và xác định chức năng. Khi gặp khô hạn,
m-ARN của nó đợc tổng hợp nhiều, gồm nhiều loại mARN khác nhau; khi hạt nảy
mầm, m-ARN bị phân giải hết. Mức độ phiên mã của gen LEA đợc điều khiển bởi
ABA và độ mất nớc của tế bào.

Protein bất hoạt ribosome (ribosome inactivating protein =RIPs)
RIPs là những độc tố, phân giải N-glycosid của adenine đặc hiệu trên vùng
Sarcin/Ricin Loop (còn gọi là vùng SRL hay R/S Domain) của rARN (vị trí A4324
trên rARN 28S ở gan chuột). Kết quả ribosome không gắn kết đợc với EF-2 và
GTP dẫn đến ức chế tổng hợp protein.
RIPs chia làm 3 type khác nhau: RIPsI (mội chuỗi polypeptid A đôi khi ở dạng
glycosyl hóa với MW khoảng 30 kDa), RIPsII (2 chuỗi polypeptid A liên kết với
chuỗi polypeptid B có hoạt tính giống Lectin thông qua 1 hoặc vài cầu nối
díulfid), RIPsIII (giống type I những chỉ có hoạt tính sau khi đợc phân cắt đoạn tín
hiệu bằng proteinase đặc hiệu). Một số RIPs khác không thể sắp xếp vào các
nhóm theo MW.
RIPs phát hiện thjấy ở rất nhiều thực vật (một và hai lá mầm), ở một số vi
khuẩn đờng ruột; nh vậy khả năng RIPs tồn tại ở cả động vật.
21