di truyền phân tử 04

Chơng 5 di truyền học phát triển cá thể
và di truyền học tiến hóa
5.1 di truyền học phát triển cá thể
5.1.1 Các đối tợng mô hình nghiên cứu di truyền học phát triển cá thể
Dựa vào những khám phá sau Watson và Crick (1953) về cấu trúc và chức
năng của acid nucleic, ngày nay đã phát triển những kỹ thuật ứng dụng nh các
kỹ thuật gen (geneomic) và các kỹ thuật protein (proteomic) vào chon giống và
nghiên cứu ở ngời.
Bộ gen là tập hợp tất cả các yếu tố di truyền trong tế bào; nhìn chung nó
gồm các thành phần hệ gen nhân (genom), hệ gen ty thể (mitochondrom), hệ
gen lục lạp (plastom = plastidom) và hệ gen phân tán (plasmidom). Hệ gen của
các bào quan (ty thể, lục lạp, ) gọi chung là hệ gen bào t ơng (plasmon). Sinh
vật khác nhau thì bộ gen cũng khác nhau ở thành phần và cấu trúc gen.
Bộ gen ở Procaryota gồm hai thành phần là hệ gen vùng nhân (genome
98-99% bộ gen) và hệ gen phân tán (plasmidom 1-2% bộ gen). Hệ gen vùng
nhân là phân tử AND gấp khúc cuộn xoắn; tính siêu xoắn chịu sự kiểm soát của
men topoisomerase. AND của của E. coli có kích thớc 300 m (dạng mở xoắn)
và chỉ còn 1,5 m (dạng siêu xoắn). Procaryota chứa AND trần (không bọc
histon), chuỗi kép (15%) và đơn (85%), dạng vòng. Một số loài bộ gen chỉ có một
thành phần là hệ gen vùng nhân, ví dụ E. coli chỉ có một phân tử AND dậng vòng
chứa 3000-4000 gen.
5.1.2 Tổ chức bộ gen ở Eucaryota
Bộ gen ở sinh vật Eucaryota gồm 3 thành phần
là hệ gen nhân, hệ gen ty thể và hệ gen lục lạp.
AND nhân có dạng mạch kép, chủ yếu là -AND.
AND ty thể và lục lạp có dạng kép vòng. AND nhân
đợc bọc protein (histon dạng 8 phân tử octamer)
tậo thành thể nhân (nucleosom). Histon đợc phân
biệt gồm 5 loậi với tỷ lệ tơng đơng nhau là H1,
H2A, H2B, H3 và H4. Trong đó 2 phân tử H3 và H4
liên kết ở vùng trung tâm, 2 phân tử H2A và 2 phân

tử H2b liên kết ở vùng ngoài của AND.
Các nucleosom kết nối với nhau bởi một đoạn AND (15-100 bp) tạo thành sợi
cơ bản có cấu trúc xoắn (đờng kính 100), sợi cơ bản xoắn thành sợi nhiễm sắc
(solenoit, đờng kính 250), sợi nhiễm sắc xoắn thành ống nhiễm sắc (đờng kính
2000) và ống nầy xoắn một lần nữa thành sợi nhiễm sắc (chromatid, đờng kính
6000).
Sợi cơ bản

Sợi solenoit
đờng kính 2000
ống nhiễm săc
đờng kính 6000
Sợi chromatid
101
Hệ gen lục lạp (plastidom)
ADN và ribosome trong lục lạp đợc phát hiện năm 1963 [Chu Hoàng Mậu,
2005]. Lợng ADN lục lạp (ct.ADN) chiếm 15% tổng lợng tế bào thực vật, lợng
ribosme chiếm 60% lợng ribosome tế bào. ct.ADN có cấu trúc mạch vòng (gần
85% là mạch đơn), có MW khoảng 83-128.10
6
.
ct.ADN làm khuôn tổng hợp mARN chloroplast (chỉ dài khoảng 20 nucleotid),
chúng thực hiện tổng hợp protein tại chỗ. Ribosome trong lục lạp là 70S (độ sa
lắng) gồm tiểu phần nhỏ 30S và tiểu phần lớn 50S.
Plastidom chỉ tổng hợp protein cần thiết cho sự phát triển của lục lạp
(khoảng 100 loại polypeptid khác nhau). Các protein khác có trong lục lạp đợc
hệ gen nhân tổng hợp và chuyển vào sau dịch mã.
ADN Kích thớc (bp) Chu vi vòng (m)
Plasmid
Trực khuẩn E. coli (chromosome)

Trùng roi (Euglena) (ct.ADN)
Thuốc lá (Tabaco) (ct.ADN)
Ngô (Zea mais) (ct.ADN)
đậu xanh (mungbean) (ct.ADN)
1 200x10
3
3,8x10
6
1,4x110
5
1,5x10
5
1,36x10
5
1,21x10
5
-
-
44-44
-
43
39
Hệ gen ty thể (mitochondrom)
Phơng pháp tách chiết ADN ty thể (Salech và cộng sự, 1989) gồm các bớc:
- Ly tâm chậm để loại bỏ nhân, lục lạp và các thành phần khác của tế bào.
- Ly tâm nhanh để tách ty thể.
- Xử lý bằng ADN-ase I để phân giải các ADN nhân dính vào ty thể
- Tinh sạch ty thể
- Tách chiết mt.ADN từ ty thể.
mt.ADN động vật có dạng vòng và kích thớc nhỏ 15-20 kb; trong khi mt.ADN

thực vật đa dạng (vòng, thẳng và các dạng khác) với kích thớc lớn hơn (200 kb ở
bắp cải, 2500 kb ở da).
Sản phẩm do mt.ADN mã hóa là một số lợng nhỏ protein rất quan trọng cho
hoạt động tại chỗ, nh 3 tiểu phần của cytochromoxydase, 2 tiểu phần của phức
cytochrome bc và một số thành phần khác [ADNre, 1991]. Ngoài ra mt.ADN còn
đóng vai trò quan trọng trong hiện tợng bất dục đực của tế bào chất (CMS) đợc
khai thác sản xuất các dòng lai nh lúa, ngô [Spruill và cộng sự, 1981]. CMS có
khả năng tổng hợp chuỗi polypeptid MW =130.000, nhng mất khả năng tổng hợp
chuỗi polypeptid MW = 21.000 ở nguyên sinh chất tế bào cây bình thờng.
Trong tế bào cây CMS có mang 2 phân tử ADN mạch thẳng (giống plasmid)
ở ty thể với kích thớc 6,2 kb và 5,2 kb. Trong ADN nhân mã UGA là mã kết thuc
nhng trong mt.ADN lại là mã cho tryptophan. Ngợc lại mã CGG ở ADN nhân mã
cho tryptophan nhng ở mt.ADN lại mã cho arginine. Ngoài ra trong ty thể thực vật
còn phát hiện dạng mới của m-ARN (gọi là ARN-editing) thích nghi tốt hơn với
điều kiện ngoại cảnh.
Hệ gen nhân (genome)
102
Hệ gen này có khối lợng và số lợng lớn nhất trong bộ gen tế bào. ADN nhân
đợc sắp xếp thu gọn trong nhiễm sắc thể có liên kết hoặc không liên kết với
histon. Khối lợng ADN nhân khác nhau tùy loài (nhỏ nhất là 0,07 picogram ở
Arabidosis thaliana, = 33,5 pg ở Allium cepa)
Hệ gen nhân ở Eucaryota có 3 thành phần là các đoạn ADN không lặp lại
(chiếm 45% genom), các đoạn ADN lặp lại ít (25%) và các đoạn ADN lặp lại
nhiều (30%); trong khi hệ gen nhân ở Procaryota chỉ có một thành phần là các
đoạn ADN không lặp lại kác nhau [Chu Hoàng Mởu, 2005].
5.1.3 Các nhân tố tác động đến sự phát triển
Sự phát triển đợc hiểu trong nghĩa khái quát bao hàm sự tồn tại có tích lũy
(sinh trởng) và sự nhân bản trong sinh sản (di truyền) diễn ra ở tế bào hay cơ thể
sinh vật.
Trớc hết chúng ta sơ bộ khảo sát chu trình của một tế bào:

Các sự kiện chính diễn ra trong chu kỳ tế bào
M: phân kỳ
G
1
: gian kỳ1 (tổng hợp các chất)
S: tổng hợp và tích lũy
G
2
; dừng tích lũy, tái bản ADN
Cơ sở của sự sống là vật chất, nghĩa là nó tập trung những chất hữu cơ trong
một giới hạn không gian nhất định. Những hoạt động hóa học của các phân tử
này là nền tảng biểu hiện của hoạt động sống. Do có xuất xứ vật chất nên cơ thể
sống cũng sử hữu thuộc tính vĩnh cửu của vật chất đó là thờng xuyên vận động
và thờng xuyên biến đổi phơng thức vận động.
Toàn bộ những nhân tố vật chất trong tự nhiên (phân tử, nguyên tử, nhiệt độ,
ánh sáng ) với sự biến đổi th ờng xuyên đã là cơ sở phát sinh sự sống và cơ thể
sống. Cũng chính sự biến đổi thờng xuyên của các nhân tố môi trờng là nguyên
nhân quyết định hình thành những phơng thức hoạt động sống mới, nói cách
khác nó quyết định sự phát triển của sự sống.
Lần theo quá trình phát triển sự sống, nhóm thể sống sơ khai (thờng gọi là
giọt sống - coacerva ch a phải là cơ thể sống chính thức vì trong nó cha có yếu
tố acid nucleic. Những giới sinh vật khác trong tế bào của chúng đã có yếu tố
này và vì thế chúng đã có một cơ thể chính thức đáp ứng đủ thuộc tính của sự
sống là tồn tại và phát triển.
Khi đã quan niệm nh vậy thì các nhân tố ảnh hởng tới sự phát triển là những
nhân tố tác động vào hoạt động của protein (gốc của sự tồn tại) và vào hoạt
103
động của acid nucleic (gốc của sự phát triển). Ngoài ra cần phân biệt hai nội
dung của sự phát triển là phát triển số lợng và phát triển chất lợng.
Các nhân tố tác động phát triển số lợng

Thực chất của phát triển số lợng là sản xuất đợc nhiều cá thể hay nói cách khác
là sản xuất đợc nhiều protein. Muốn vậy ngoài nhân tố nguyên liệu để sản xuất
protein còn nhân tố quy trình sản xuất protein và môi trờng sản xuất protein.
Phân tử protein đợc đặc trng bởi số lợng, số loại và trình tự các acid amin.
Bởi vậy nguyên liệu cũng phải đáp ứng đủ lợng và tỷ lệ các loại acid amin đối với
từng protein. Đặc biệt trong chăn nuôi nhân tố này là rất quan trọng vì cơ thể
động vật không tự tổng hợp đợc những acid amin thiết yếu.
Trong một thời gian nhất định mỗi gen mã hóa cho một protein chỉ hoạt động
với công suất nhất định nên hiệu suất sản xuất protein cũng chỉ là giới hạn. Từ
đó nhân tố tái bản gen đáp ứng đủ nhu cầu phát triển lợng protein là rất quan
trọng. Đặc điểm chu kỳ sinh trởng và sinh sản ở động vật nói chung dài gấp
nhiều lần ở sinh vật đơn bào (vi khuẩn, nấm). Hiện nay xu hớng sử dụng khả
năng sinh sản nhanh của những sinh vật đơn bào làm môi tr ờng sản xuất gen
cũng nh sản xuất protein rất đợc chú ý.
Nhiều động vật sở hữu những quy trình sản xuất những loại protein hiếm, quý
đang có nguy cơ tiệt chủng do nhiều nguyên nhân. Nhân tố bảo tồn những nguồn
gen trở nên cần thiết. Việc xây dựng những ngân hàng gen đang phát triển với
hai ý nghĩa là bảo tồn gen quý hiếm (ngân hàng hệ gen) và cung cấp gen (ngân
hàng cADN) để sản xuất protein.
Kỹ thuật nhân bản vô tính đã thành công ở một số động vật nh cừu, bò, thỏ,
chuột Kỹ thuật này khai thác khả năng phát triển của tế bào nguồn gốc lá phôi
ngoài do chúng cha biệt hóa sâu sắc để tiếp tục phát triển thành cá thể Vận
dụng kỹ thuất này ngời ta ngày nay đã có thể nuôi cấy mô bào nhằm vào mục
đích y tế.
Các nhân tố tác động phát triển chất lợng
Phát triển chất lợng đồng nghĩa với thay đổi protein đặc thù. Bản chất protein
khi thay đổi do yếu tố môi trờng hầu hết dẫn đến biến tính. Cơ sở để phát triển chất
lợng protein chỉ có thể dựa vào sự thay đổi gen hay chí ít cũng là thay đổi quan hệ
giữa các gen cùng tơng tác ảnh hởng đến quy trình sản xuất protein.
Sử dụng các phơng pháp lai để tạo giống có phẩm chất protein tốt hơn đã đ-

ợc vận dụng để tận dụng u thế lai trong phơng thức biểu hiện của gen. Ngày nay,
để phát triển chất lợng protein ngời ta đang quan tâm nhiều tới phơng thức gây
đột biến gen nhân tạo, chọn lọc và bảo tồn đột biến gen. Kết quả đã tạo đợc
nhiều giống rau quả biến đổi gen đã đợc sử dụng. Hậu quả việc sử dụng các sản
phẩm biến đổi gen ảnh hởng ở mức độ nào tới sự sống con ngời cần đợc kiểm tra
chặt chẽ và cẩn thận.
5.1.4 Chu trình phân bào, sự chết của tế bào
Nguồn gốc sự phân bào
Tế bào sinh dỡng ở Eucaryota có bộ NST lỡng bội 2n và là sân bãi diễn ra
hầu hết các quá trình sinh hóa sản xuất các chất cần thiết (chủ yếu là protein)
cho cấu tạo và năng lợng cho hoạt động tế bào làm cho lợng (đồng thời là thể
104
tích) bào chất (Vtbc) liên tục tăng lên; trong khi đó số lợng NST trong nhân bào
không đổi, nói cách khác diện tích màng nhân = Smn cũng không đổi. Mặt khác
với số lợng NST đó, bộ NST chỉ có thể điều hành một thể tích tế bào chất giới
hạn. Tỷ số Vtbc/Smn khi đạt giá trị tối đa nếu không giảm đợc tỷ số đó thì quá
trình trao đổi chất trong tế bào sẽ buộc không tiến triển nữa (quy luật hóa học).
Biện pháp duy nhất bảo tồn thuộc tính biến đổi không ngừng của vật chất
hữu cơ là phân bào (tiền đề mọi quá trình sinh sản). Qua biện pháp này, thể tích
bào chất (Vtbc) đợc chia làm hai phần, số lợng NST tăng gấp đôi và khi phối hợp
1/2 Vtbc với 1/2 số NST đã gấp đôi sẽ đợc tỷ lệ Vtbc/Smn (Smn: diện tích màng
nhân) bằng nửa tỷ lệ này ban đầu. Nh vậy sự trao đổi chất trong tế bào mới lại
có thể tiếp tục.
Tuy nhiên trong giới sinh vật Eucaryota, tồn tại nhiều phơng thức phân bào
khác nhau nhng kết quả cuối cùng thống nhất ở một nội dung là tạo ra đợc
những tế bào mới giữ đợc những đặc điểm cơ bản trong cấu tạo và hoạt động
sống của thế hệ tế bào xuất phát.
Chu trình phân bào ở Eucaryota
Phân bào là quá trình diễn ra ở tất cả sinh vật, nó thể hiện nền tảng cho sinh
sản, sinh trởng, bổ sung tế bào vầ bảo tồn loài.

Protein là vật chất chủ yếu nhất biểu hiện mọi tính trạng của tế bào; nhng
phân bào lại không đảm bảo phân chia đầy đủ loại và khối lợng protein của tế
bào thế hệ trớc cho các tế bào thế hệ sau mà chỉ phân chía đều đặn quy trình
tổng hợp (các mã thông tin di truyền) cho tất cả các chất cần thiết, trong đó chủ
yếu là cho protein. Vì vây khảo sát sự phân bào chính là tìm hiểu những biến đổi
các NST trong hệ genom của tế bào Eucaryota.
Tế bào Eucaryota có ba phơng thức phân bào là trực phân, nguyên phân và
giảm phân [ABC Biologie, 1967, tr. 902].
Trực phân (amitose): thắt đứt một tế bào kể cả nhân thành 2 tế bào con.
Trực phân tồn tại chủ yếu ở những tế bào đặc biệt đã biệt hóa sâu sắc. ở
những tế bào loại này dễ xuất hiện tác động gián đoạn chức năng đối với cơ
thể. Sự phân chia nhân lớn (macronucleus) ở trùng tơ cũng diễn ra theo kiểu
trực phân. Trực phân diễn ra ở tế bào hoặc nhân bào sinh dục tất nhiên là
hiện tợng bệnh lý.
Nguyên phân (mitose phân chia gián tiếp): xảy ra phổ biến, tại đó nhân
bào trải qua biến thái đặc trng và cũng qua đó vật chất nhiễm sắc cũng chính
là thông tin di truyền đợc phân chia đều về số lợng và chất lợng cho hai tế
bào con. Sự biến thái NST (nhân đôi NST tạo thể tứ, phân ly cặp NST t ơng
đồng tạo NST kép, Phân ly NST kép, tái tổ hợp cặp NST tơng đông) diễn ra
trong 4 thời kỳ chính (kỳ đầu, kỳ giữa, kỳ sau và kỳ cuối). Trong kỳ cuối
(telophase) ở thực vật,ớau khi các NST đã hình thành các cặp tơng đồng ở hai
cực tế bào thì một phiến màng bào xuất hiện ở mặt phẳng xích đạo tế bào, lớn
dần lên và nối liền với thành dọc của tế bào chủ thành hai tế bào con. Trong
kỳ cuối nguyên phân ở tế bào động vật sau khi các NST đã hình thành cặp t-
ơng đồng ở hai cực tế bào, màng sinh chất thắt dần lại ở mặt phẳng xích đạo
tế bào chủ và tế bào chủ đứt ra thành hai tế bào con. Sự phân chia bào chất
sau khi sự phân chia nhân diễn ra nhiều lần và kết quả có số lợng tế bào con
105
đúng bằng số nhân đợc hình thành trong tế bào chủ; hiện tợng này gọi là đa
phân (multiple mitose)[ABC Biologie, 1967, tr. 903].

Giảm phân (meiose): là sự phân bào gồm hai lần phân chia tế bào từ một tế
bào ban đầu (tế bào sinh dục nguyên thủy). Lần một là lần phân bào giảm
nhiễm, cũng có 4 kỳ tơng tự nh ở nguyên phân. Tuy nhiên trong kỳ cuối không
xảy ra sự phân ly cặp NST kép mà chỉ diễn ra sự phân ly cặp NST t ơng đồng.
Mỗi tế bào con chỉ có những NST kép nguuồn gốc từ 1 trong 2 NST của cặp t-
ơng đồng. Bộ NST (đơn bội) của chúng về chất lợng thông tin di truyền chỉ
bằng nửa của bộ NST (lỡng bội) ở tế bào ban đầu. Lần phân bào thứ hai
không có kỳ đầu và trong kỳ cuối là sự phân ly NST kép. Sau hai lần phân
bào, từ một tế bào ban đầu đã hình thành 4 tế bào với bộ NST (đơn bội) bằng
nửa bộ NST (lỡng bội) ở tế bào ban đầu cả về chất lợng thông tin di truyền lẫn
về số lợng NST. Những tế bào đơn bội ngợc giói tính sau khi hợp nhất với
nhau se cho tế bào lỡng bội giống nh tế bàop ban đầu về số lợng NST nhng
có thể thay đổi về chất lợng thông tin di truyền.
5.1.5 Sự ung th
5.2 Các biến động của bộ gen
Tái tổ hợp di truyền là hiện tợng tổ chức lại hệ gen cá thể để đảm bảo sự tồn
tại của cá thể (bảo tồn cấu trúc hệ gen) và để cá thể phát triển thích ứng với các
yếu tố môi trờng (đổi mới cấu trúc hệ gen).
Tái tổ hợp nội phân (intramolecular recombination) là quá trình đó phụ thuộc
các men. Các kiểu cách khác nhau gồm có:
+Trao đổi chéo tơng đồng (homologous recombination): đòi hỏi sự tơng đồng
giữa hai đoạn ADN (còn gọi là tái tổ hợp chung general recombination).
+Trao đổi chéo đặc hiệu (site-specific recombination): xảy ra ở những vị trí
đặc hiêu trên hai đoạn ADN và đòi hỏicác men tam gia nhận biết đợc vị trí đặc
hiệu (đoạn ngắn) có thể xảy ra giữa hai đoạn bất kỳ không nhất thiết tơng đồng.
+Sự chuyển chỗ các đoạn ADN (các transposon) liên quan đến các yếu tố có
khả năng vận động (mobile genetic element) giữa hai vị trí tách ra và ghép vào
trên một hay hai phân tử ADN.
+Trao đổi chéo sai lệch (illegitimate recombination) liên quan đến sự thêm
đoạn, mất đoạn hay nối sai các đoạn ADN với nhau trong quá trình tái bản hoặc

trao đổi chéo không cân bằng (unequal crossing over) giữa các nhiễm sắc thể.
Đột biến là tạo ra thông tin di truyền mới cho hệ gen (khác với tái tổ hợp).
Tuy nhiên đột biến và tái tổi hợp thờng đi đôi với nhau. Ví dụ trao đổi chéo sai
lệch hoặc di chuyển các yếu tố ADN (transposon) có khả năng di truyền có thể
gây ra những đột biến làm thay đổi cấu trúc của gen. Ng ợc lại, tái tổ hợp là một
trong những cơ chế sửa chữa ADN nhằm duy trì sự sống của tế bào khi xảy ra
các đột biến nghiêm trọng.
106
5.2.1 Tái tổ hợp tơng đồng
Tái tổ hợp chung
ở Procaryota
Trên vi khuẩn E. coli phức protein Rec-BCD (có hoạt tính nuclease và
helicase) có khả năng tạo vết đứt trên sợi đơn ADN và giải phóng sợi này khỏi
cấu trúc kép (cần ATP).
Trao đổi chéo thờng đợc khởi động tại vị trí Chi (trình tự GCTGGTGG); cứ
khoảng 5 kb lại có một vị trí nh vậy. Phức Rec-BCD nhận biết vị trí này và cắt
liên kết bổ sung cách đấy khoảng 5 nucleotid về phía đấu 3 . Sau đó helicase t -
ơng tác với ADN để mở xoắn tạo sợi đơn. Protein Rec-A nhận biết sợi đơn tạo
phức nucleo-protein. Khi tìm thấy đoạn tơng đồng trên NST, phức này (Rec-
AADN dạng đơn) mở xoắn và tạo liên kết bổ sung giữa sợi đơn của phức với
một trong hai sợi đơn của NST.
Trao đổi chéo sợi đơn giữa hai đoạn ADN tơng đồng ở Procaryota
ở Eucaryota
Quá trình tơng tự nhau ở virus, vi khuẩn và nấm và gồm các bớc chính: (1)
Hai phân tử ADN bị bẻ gẫy, (2) Vị trí đứt gẫy nằm bất kỳ trên đoạn nucleotid tơng
đồng, (3) trao đổi hai sợi đơn của hai phân tử ADN, (4) cắt nối mạch bổ sung
giữa hai đoạn sợi đơn ADN để hoàn chỉnh hai phân tử ADN dị hợp kép
(heteroduplex join).
Trao đổi đoạn ADN ở Eucaryota
Tại vị trí nối dị hợp có xảy ra lỗi tạo cặp base; Lỗi này đợc khắc phục nhờ cơ

chế sửa chữa ADN. Nhóm protein RAD (trong đó có RAD51 rất tơng đồng với
RecA của E. coli) tham gia trao đổi chéo ở Eucaryota đợc phân lập đầu tiên từ tế
bào nấm không có khả năng sửa chữa ADN hoặc bị rối loạn phân bào nguyên
phân. Sau đó các dạng tơng đồng với RAD51 tìm thấy ở ruồi giấm, chuột và ngời.
Gen mã cho các dạng RAD51 đều đợc hoạt hóa khi ADN bị tổn thơng.
107
Gen DST1 (thuộc họ gen rad51) mã cho sản phẩm chỉ có vai trò trong mitose.
Gen rad50 mã cho protein tơng tác với ADN (sửa chữa ADN bị đứt gẫy của tế
bào soma nhng kích thích đứt gẫy ADN trong tế bào meiose).
Gen rad52 mã cho protein RAD52 cần cho tái tổ hợp chung ở cả tế bào
soma và tế bào sinh dục.
Trao đổi đoạn mạch đơn ở Eucaryota
Trao đổi gen do tái tổ hợp chung và do tổng hợp ADN có giới hạn
Trao đổi gen do tái tổ hợp chung
Trao đổi chéo đoạn NSTử (gen E) giữa hai NST tơng đồng
Đoạn e không bổ sung với E, đ ợc cắt bỏ
Đoạn E đợc dùng làm khuôn tổng hợp E
Trao đổi gen do tổng hợp ADN có giới hạn
Thay thế gen giữa hai NSTử của một NST
do tổng hợp ADN có giới hạn
Tái tổ hợp ADN ở vị trí đặc hiệu
Phage Mu
Tái tổ hợp đặc hiệu phát hiện lần đầu tiên ở E. coli. Khi xâm nhập tế bào chủ,
men integrase của phage (thể thực khuẩn) và protein IHF của tế bào chủ liên kết
với vị trí đặc biệt trên -ADN (của phage) và bám vào hệ gen của tế bào vi
khuẩn. Lúc này xảy ra trao đổi chéo giữa hai genomee (phage và E. coli); Phage
có thể ở dạng tiềm tan.
108
Tùy theo chiều sắp xếp của các vị trí đặc hiệu trên ADN mà trao đổi chéo
đặc hiệu có thể diễn ra theo 3 cách khác nhau:

+Trao đổi chéo đặc hiệu ngoại phân tử (intermolecular site-specific
recombination): sự ghép vào hoặc tách ra giữa hai phân tử ADN (nh ghép -
ADN vào genome của E. coli).
Cơ chế tái tổ hợp đặc hiệu ở E. coli
+Trao đổi chéo đặc hiệu nội phân tử (intramolecular site-specific
recombination): giữa các đoạn nucleotid lặp lại cùng chiều hay ngợc chiều của
một phân tử ADN. Ví dụ sự trao đổi chéo đặc hiệu tại vùng G (3000 bp) của
phage Mu. Đoạn G (có 34 nucleotid lặp lại ngợc chiều ở hai đầu) có khả năng
đổi chiều ngay tại vị trí của mình. Sự đổi chiều của G phụ thuộc hai đoạn lặp lại
này và protein GIN (mã bởi gen gin).
Trao đổi chéo giữa hai chuỗi lặp lại ngợc chiều gixL và gixR gây ra sự đổi
chiều đoạn G. Do vậy hoạt động của các gen S và U bị thay thế bởi S và U .
Sản phẩm của hai cặp gen này của Mu qui định giới hạn tế bào chủ E. coli.
5.2.2 Tái tổ hợp chuyên biệt
Gen tái tổ hợp
Ngày nay nhờ kỹ thuật tách dòng và tái tổ hợp ADN có thể thu đợc số lợng
không hạn chế những đoạn ADN cần nghiên cứu, cần xác định trình tự nucleotid
trên chúng hay cần phân lập và tách một gen bất kỳ ra khỏi genomee. Gen tái tổ
hợp có thể mang những đột biến theo yêu cầu và đợc cấy vào phôi. Những gen
tái tổ hợp hoạt động trong genomee của cá thể chuyển gen vào vật chủ và đợc di
truyền cho các vật chủ thế hệ sau.
109
Ví dụ sự tách dòng và tái tổ hợp gen ngời; trong đó plasmid mang gen lạ đợc
gọi là vector (cloning vector vật mang vô tính). Có nhiều loại vector khác nhau
mang các đoạn ADN kích thớc khác nhau. Từ đó có thể tổng hợp những protein
tơng ứng với số lợng theo ý muốn dẫn đến sản xuất hormon hay vaccine dễ dàng
và hiệu quả hơn. Mặt khác vấn đề bảo tồn giống, tạo giống mới, chẩn đoán và
điều trị bệnh truyền nhiễm, bệnh di truyền nh ung th hoặc AIDS có nhiều hứa
hẹn khả quan.
Kỹ thuật tách dòng gen ngời

Kỹ thuật xác định trình tự nucleotid
Phân cắt ADN bởi men giới hạn (restriction enzym)
Kích thớc genome ở Eucaryota là rất lớn (10
5
-10
11
nucleotid). Để có thể cắt
chính xác một gen (đoạn ADN) mong muốn nhất thiết có sự tham gia của men
giới hạn (restriction enzym hay restriction nuclease). Chúng nhận biết vị trí đặc
hiệu (gồm 4-8 nucleotid) trên ADN và cắt phân tử này thành những đoạn khác
nhau:
Men Hpd cắt thành các đoạn đầu bằng blunt ends
Men EcoR cắt thành các đoạn đầu dính cohensive ends
Mỗi đầu dính của ADN này có thể liên kết bổ sung với các đoạn đầu dính của ADN khác
phân tử ADN tái tổ hợp
110
Hiện nay đã sản xuất hơn 100 men giới hạn nhân tạo khác nhau. Các đoạn
bị cắt bởi các men giới hạn gọi là các đoạn giới hạn (restriction fragment). Sử
dụng riêng biệt và sử dụng phối hợp các men khác nhau để cắt cùng một phân tử
ADN cho phép xác định chính xác trật tự các nucleotid của phân tử ADN đó. Nh
vậy, cuối cùng thiết lập đợc bản đồ giới hạn.
Lặp lại sử dụng các men khác và sự phối hợp cắt sẽ xác định trật tự các vị trí cắt
và luận ra trình tự các nucleotid tơng ứng các vị trí cắt
Kỹ thuật sử dụng các men giới hạn để cắt phân tử ADN giúp lập bản đồ giới
hạn, so sánh cùng một đoạn ADN ở sinh vật khác nhau, nghiên cứu quá trình
tiến hóa và giúp cho tách dòng và công nghệ gen.
Phân ly các đoạn ADN
Phân tử ADN tích điện âm sẽ dịch chuyển về cực dơng trong môi trờng điện
một chiều. Các phân tử ADN kích thớc khác nhau dịch chuyển đoạn đờng khác
nhau do điện di ngang trên gel agarose hoặc điện di đứng trên gel

polyacrylamid. Các ADN lớn (10
5
-10
7
cặp nucleotid) đợc điện di trong điện trờng
đẩy pulsed-field ; Các ADN có kích th ớc 300-10.000 cặp nucleotid đợc phân ly
trên gel agarose hoăc acrylamid với nồng độ khác nhau. Những đoạn hơn kém
nhau một nucleotid đợc xác định nhờ gel polyacrylamid (phơng pháp xác định
trình tự nucleotid).
Sau khi điện di, các đoạn ADN trên gel có thể quan sát bằng mắt thờng khi
nhuộm bạc hoặc nhuộm ethidium bromid dới tia tử ngoại.
Khi ADN đợc gắn nguyên tố phóng xạ (P
32
, S
35
) hoặc chất phát huỳnh quang
thì chúng đợc phát hiện rất nhanh nhạy ngay ở lợng rất nhỏ (cỡ nano-gram = ng).
Ghép đoạn ADN vào vector
Các vector nhận ADN có kích thớc khác nhau. Plasmid thờng có kích thớc nhỏ
không mang đợc ADN có kích thớc lớn (<7 kb). Tuy nhiên vector nhân tạo YAC
(yeast artifical chromosom) có thể mang đoạn ADN cỡ 1 Mb.
Các vector hiện nay hay dùng là plasmid, phage, cosmid, BAC (bacteria
artifical chromosom).
Để đa một đoạn ADN vào vector (vật mang) thì các đầu dính (-NH
2
) của
vector phải liên kết với ADN theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Thờng dùng cùng
một loại men giới hạn cắt vector và ADN để tạo các đầu dính. Sau đó chúng đợc
nối với nhau nhờ men ligase. Ưu điểm của phơng pháp này là dùng chính men
giới hạn đó để lấy lại đoạn ADN từ vector chứa chúng.

ADN tái tổ hợp đợc đa vào tế bào nhận, thờng là vi khuẩn. Chúng đợc nuôi
cấy tăng số lợng. Để phân lập vi khuẩn chứa vector cần dựa vào dấu hiệu nhận
biết chúng (vector mang gen chống chịu kháng sinh mọc đợc trong môi trờng có
kháng sinh), hoặc dựa vào vị trí nằm trong vùng chứa mã di truyền của gen đánh
dấu khi ghép ADN lạ làm cho hoạt động của gen này bị thay đổi (nhận biết qua
111
sự thiếu vắng sản phẩm từ gen đó). Nh vậy dể dàng nhận biết và phân lập tế bào
mang vector chứa ADN lạ khỏi những tế bào khác.
Khi ADN lạ là vùng mang mã di truyền của một gen (ADNc) đợc đa vào
vector có sẵn promotor thì sản phẩm của gen đợc tổng hợp ngay trong tế bào
nhận. Loại vector này gọi là vector biểu hiện (expession vector); thông thờng
vector loại này chứa nhiều promotor tổng hợp m-ARN (promotor nguồn gôc vi
khuẩn, virus).
Loại vector biểu hiện expression vector
Ví dụ vector có đoạn nucleotid mã cho protein đánh dấu fusion protein (nh
phát huỳnh quang: GFP = Green Fluoresence Protein). Biểu hiện của gen lạ là
khi đợc ghjép vào vector thì sản phẩm của ADNc (protein) dung hợp với protein
đánh dấu GFP. Nhờ sự phát huỳnh quang của GFP mà nhận biết hàm lợng
protein, sự phân bố và chức năng của mã bởi gen lạ trong tế bào sống.
Loại vector chứa gen đánh dấu
Xây dựng ngân hàng gen cADN (cADN library)
Kích thớc của một gen bất kỳ chiếm một phần rất nhỏ so với toàn bộ
genome. Genome của động vật có vú khoảng 10
9
bp; một gen dài 10.000 bp chỉ
chiếm 0,001% tổng số ADN trong tế bào. Để tách chính xác một gen phải có mồi
đặc hiệu (m-ARN từ gen đó). Đối với những protein hiếm, m-ARN của nó rất ít;
mặt khác m-ARN dễ biến tính nên rất khó thao tác trong thực nghiệm với độ
chính xác cao.
Khắc phục nhợc điểm này nhờ vào các men reverse transcriptase và ADN

polymerase. Qua đó tạo ra đợc rất nhiều ADN trên số lợng rất nhỏ khuôn mẫu m-
112
ARN gọi là cADN (complementary ADN). Các cADN khác nhau đợc đa vào
vector và tách dòng cADN dễ dàng theo mong muốn. Các vector chứa cADN đ ợc
biến nạp vào tế bào nhận. Tập hợp các tế bào nhận chứa cADN tạo thành ngân
hàng cADN.
Cơ chế tạo cADN (sợi kép, đầu bằng)
theo khuôn m-ARN tách chiết từ tế bào
Các cADN đầu bằng rất khó đợc đa vào vector. Do vậy các Linker (L) thờng
đợc nối vào hai đầu của cADN nhờ ADN-ligase. Những đoạn nucleotid của men
giới hạn chứa vị trí nhận biết đợc tổng hợp nhân tạo. Sau đó các cADN mang
Linker chứa vị trí nhận biết cũng nh vector sẽ đợc xử lý với men tơng thích (có vị
trí nhận biết nằm trong Linker). Với các Linker, các cADN có đầu so le (đầu dính)
và dễ dàng đợc đa vào vector.
Xây dựng ngân hàng hệ gen (genomeic ADN library)
Một phân tử cADN chỉ tơng ứng với các exon của một gen, trong khi gen
Eucaryota còn chứa các intron. Kích thớc trung bình của một gen khoảng 15-20
kb. Để có thể đa toàn bộ các gen của hệ gen ở Eucaryota vào ngân hàng, trớc hết
hệ gen phải bị cắt bởi men giới hạn thành các đoạn ADN có kích thớc thích hợp
với vector nhận chúng.
Các men nhận biết 4-8 nucleotid thực hiện cắt genome thành các đoạn. Với
một genome, đoạn cắt này sẽ càng dài và số lợng chúng càng ít khi số nucleotid ở
vị trí cắt càng nhiều (ví dụ 8 nucleotid). Hơn nữa không dễ có đợc đoạn cắt chứa
nguyên vẹn một gen. Trong thực tế một gen thờng bị phân bố ở nhiều đoạn cắt do
vị trí nhận biết nằm ngay trong gen.

Để mọi vị trí nhận biết không bị cắt đồng thời cần khống chế nồng độ men
nhận biết và thời gian cho phản ứng cắt sao cho phản ứng chỉ xẩy ra ở từng phần
của genome. Sau đó đa các đoạn cắt vào vector thích hợp. Tập hợp các vector
chứa các đoạn ADN tạo thành ngân hàng hệ gen (genomic ADN library). Bảo

113
quản ngân hàng này bằng cách ghép vào phage (ghép đoạn ADN 10-15 kb),
cosmid (ghép đoạn ADN 50 kb) hay BAC (ghép đoạn ADN 100 kb).
Các giai đoạn chính tạo một clone (thể mang ADN lạ)
Xây dựng nhân hàng hệ gen dùng vector (hệ gen thực khuẩn)
Sử dụng loại vector khác nhau sẽ có những ngân hàng khác nhau cho một
cá thể. Từ ngân hàng hệ gen, muốn tìm đợc một clone với xác xuất P thì số
vector N mang clone (ADN) cần phải sử dụng là:
N =
)
1
1ln(
)1ln(
n
P


n: số đoạn ADN cắt từ genome
N: số vector cần sử dụng
Ví dụ genome của ngời khoảng 2,8.10
9
bp bị cắt thành các đoạn 20 kb. Ta có
n = 1,4.10
5
. Để tìm một clone với sác xuất 95% thì cần lấy từ ngân hàng N =
4,2.10
5
phân tử ADN tái tổ hợp. Nếu muốn tìm thấy với xác xuất cao hơn (99%)
thì số phân tử cần phải lấy là N = 6,5.10
5

.
Từ các mô khác nhau có thể xây dựng đợc một ngân hàng hệ gen nhng
nhiều ngân hàng cADN (từ các m-ARN) vì từ các mô khác nhau thu đợc các m-
ARN khác nhau. Nh vậy mỗi cá thể có thể xây dựng một ngân hàng hệ gen và
nhiều ngân hàng cADN khác nhau đặc trng cho từng mô khác nhau.
Ngân hàng hệ gen
Genomic library
Ngân hàng cADN
cADN library

Sự khác nhau giữa các clone của hai ngân hàng gen
Các phơng pháp lai ghép acid nucleic
114
Kỹ thuật lai ghép acid nucleic đợc áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu
genome, gen và biểu hiện của gen. Nguyên tắc của phơng pháp là tạo sợi acid
nucleic liên kết bổ sung giwax hai sợi đơn ARN, ADN hay ADN/ARN.
Khi ở nhiệt độ cao hay nồng độ muối thấp, phân tử lai (dạng sợi kép) chỉ đợc
hình thành nếu độ tơng đồng giữa hai sợi cao. Do vậy tùy mục đích nghiên cứu
(phát hiện số lợng bản sao gen trong genome hay số lợng m-ARN của gen, )
mà thay đổi điều kiện của phản ứng lai.
Thông thờng sợi đơn mồi (sợi đơn dùng làm mồi) đợc đánh dấu dấu bằng
nguyên tử phóng xạ (P
32
) hay bằng các chất phát huỳnh quang. Do vây phát hiện
sợi đích lại với sợi mồi nhờ phim nhạy phóng xạ hoặc nhờ các kỹ thuật nhuộm
màu. Để đảm bảo an toàn cho ngời thực hiện, càng ngày càng a dùng chất
không phóng xạ trong các phòng thí nghiệm hiện đại.
Phơng pháp Southern blots
Phơng pháp này nhằmphân biệt một đoạn ADN nhất định trong số các đoạn bị
cắt bởi men giới hạn do Edward Souther phát minh. Phơng pháp đòi hỏi một đoạn

ADN hoặc ARN đã biết đợc sử dụng làm mồi (làm đầu dò probe để lai với ADN
cần tìm. Mồi thờng đợc đánh dấu bởi chất phóng xạ hoặc chất phát mầu.
Các đoạn ADN bị cắt đầu tiên đợc phân ly trên gel agrarose. Sau đó các sợi kép
ADN (trên gel) bị biến tính (do xử lý với kiềm) và đợc chuyển sang một màng (thờng
là màng nylon hoặc nitrocellulose). Các đoạn cắt đợc lai với mồi đặc hiệu đã đánh
dấu. Vị trí các đoạn lai đợc xác định nhờ phim có độ nhạy đặc hiệu với phóng xạ. Ph-
ơng pháp này cho phép xác định đoạn ADN duy nhất (xuất hiện 1 lần trong hệ gen ~
1/10
6
) khi chỉ dùng 5 g ADN genome. Thông thờng đoạn ADN mồi có kích thớc
không quá 5 kb đợc dùng làm khuôn để tổng hợp ADN mới (ADN đích) từ các đoạn
nucleotid đã đánh dấu. Trong phản ứng này có thể dùng ADN polymerase và các
ADN mồi ngẫu nhiên 6 nucleotid (hexamer). Các đoạn ADN đích (do tổng hợp mới)
thờng có độ dài từ 300-1000 nt (nucleotid).
Thờng dùng bản đồ các vị trí giới hạn của đoạn NST chứa gen để nghiên cứu
biến đổi diễn ra ở một gen bất kỳ. Trớc hết vùng ADN chứa gen của ca s thể bình th-
ờng và cá thể đột biến đợc cắt bởi các men có vị trí nhận biết nằm trong vùng đó. So
sánh bản đồ vị trí (do lai Southern blots) giữa hai cá thể có thể phát hiện những biến
đổi (nh thêm đoạn, mất đoạn hay thay đổi trật tự các đoạn ADN nằm trong vùng đó.
115
Sự thay đổi nucleotid khó bị phát hiện ngoại trừ sự thây đổi đó làm thay đổi vị trí nhân
biết của men giới hạn.
ứng dụng lai Southern blots để phát hiện số lợng bản sao một gen trong
genome, sự thay đổi trật tự sắp xếp các đoạn ADN lạ, sự thay đổi vị trí các
transposon, phân biệt một gen trong họ gen, xác định các intrôn và exon của 1 gen
Khi sử dụng các chỉ thị phân tử (ADN-marker) làm mồi chúng ta có thể phân biệt
các loài, các cá thể dới loài.
Phơng pháp Northern blots
Cơ chế tơng tự nhng ở đây m-ARN đợc lai với mồi ADN (ARN)
Sử dụng phơng pháp này để xác định mức độ hoạt động của gen. Với những

gen mà m-ARN đợc tổng hợp ít thì trớc khi tiến hành lai Northern (ghép cặp bổ sung
với ADN/ARN mồi) có thể làm giàu m-ARN bằng cách phân lập chúng khỏi các
ARN khác nhờ cho qua cột gắn poly-T . Nh vây các m-ARN mang đuôi A sẽ bị giữ
lại. Chú ý m-ARN dễ bị biến tính nên thao tác cần chính xác và cẩn thận nghiêm
ngặt.
Phơng pháp lai in-situ
Phát triển từ phơng pháp lai Southern, kỹ thuật này sử dụng mồi là những
đoạn nucleotid hoặc kháng thể đánh dấu để lai ghép với ADN, ARN hoặc protein
ngay trong tế bào mà không cần tách chiết chúng. Các mồi oligonucleotid (đánh
dấu bằng chất phát huỳnh quang).
116
Ngày nay kỹ thuật nano-fish (fluorence-in-situ-hybridisation) sử dụng các
chất mầu khác nhau cho phép phát hiện các đột biến ở từng nucleotid, kiểu đột
biến (đứt gẫy liên kết đờng-base hay nu nu. v.v.).
5.2.3 Sự chuyển vị (transposition)
+ Sự chuyển vị transposon
Trong cơ chế này sự di chuyển của một transposon đợc thực hiện qua sự
tách rời của nó khỏi vị trí cũ và sau đó gắn vào vị trí mới. Cơ chế di chuyển này
không làm thay đổi số lợng transposon. Vị trí cũ bị gẫy rời đợc nối lại nhờ cơ chế
sửa chữa ADN trong tế bào. Kiểu di dời này chỉ đòi hỏi men transposase. Tại vị
trí mới, một đoạn nucleotid ngắn đợc sao thành hai bản, mỗi bản nằm ở một đầu
của transposon (kiểu lặp lại trực tiếp = direct repeat). Sơ đồ mô tả quá trình này
trong hình vẽ dới đây:
Sự tái bản thể thực khuẩn Mu vào genome vi khuẩn (E. coli) là ví dụ điển
hình về transposon. Tơng tự thể thực khuẩn , thể thực khuẩn Mu (phage Mu)
cũng có hai trạng thái tan và không tan. Đặc điểm của phage Mu trong trạng thái
117
tan là khi gắn vào vị trí mới chúng tái bản ADN theo cách sao y bản chính. Bản
thân phage Mu có hệ gen (38.000 bp) chứa các gen liên quan tới quá trình di dời
và các gen mã hóa protein cấu trúc có chức năng đóng gói ADN tạo thể phage

mới. Phage Mu đợc giới hạn bởi hai đoạn ADN (nucleotid) lặp lại ngợc chiều và
nhờ thế chúng tạo ra theo cách lặp lại trực tiếp (direct repeat) các đoạn mạch
đơn ADN còn trống.
ở sinh vật nhân thực (Eucaryota), các transposon còn đợc gọi là yếu tố kiểm
soát (controlling element). Các nghiên cứu điển hình về transposon đợc tiến
hành ở ngô (Zea mais) và ruồi giấm (Drosophila).
Hai transposon AC và Ds đợc nghiên cứu khá kỹ ở ngô. Trong đó sự di dời
của Ds phụ thuộc vào Ac. Mọi Ds chịu sự kiểm soát của Ac đều có cùng hai
đoạn lặp lại ngợc chiều (11 bp) nh trong Ac.
Trên một NST của tế bào soma có gắn một transposon Ds, nếu quá trình
phát triển tế bào nhờ nguyên phân có sự di dời của Ds thì thế hệ tế bào đợc sinh
ra biểu hiện tính trạng bất thờng. Hiện tợng này gọi là "variegation" hay "mosaic"
118
(xuất hiện đốm). Quá trình di dời xảy ra ở tế bào soma gây ảnh hởng đến biểu
hiện của một allen của một gen bất kỳ.
ở ruồi giấm Drosophila melanogaster, yếu tố P có khả năng di dời gây bất
thụ ở các con lai giữa con đực dòng P và con cái dòng M. Transposon P (2907
bp) chứa gen mã hóa cho transposase. Trong tự nhiên số lơng "P" thay đổi từ
một vài đến 50 bản sao trong hệ gen ruồi giấm. Con cái dòng P lai với con đực
dòng M vẫn cho thế hệ con lai bình thờng vì trong trứng con cái P chứa yếu tố
kìm hãm di chuyển của "P" (di truyền theo mẹ). Tế bào trừng dòng M (không có
nhân tố kìm hãm di dời của "P") thụ tinh với con đực dòng M cho phép "P" di dời
gây ra những rối loạn bất thờng trong cấu trúc hệ gen dẫn đến con lai bất dục.
Yếu tố "P" chỉ phát hiện thấy ở thế hệ ruồi giấm sau 1950; có lẽ do virus xâm
nhiễm ruồi giấm. Hiện tợng này cũng thấy ở vi khuẩn nhiễm thực khuẩn thể
mang "IS".
+ Sự tải nạp ADN vi khuẩn của transposon vào hệ gen thực vật
Bệnh phát sinh nốt sần hoặc mọc nhiều rễ chỉ xuất hiện khi có mặt
Argobacter (Argobacterium lumefaciens hay A. rhizogenes). Sau đó bệnh duy trì
không phụ thuộc sự tồn tại của vi khuẩn. Điều đó chứng tỏ gen gây bệnh đã di

chuyển từ vi khuẩn sang thực vật (hầu hết cây hai lá mầm). Hiện t ợng này của
bệnh mang tính đặc hiệu (chỉ ứng với loài thực vật nhất định).
Điều kiện tải nạp ADN này gồm:
(1) Có các gen hoạt động trên 3 vùng chv-A, chv-B và psc-A trên NST của vi
khuẩn để khởi động sự bám dính vi khuẩn vào thân cây chủ.
(2) Plasmid Ti phải mang vùng vir-ADN (nằm ngoài đoạn T-ADN) chứa các
gen cho việc tách và tải T-ADN sang tế bào thực vật.
(3) Các gen trên T-ADN khi gắn vào hệ gen thực vật phải có khả năng gây
biến đổi trạng thái các tế bào chủ.
119
Vai trò các gen trên vùng vir (vir-ADN):
Cơ chế tải nạp T-ADN sang tế bào thực vật gồm các bớc chính:
(1) Cắt bóc T-ADN khỏi hệ gen vi khuẩn
(2) Vận tải T-ADN vào tế bào thực vật
(3) Chèn ghép T-ADN vào hệ gen tế bào thực vật
Cắt bóc T-ADN khỏi hệ gen vi khuẩn
Protein Vir-C1 nhận biết và tơng tác với nucleotid đầu bên phải của đoạn T-
ADN. Đột biến ở đầu này (đoạn 25 bp bên phải) thì sợi đơn T-ADN không đợc cắt
ra. Tại vị trí cắt mạch đơn của T-ADN các liên kết của từng cặp nucleotid (bp) đứt
dần theo hớng về bên trái. Hết đoạn mạch đơn T-ADN thì đứt rời ra và ta có một
mạch đơn T-ADN tự do.
Vận tải T-ADN vào tế bào thực vật
Vận tải sợi "T" khỏi vi khuẩn và ghép vào hệ gen tế bào cây chủ đòi hỏi sự tham
gia của nhiều protein. Trong đó operon vir-B (9.500 bp) trên vùng vir max cho 11 loại
protein tiết và phân bố trên màng bào. Trong đó có ATP-ase (protein Vir-B-11) và
các protein kỵ nớc tạo thành kênh dẫn T-ADN trên màng thông sang tế bào thực vật.
120
Các gen trên T-ADN (tổng kích thớc khoảng 23.000 bp tùy loài vi khuẩn) nằm
trên plasmid Ti. Mỗi đầu có chứa 25 bp lặp laik giống nhau hoàn toàn, chỉ khác
nhau ở 2 nucleotid tận cùng. Nucleotid tận cùng bên phải có vai trò khi cắt T-

ADN; Trong khi nucleotid tận cùng bên trái giữ vai trò quan t5rọng khi ghép T-
ADN vào genome cây chủ.
Trên T-ADN chứa hai nhóm gen (nhóm oncogen và nhóm opine).
- Nhóm oncogen có mặt ba gen mã hóa các men tham gia tổng hợp hormon
sinh trởng thực vật (auxin) và cytokinin. Tế bào cây chủ có ghép T-ADN vào
hệ gen thì phát triển bất thờng (sinh ra nốt sần). Nếu đợc ghép R-ADN (gây
phát triển rễ) của A. rhizogenes thì cây chủ mọc nhiều rễ.
- Nhóm th hai trên T-ADN gồm các gen mã hóa các men tham gia tổng hợp
những phức chất dinh dỡng cho sự phát triển của vi khuẩn. Tế bào cây chủ có
ghép T-ADN thì sự tổng hợp opine trong tế bào cây chủ trở thành tín hiệu
phát hiện sự thành công của việc ghép T-ADN vào tế bào cây chủ.
Argobacterium có khả năng tải nạp các gen lạ vào genome thực vật. Ngoài
ra promotor (gen khởi động) trên T-ADN hoạt động rất mạnh cả trong tế bào chủ
nên dễ đợc sử dụng làm promotor báo cáo hoặc promotor điều khiển trong kỹ
thuật chuyển gen.
5.2.4 Sự di truyền các cơ chế miễn nhiễm
Hệ miễn dịch động vật có xơng sống
Tế bào lympho-B và lympho-T rất quan trọng trong hệ miễn dịch ở động vật
có xơng sống.
T-lymphocyte tiết ra thụ thể TCR (T-Cell-Receptor) phân bố trên màng bào.
B-lymphocyte tiết ra các chất miễn dịch Igs (immunoglobulin) phân bố trên
màng bào hoặc ra gian chất nh các kháng thể (antibody).
Các thụ thể TCR và các Igs đều có cấu trúc chứa hai chuỗi nặng (haevy
chain = IgH) và hai chuỗi nhẹ (light chain = IgL

và IgL

). Các TCR (protein) có
hai loại chuỗi nặng và hai loại chuỗi nhẹ; trong khi đó các protein Igs có một loại
chuỗi nặng IgH và hai loại chuỗi nhẹ IgL

và IgL

. Các protein TCR gồm có -
TCR và -TCR.
Các chuỗi tham gia cấu tạo Igs và TCR có cấu trúc tơng tự nhau (đầu
COOH là vùng bảo thủ constant region gắn với chức năng cấu trúc; đầu NH
2
là vùng siêu biến hypervariable region gắn với khả năng nhận biết kháng
nguyên).
Các kháng thể (Igs) có khả năng nhận biết 10
6
-10
8
phân tử kháng nguyên
khác nhau nhờ 2 yếu tố là sự đa dạng của các gen liên đới có sẵn (germline
diversity) trong tế bào và sự tái tổ hợp đặc hiệu các gen đó (somatic diversity)
tạo ra các gen mới.
Sự di truyền các cơ chế miễn nhiễm
Sự tái tổ hợp phụ thuộc loại tế bào lympho trong cơ thể (tính đặc trng cá thể).
Đặc biệt vùng siêu biến đợc mã bởi tổ hợp 3 loại gen (ADN) là V (variable-linh
động), D (diversity-tính đa dạng) và J (junctional-kết nối). Số lợng mỗi loại gen
và sự phân bố vị trí trên NST là khác nhau. Sự sắp xếp các đoạn gen này diễn ra
theo cách thức trao đổi chéo đặc hiệu để tạo ra kháng thể đặc hiệu (protein)
121
trong từng loại tế bào lympho (tính đặc trng cá thể). Điều đó quyết định tính đặc
hiệu và tính đa dạng của các kháng thể trong phản ứng miễn dịch của cơ thể.
Số lợng các đoạn V, D, J trong hệ gen ngời và chuột nh sau:
Loài Loại Igs
Vị trí và số lợng đoạn (gen)

V D J
Ngời
IgH
86 30 9
IgL


76 - 5
IgL

52 0 7
Chuột
IgH
>1500 12 4
IgL


>200 - 4
IgL

2 - 4
5.3 Di truyền học tiến hóa
5.3.1 Di truyền học quần thể
5.3.2 Biến dị
Thực chất sự biến dị
Trong qua trình sinh sản và sinh trởng của mỗi cá thể đều diễn ra quá trình
phân bào hoặc nguyên nhiễm hoặc giảm nhiễm. Môi trờng sống trong và ngoài
cơ thể luôn biến động và đều tác động tới các hoạt động của NST gây ra những
biến đổi về sự tổ hợp cặp NST tơng đồng, về cấu trúc và số lợng NST trong bộ
NST, cũng nh về cấu tạo bộ NST ở cá thể thế hệ con-cái so với thế hệ bố-mẹ.

Đó là những nguyên nhân làm xuất hiện các đặc điểm mới ở cá thể đời sau có
thể tiếp tục di truyền đợc.
Những cá thể con-cái biểu hiện đặc điểm sai khác ấy gọi là cá thể do biến dị
- Mutante = Bastard. Tỷ lệ số cá thể này trong tổng số cá thể của quần thể gọi là
tỷ lệ biến dị hay tần số biến dị - Mutationsrate. Tần số biến dị tự nhiên (số trung
bình) thờng khác nhau tùy theo loài: 1/20.000-1/200.000 ở thực vật, 1/100.000-
1/2000.000 ở tế bào sinh dục ruồi giấm, 1/35.000-1/45.000 ở chuột nhà,
1/20.000-1/45.000 ở ngời. Nguyên nhân gây biến dị có thể do nhân tố bên trong
(gen, tế bào chất) hay nhân tố bên ngoài (ánh sáng tử ngoại, tia rơn-gen, chất
phóng xạ, peroxyde, natrium-nitrit, formalin, ). Các nhân tố này không có tính
định hớng hay ấn định trớc cách thức biến đổi đặc tính mà chỉ có tác dụng làm
tăng tỷ lệ cá thể có biến dị. Sự chọn lọc đầy tính kế hoạch là con đờng thích hợp
nhất trong tạo giống động-thực vật.
Dù là tính trạng chất lợng hay tính trạng số lợng thì các NST trong bộ NST
của loài cũng đều trải qua 4 khâu khi sinh sản: phân ly cặp NST tơng đồng,
nhân đôi NST, phân ly NST kép và tái tổ hợp cặp NST tơng đồng. Trong quá
trình đó, rất nhiều yếu tố lý hóa tác động gây ra hậu quả là một số hợp tử có
những sai khác về gen (do đột biến gen), về cấu trúc NST (do trao đổi đoạn
NST), về số lợng NST (do rối loạn khâu phân ly NST kép) hay về trạng thái cặp
NST tơng đồng (do tái tổ hợp tự do các NST từ các nguồn cá thể khác nhau). Chỉ
riêng những sai khác này đã ảnh hởng tới giá trị kiểu hình mà biểu hiện cuối
122
cùng là tỷ lệ các cá thể cùng kiểu hình không giống nh khi quá trình diễn ra theo
quy luật di truyền các tính trạng.
Cánh bình thờng (trái)
Các dạng cánh biến di (phải)
Các dạng cánh biến dị
Mắt đỏ bình thờng, các dạng mắt biến dị
Có thể phân biệt 3 dạng biến dị là đột biến gen, đột biến NST và đột biến bộ NST:
Đột biến gen: là kết quả do rối loạn quá trình nhân đôi NST gây ra những biến

đổi về cấu tạo mạch ADN (thêm, bớt, đảo vị trí, đổi mới nucleotit trong mạch ADN).
Khi có đột biến gen thì tỷ lệ tính trạng ở con-cái thay đổi nếu là lai phân tích
hay lai phân tính về cặp gen đó. Kết quả biến đổi gen trong quá trình sinh giao tử
thờng có 2 dạng đột biến gen:
a => A (tỷ lệ con-cái mang tính trội > 3/4)
hay A => a (tỷ lệ con-cái mang tính lặn > 1/4).
Đột biến NST(TĐ-đoạn NST): là sự biến động cấu trúc NST do rối loạn phân
ly cặp NST kép tơng đồng (thêm, bớt, trao đổi, đổi mới đoạn NST) dẫn tới biến dị
cặp gen và kiểu gen của cá thể, cũng chính là thay đổi tỷ lệ kiểu hình bình thờng
ở thế hệ con-cái.
Sự nhân đôi và phân ly bình thờng của cặp NST:
cBa
CbA




2x
ccBBaa
CCbbAA




2 giao tử
CbA

và 2 giao tử
cBa

Sự nhân đôi và phân ly bất thờng của cặp NST nói trên:
cBa
CbA




2x
ccBBaa
CCbbAA




giao tử
CbA

và 2 giao tử
cBa

Đồng thời xuất hiện mới 1 giao tử
cbA

và 1 giao tử
CBa


Số giao tử xuất hiện mới này (do trao đổi đoạn NST = TĐĐ NST) có cấu trúc
khác với NST ban đầu nên khi giao tử của cá thể này kết hợp với NST t ơng đồng
trong giao tử của cá thể ngợc giới tính sẽ đợc những cá thể con-cái có KG (cũng

là KH) khác thờng. Tỷ lệ tế bào sinh dục sơ khai khi giảm phân có xảy ra TĐĐ
NST là cơ sở dẫn tới tỷ lệ KG và KH ở con cái. Mỗi tế bào sdsk có TĐĐ NST sẽ
cho 2 giao tử với NST có biến dị, nh vậy có f% tế bào sdsk sẽ cho 2f% giao tử
với NST có biến dị.
123
cBa
CbA


CbA

cBa

cbA

CBa

CbA

CbA

CbA

CbA

cBa

CbA

cbA

CbA

CBa

cBa

cBa

CbA

cBa

cBa

cBa

cbA

cBa

CBa

cbA

cbA

CbA

cbA

cBa

cbA

cbA

cbA

CBa

CBa

CBa

CbA

CBa

cBa

CBa

cbA

CBa

CBa

Các kiểu gen bình thờng

CbA
CbA


,
cBa
CbA


,
cBa
Ba

c

Các kiểu gen biến dị đơn
cbA
CbA


,
cBa
CbA


,
CBa
CbA

Các kiểu gen biến dị kép
cbA
CbA


,
CBa
cbA


,
CBa
CBa


Tùy theo tơng tác của các gen trong kiểu gen mà 6 kiểu gen biến dị có dẫn
đến kiểu hình biến dị hay không.
Đột biến số lợng NST: Sự bất thờng khi phân ly NST kép gây thừa-thiếu
NST trong bộ NST ở thế hệ F.
Dị bội (đa bội lệch): sự thừa hay thiếu 1 NST của ít nhất 1 cặp NST tơng
đồng trong bộ NST của cá thể do rối loạn phân ly cặp NST kép);
Đa bội chỉnh: Sự thừa-thiếu 1 NST ở tất cả các cặp NST tơng đồng trong
bộ NST của cá thể cũng do nguyên nhân và trình bầy dẫn đến tạo ra cá thể tam
bội, tứ bội ).
Tổng hợp các KG ở F (với những ví dụ bệnh lý cặp NST giới tính ở ngời)
G
G
O X XX XXXX
O
Hợp tử

XO (tớcnơ)
XXO XXXXO
X
XO (tơcnơ) XX
XXX (siêu
nữ)
XXXXX
Y
YO (chết lu) XY XXY (Claif.)
XXXXY
XX
XXO
XXX (siêu
nữ)
XXXX XXXXXX
YY
YYO
XYY (siêu
nam)
XXYY XXXXYY
XY
XYO
XXY (Claif.)
XXXY XXXXXY
124
XX
YY
XXYYO XXXYY XXXXYY
XXXXXX
YY

Chú ý: thực tế mới gặp những dạng hợp tử in đậm và gạch chân trong bảng
YO (chết lu): con trai (chết ngay trong giai đoạn phôi)
XO (tơcnơ): hội chứng Turner (lùn, cổ ngắn, trán thấp, không có con) ở nữ
XXY (Claifent): hội chứng Clinefelter (tinh hoàn teo, vô sinh, trí tuệ kém)
XXX (siêu nữ): siêu nữ (buồng trứng, dạ con kém PT, vô sinh, si đần)
XYY (siêu nam): siêu nam (tính tình mạnh bạo, dễ gây tội lỗi)
Cặp NST tam nhiễm hay tứ nhiễm có tổng số loại giao tử là 6 dẫn đến tổng
số KH ở con-cái là số chia hết cho 6. Nh vậy khi tổng tần số KH (

KH) là số
chia hết cho 6 thì 1 cá thể bố-mẹ trong phép lai có 1 cặp NST dị bội (tam
nhiễm hay tứ nhiễm); nếu

KH chia hết cho 36 thì 1 cá thể trong phép lai có
2 cặp NST dị bội (tam nhiễm hay tứ nhiễm) hoặc có 1 cặp NST dị bội (tam
nhiễm hay tứ nhiễm) ở cả 2 cá thể bố-mẹ trong phép lai.
Cá thể và tần số các giao tử đối với 1 CG (1 cặp NST )
KG cá
thể
kiểu và tần số giao tử Số loại giao
tử
tổng tần số giao
tử
Aa 1A và 1a 2 2
AAa 1AA ; 2Aa ; 2A và 1a 4 6
Aaa 1aa ; 2Aa ; 1A và 2a 4 6
AAaa 1AA ; 4Aa và 1aa 3 6
5.3.3 Chọn lọc
Cơ bản về chọn lọc
Quá trình tiến hóa diễn ra dới tác động của 4 nhân tố cơ bản: sự biến dị, sự

chọn lọc, sự ngẫu nhiên và sự cách ly [ABC Biologie, 1967, tr. 229].
Sự biến dị về cấu trúc gen, về số lợng NST, về trạng thái tổ hợp NST trong
quá trình sinh sản là nguồn cung cấp những cá thể có biến dị (có sai khác nhỏ
hay lớn trên kiểu hình) cho sự chọn lọc.
Chọn lọc tự nhiên là sự chọn lọc giữ lại những cá thể có biến dị thích ứng
với điều kiện môi trờng tự nhiên tuân theo quy luật tự nhiên.
Sự ngẫu nhiên là dới cùng một điều kiện môi trờng có thể đồng thời tạo ra
những cá thể có biến dị khác nhau và cùng đợc phát huy theo những nội dung
khác nhau của một môi trờng.
Sự cách ly là những điều kiện môi trờng gây ra cản trở sự giao phối tự do của
các cá thể cùng loài (sông, núi, ) vì giao phối tự do có đặc điểm trao đổi gen (cùng
allen) và có đặc tính thích ứng địa lý khác nhau nên thờng hình thành đợc những tổ
125