di truyền phân tử 06

Chơng 7 ứng dụng của di truyền học
7.1 ứng dụng trong Chọn lọc và cải tạo giống
7.1.1 ứng dụng trong chọn giống
Chọn giống là sự lựa chọn các cá thể đực và cái để giữ lại làm giống, đồng
thời loại ra những cá thể không làm giống. Sự tuyển chọ và loại thải này thùy
thuộc vào mục đích và phơng pháp chọn giống; do vậy đây là hình t6hức chọn
lọc nhân tạo. Ngoài tác động của chọn lọc nhân tạo, đặc tính di truyền của giống
còn chịu ảnh hởng của chọn lọc tự nhiên.
Tần số gen của quần thể giống bị thay đổi qua 3 giai đoạn: giai đoạn đầu do
tác động của chọn lọc nhân tạo (chọn phối và nuôi dỡng), giai đoạn hai do chọn
lọc tự nhiên tác động (các yếu tố môi trờng tự nhiên) và giai đoạn ba do tác động
của chọn lọc tự nhiên tới sức sống của thế hệ con cái [Nguyễn Hải Quân và cộng
sự, 2005, tr. 83].
Tuy chọn lọc tự nhiên có ảnh hởng trong quá trình chọn lọc, nhng không có
liên quan sâu sắc tới các gen chi phối tính trạng số lợng nên không cần thiết đề
cập trong các nội dung chọn giống.
Hệ số di truyền trong chọn giống
Hệ số di truyền là thành phần xác định hầu hết những tham số quan trọng
trong chọn giống.
Hiệu quả
chọn lọc
(R)
R = h
2
.S = h
2
.i.
P
Cờng độ chọn lọc (i)
Tiến bộ
di truyền

(g)
Độ chính xác
chọn lọc
(r
AP
)
-Dùng 1 giá trị KH trên bản thân:
-Giá trị KH lặp lại m lần trên bản thân:
Nh vậy hiệu quả chọn lọc hàng năm R = (r
AP
.i.
A
)/L và tiến bộ di truyền
hàng năm g = (r
AP
.i.
A
)/L
Để đánh giá giá trị di truyền của một tính trạng có thể sử dụng giá trị KH về
tính trạng đó trên các đối tợng: bản thân con vật, tổ tiên của nó, anh chị em của
nó và đời con của nó. Searle (1963) đã xây dựng các công thức tính toán độ
chính xác của chọn lọc khi sử dụng một trong các nguồn thong tin này.
161
Bảng tra độ chính xác chọn lọc theo h
2
, R và m
m 1 2 3 4 5
h
2
R 0.2 0,4 0,6 0,2 0,4 0,6 0,2 0,4 0,2 0,4 0,6

0,1 0,32
0,41 0,38 0,36 0,47 0,41 0,37 0,51 0,43 0,38 0,53 0.44 0,39
0,2 0,45
0,58 0,54 0,50 0,66 0,58 0,52 0,71 0,61 0,54 0,75 0,63 0,54
0,3 0,55
0,66 0,61 0,71 0,64 0.74 0,66 0,76 0,67
0,4 0,63
0,76 0,70 0,81 0,73 0,83 0,76 0,88 0,76
0,6 0,77
0,85 0,89 0,92 0,93
Trích theo Nguyễn Hải Quân, 2005, tr. 92
a) Trờng hợp giá trị kiểu hình của tính trạng đợc xác định trên bản thân con
vật, ví dụ tính trạng tăng khối lợng trung bình của gia súc nuôi thịt và tính trạng
độ dày mỡ lng của lợn đực giống.
Ví dụ: chọn lọc một bò cái có h
2
= 0,3 và hệ số lặp lại R = 0,4.
- Nếu chỉ căn cứ vào sản lợng sữa của một kỳ tiết sữa , độ chính xác của chọn
lọc là r
AP
=
2
h
=
3,0
= 0,55.
- Nếu căn cứ sản lợng sữa trung bình của 3 kỳ tiết sữa thì độ chính xác của
chọn lọc là r
AP
=

R).1m(+1
h.m
2
=
4,0).13(+1
3,0.3
= 0,71
b) Trờng hợp giá trị kiểu hình đợc xác định trên tổ tiên
Phơng thức sử dụng giá trị kiểu hình trên tổ tiên Độ chính xác chọn lọc
1 giá trị kiểu hình trên bố hoặc mẹ r
AP
=
2
h
2
1

Vài giá trị kiểu hình trên bố hoặc mẹ
1 giá trị KH trên bố và 1 giá trị KH trên mẹ r
AP
=
2
h
2
1
Trên mỗi tổ tiên (bố, mẹ, ông nội, bà nội, ông ngoại,
bà ngoại) sử dụng 1 giá trị KH
Trên s anh chị em mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH
Trên s anh chị em nửa ruột thịt mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH
Trên p con cái mỗi cá thể cùng 1 giá trị KH

Độ chính xác của chọn lọc dựa trên nguồn số liệu giá trị KH khác nhau
Hệ
Số
TStiSn
Bản
Thân
Anh chị em Đời con
162
Bố
Và
Mẹ
Bố
Mẹ
ông
bà
nội
ngoại
Ton
hQ
t6
liSn
íiố lợng
Anh chị em ruột
Số lợng anh chị em
Nửa ruột thịt
Số lợng đời con
2 4 8 5 10 20 40 5 10 20 40 80 120
0,1 0,22 0,27 0,29 0,32 0,22 0,29 0,38 0,17 0,23 0,29 0,36 0,34 0,45 0,58 0,71 0,82 0,87
0,2 0,32 0,37 0,39 0,45
0,30 0,39 0,48 0,23 0,29 0.36 0,41 0,46 0,59 0,72 0,82 0,90 0,93

0,3 0,39 0,43 0,45 0,55
0,36 0,45 0,54 0,27 0,33 0,39 0,44 0,56 0,70 0,79 0,87 0,93 0,95
0,4 0,45 0,49 0,50 0,63
0,41 0.50 0,58 0,30 0,36 0,41 0,45 0,60 0,73 0,83 0,90 0,95 0,96
0,5 0,50 0,53 0,54
0,71 0,45 0,53 0,60 0,32 0,38 0,43 0,46 0,65 0,77 0,86 0,92 0.96 0,97
0,6 0,55 0,57 0,57
0,77 0,48 0,56 0,62 0,34 0,40 0,44 0,47 0,68 0,80 0,88 0,94 0,97 0,98
0,7 0,59 0,61 0,61
0,84 0,51 0,58 0,63 0,36 0,41 0,45 0,47 0,72 0,82 0,90 0,95 0,97 0,98
0,8 0,63 0,64 0,64
0,89 0,53 0,60 0,65 0,37 0,42 0,46 0,48 0,75 0,84 0,91 0,95 0,98 0,98
0,9 0,67 0,67 0,67
0,95 0,56 0.62 0,66 0,38 0,43 0,46 0.48 0,77 0,8G 0,92 0,96 0,98 0,99
1,0 0,71 0,71 0,71 1,00 0,58 0,63 0,67 0,39 0,44 0,47 0,48 0,79 0,88 0,93 0,96 0,98 0,99
Trích từ Nguyễn Hải Quân, 2005, tr. 95
Ngoài ra, hệ số di truyền còn tham gia xác định chỉ số chọn lọc.
Đối tợng chọn lọc Công thức áp dụng
Xác định chỉ số chọn lọc 1 tính trạng
trên bản thân cá thể
I

= h
2
.X
1
Xác định chỉ số chọn lọc 1 tính trạng
từ giá trị KH lặp lại m lần
trên bản thân cá thể
(hoặc m lần từ m cá thể chị em nửa

ruột thịt cùng quan hệ di truyền cộng
gộp với cá thể )

Xác định chỉ số chọn lọc 1 tính trạng
trên bản thân cá thể
từ giá trị KH mẹ và bà ngoại
I

= b
1
.X
1
+ b
2
.X
2

Giải hệ phơng trình
b
1
+
2
1
h
2
b
2
=
2
1

h
2
và
2
1
h
2
b
1
+ b
2
=
2
1
h
2
=> I

= (4-h
2
).X
1
+ 2(1-h
2
).X
2
Xác định chỉ số chọn lọc vài tính trạng
trên bản thân cá thể
Với i tính trạng
Với 2 tính trạng

Trích theo Nguyễn Hải Quân, 2005, tr. 100, 101
Hệ số di truyền còn là tham số xác định giá trị giống (giá trị các gen mà
con giống truyền cho thế hệ sau).
Giá trị giống ớc tính Phơng thức áp dụng
163
Dùng số liệu 1 giá trị KH 1 lần từ bản thân
Dùng số liệu 1 giá trị KH nhắc lại m lần từ bản thân
Dùng i số liệu giá trị KH 1 lần từ mỗi bản thân
và những cá thể họ hàng
ứng dụng tơng tác gen trong lai giống
Lai giống là dùng hai dòng cho giao phối với nhau, hoặc cho hai cá thể thuộc
hai dòng cận huyết giao phối với nhau. Trờng hợp cho hai cá thể thuộc hai loài
giao phối với nhau thì gọi là lai xa.
Mục tiêu của lai giống là lợi dụng tơng tác trội hay siêu trội trong biểu hiện
của gen ở con lai (F
1
) nhằm nâng cao khả năng sản xuất của chúng (thịt, trứng,
sữa ), tạo điều kiện hình thành giống mới, đồng thời lợi dụng u thế lai của sinh
vật (heterosis).
Phần này không đề cập nguyên nhân dẫn đến u thế lai trong lai giống mà chỉ
phân tích kết quả do u thế lai mang lại.
Giá trị của u thế lai ở F
1
là độ lệch giá trị kiểu hình trung bình của F
1
so với
giá trị kiểu hình trung bình của cha mẹ hay của hai quần thể cha mẹ.
Trớc hết quan sát hiệu quả u thế lai trên 1 locus với 2 allen A
1
và A

2
ở 2 quần
thể P
1
và P
2
:
- Sự khác nhau về tần số của 2 allen ở hai quần thể là y (y = p - p = q - q).
Do đó p = p - y và q = q + y
Giá trị kiểu gen A
1
A
1
là +a, kiểu gen A
1
A
2
là d và kiểu gen A
2
A
2
là -a (giả
thiết các giá trị này tơng ứng bằng nhau ở hai quần thể và không xét trờng hợp
ức chế của gen).
Trung bình giá trị kiểu gen cha mẹ ở quần thể P
1
là M
P1
= a(p - q) + 2dpq
và ở quần thể P

2
là M
P2
= a(p - y - q - y) + 2d(p - y)(q + y)
= a(p - q - 2y) + 2d[(pq + y(p - q) + y
2
]
Trung bình giá trị kiểu gen bố mẹ ở cả hai quần thể là
P
M
=
2
1
(M
P1
+ M
P2
)
= a(p q y) + d[(2pq + y(p q) y
2
]
Các cá thể quần thể P
1
giao phối ngẫu nhiên với quần thể P
2
tạo ra F
1
.
Tính tần số hợp tử ở F
1

:
164
P
1
P
2
pA
1
q
(p y)A
1
A
1
A
1
p(p y)
A
1
A
2
q(p y)
(q + y)A
2
A
1
A
2
p(q + y)
A
2

A
2
q(q + y)
Kiểu gen, tần số kiểu gen và giá trị kiểu gen ở F
1
Kiểu gen A
1
A
1
A
1
A
2
A
2
A
2
Tần số kiểu gen
p(p y) 2pq + y(p q) q(q + y)
Giá trị kiểu gen
+a d -a
M
P1
(Trung bình kiểu gen F
1
)
a(p q y) + d[2pq + y(p-q)
H
F1
= M

P1
-
P
M
(u thế lai ở F
1
)
dy
2
= d(p p)
Nh vậy u thế lai ở F
1
phụ thuộc d, p và p:
- Hiện tợng trội của gen: d = 0 => không có u thế lai; d > a => u thế lai cực đại.
Nói khác đi u thế lai cao nhất khi có tơng tác siêu trội.
- P = P: không có u thế lai; P càng lớn hơn p u thế lai càng cao
Ưu thế lai ở F
2
: trung bình kiểu gen ở F
2
theo M = a(p q) + 2 dpq. ở F
1
, tần
số của A
1
là p -
2
1
y và của A
2

là q +
2
1
y
M
F2
= a(p -
2
1
yq -
2
1
y) + 2d(p -
2
1
y)(q +
2
1
y) = a(p q y) + d[2pq +y(p q) -
2
1
y
2
]
Ưu thế lai ở F
2
là H
F2
= M
F2

.
P
M
=
2
1
dy
2
=
2
1
H
F1
(suy giảm u thế lai cũng coi
là suy hóa cận huyết).
Trong thực tiễn, ngời ta thờng lợi dụng u thế lai ở F
1
đối với các tính trạng có
hệ số di truyền thấp vì khi đó hệ số di truyền càng thấp thì mức độ biểu hiện u
thế lai càng cao [Nguyễn Hải Quân, 2005, tr. 135-136].
7.1.2 Chọn giống động vật, thực vật và vi sinh vật
Chọn giống động vật
Chọn giống thực vật
Chọn giống vi sinh vật
7.2 Vài nét về di truyền học ngời
7.2.1 Các đặc điểm và phơng pháp nghiên cứu
7.2.2 Phân tích bộ gen ngời
7.2.3 Di truyền y học
7.2.4 Vấn đề x hội của di truyền họcã
7.3 Kỹ thuật di truyền

165
7.3.1 Kỹ thuật gen - genomic
Tách chiết, thu nhận ADN
Nguyên tắc là thu nhận ADN nguyên vẹn không bị phá hủy bởi cơ học, hóa
học. Quy trình gồm các bớc cơ bản sau:
(1) Nghiền nhanh mẫu thành dạng bột mịn trong nitrogen lỏng.
(2) Đa vào dd đệm chứa Tris. SDS (15 ml), ủ mẫu trong bể ổn nhiệt 65
0
C trong
90 phút, lắc nhẹ.
(3) Đa vào 10 ml hỗn dịch chloroform/rs camyl (tỷ lệ 24/1), lắc nhẹ 20 phút
(4) Ly tâm 10.000 vòng/phút ở 4
0
C trong 10 phút; lặp lại ly tâm; thu dịch
phía trên.
(5) Tủa bằng 15 ml isopropanol (hoặc etanol) 70%; ly tâm 14.000 vòng/phút; lặp
lại ly tâm; thu ADN đặc.
(6) Làm khô trong TE ở 4
0
C qua đêm thu đợc dung dịch chứa ADN tách chiết
(mẫu khảo sát).
Các men giới hạn enzyme restriction (endonuclease)
Các nhóm men giới hạn
Men giới hạn gồm 3 nhóm I, II và III; các men giới hạn đợc dùng phổ biến
thuộc nhóm II. Chúng có cơ chế tác động đơn giản, cắt liên kết phosphatdiester
tại vị trí nằm trong chuỗi polynucleotid (gọi là endonuclease)và không phân hủy
phân tử ADN; trong khi men giới hạn nhóm I và III cắt và phân hủy phân tử ADN
tại vị trí đầu.
Đăc điểm Nhóm I Nhóm II Nhóm III
Điểm cắt

Xa vị trí nhận biết
(> 1000 bp)
Trong điểm nhận biết Ngoài điểm nhận biết
Khả năng metyl hóa
gốc Adenin
có Không Có
Điều kiện để cắt ATP, Mg
++
, S-adomet Mg
++
hoặc Mn
++
Mg
++
, S-adomet
Số chuỗi của men Khác nhau Giống nhau Khác nhau
Khả năng metyl hóa gốc adenin của nhóm men giới hạn I và III
166
Gọi tên men giới hạn theo quy định quốc tế:
Đặc điểm hoạt động
- Có tính đặc hiệu: mỗi men nhận biết một đoạn ADN riêng (gồm từ 4 đến 8
bp). Mỗi đoạn ADN đợc lặp lại khác nhau trong phân tử ADN. Đoạn 4 bp thì cứ 4
4
= 256 bp, đoạn 5 bp thì cứ 5
4
bp = 1024 bp, đoạn 6 bp thì cứ 6
4
= 4096 bp lặp lại
một lần. Cùng một phân tử ADN, nhng cắt bởi men giới hạn nhận biết 4 bp sẽ đ-
ợc nhiều hơn và chiều dài ngắn hơn các đoạn ADN so với cắt bởi men nhận biết

đoạn ADN 5 hây 6 bp.
- Có hai loại hình dạng đầu bằng blunt end và đầu so le hay đầu dính
sole cobesive end của đoạn cắt đợc tạo ra tùy theo men giới hạn cụ thể. Loại
đầub dính có 2 kiểu: kiểu đầu 3 nhô ra và kiểu đaauf 5 nhô ra.
Men giới hạn cắt đầu bằng
- Afu I
- Hea II
- Hnd II
- Sma I
Men giới hạn cắt đầu dính 5
- Banh I
- Bg II
- Cfa I
- Ecofd
- Hnd II
- Hpa II
- Mbo I
- Pru I
- Aru I
- Xma I
- Not I
Men giới hạn đầu dính 3
- Kpn I
- Pat I
- Men giới hạn khác nhau cắt cùng một phân tử ADN thành những đoạn có
kích thớc khác nhau. Nếu sử dụng phối hợp nhiều men giới hạn khác nhau để cắt
cùng một phân tử ADN sẽ thu nhận đợc nhiều đoạn ADN kích thớc (số lợng bp)
khác nhau. Chạy điện di hỗn hợp các đoạn ADN của một mẫu ADN; sau đó so
sánh kết quả trên băng điện di với băng điện di của ADN chuẩn (đã biết cấu trúc
các đoạn nucleotid) sẽ tìm ra trật tự phân tử ADN khảo sát.

Sử dụng men giới hạn trớc hết để lập bản đồ cắt giới hạn. Căn cứ vào trình tự
nucleotid của đoạn nhận biết theo từng men và vào sự phân tích trình tự các
đoạn theo ADN chuẩn sẽ suy ra trình tự nucleotid của phân tử ADN khảo sát.
167
Ngoài ra còn sử dụng men giới hạn RE (restriction enzyme) phối hợp với men
nối đoạn ADN để gắn các đoạn ADN vào vector (vật tải gen) tạo ADN tái tổ hợp
[Chu Hoàng Mậu, 2005, tr. 61-66].
Các vector chuyển gen
Vector chuyển gen là ADN dạng vòng, có khả năng gắn đợc một đoạn ADN
có thể xâm nhập tế bào vật chủ (phần lớn là vi khuẩn) để tạo các bản sao (hệ
gen tạp - có gắn gen lạ) khác giống hệt vector ban đầu (hệ gen tế bào chủ).
ứng dụng của vector
- Tạo dòng: Vector gắn với đoạn ADN nhất định (gọi là một dòng) nhằm để
nhân bản đoạn ADN (gắn với vector) xác định.
- Sản xuất ARN với số lợng lớn từ ADN đã tạo dòng
- Sản xuất protein với số lợng lớn từ ADN đã tạo dòng
Đặc tính cần có của một vector
- Độc lập tự sao chép trong tế bào vật chủ
- Có kích thớc càng nhỏ càng tốt
- Phải đợc phát hiện rõ ràng trong tế bào vật chủ (có thật)
- Phải tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ
- Chỉ có mộtk vị trí nhận biết cho men đặc hiệu
Các loại vector
- Vector tách dòng đợc đa vào tế bào E. coli gồm plasmid, Bacteriophage I,
cosmid, Bacteriophage M13, và một số loại vector đặc biệt nh Ti plasmid, YACs,
BACs, Retrovirus, Baculovirus, Yeast 2 micron plasmid.
- Vector chuyển gen (vector tái tổ hợp) thờng dùng để chuyển gen vào tế bào
chủ của động vât và thực vật (Eucaryota bậc cao). Các vector tái tổ hợp có thể
đợc đa trực tiếp hoặc gián tiếp qua các sinh vật lây nhiễm của động vật hay thực
vật nh các virus, vi khuẩn, nấm đơn bào.

Một số vector có thể dùng cho tế bào động vật, thực vật
Tế bào chủ Loại vector Loại genom Ví dụ vector tái tổ hợp
Thực vật
Plasmid ADN Plasmid Ti của Agrobacterium tumefaciens
Virus
(phage)
ADN Virrus khảm cải hoa, Gemini virus
ARN Virus khảm thuốc lá
Động vật
Plasmid ADN
Nhiều loại plasmid khác nhau, nhiều loại
chứa cả SV40
Virus
(phage)
ADN
Baculovirus, Virus papilloma
Virus siliman 40 (SV40), virus vaccinia
ARN Retrovirus
Gen nhảy
Các phần tử p trong ruồi giấm
(Drossophila melanogaster)
Plasmid: ADN mạch vòng trong vi
khuẩn. Phân biệt hai loại là plasmid
tiếp hợp (tự chuyển sang vi khuẩn khác
trong tiếp hợp nhờ các đoạn đặc thù
tra transfer và mob mobilising di
168
chuyển), và plasmid không tiếp hợp (không tự chuyển sang đợc). Các plasmid
tiếp hợp có số bản sao thấp, kiểm soát chặt chẽ sao chép ADN tái tổ hợp, sao
chép phụ thuộc ADN nhiễm sắc thể. Plasmid không tiếp hợp thờng sao chép

ADN tái tổ hợp thoải mái, không phụ thuộc sự sao chép ADN nhiễm sắc thể và
tồn tại với số bản sao cao [Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.134]. Các plasmid phổ biến
là pBR322, pAT153 (với p thay cho plasmid và BR hay AT thay cho tên ngời
phân lập hay thiết kế chúng, các con số dùng để phân loại chủng plasmid).
Phage: Là những thể ăn khuẩn
(chỉ nhân lên bên trong vi khuẩn) do
Max Delbruck nghiên cứu từ những
năm 1940. Phage hoạt động nh
những đoạn ADN ngoài NST vi
khuẩn. Có hai loại phage ( và M13)
đợc hoàn thiện tích cực cho mục đích
tách dòng. Các vector phage hoạt
động đặc hiệu hơn các plasmid.
Chúng có thể chia làm 3 nhóm:
nhóm không đuôi, nhóm có đuôi và
nhóm có lông. Khi vào tế bào vi
khuẩn, phage có thể sinh sôi và giết chết tế bào chủ (trạng thái phage sinh tan)
hoặc nhập vào NST mà không giết chết tế bào (trạng thái tiềm tan).
Hệ gen của phage

(48,5 kb) mã cho 46 gen. Toàn bộ hệ gen đã đợc giải trình
tự. Hai đầu có 2 đoạn ngắn (12 bp) mạch đơn là những đầu dính tạo mạch vòng cho
hệ gen sau khi nhiễm vào tế bào vi khuẩn. Khi hệ gen vòng phage nhập vào NST tế
bào chủ thì hệ gen phage tiềm tan và gọi là prophage (tiền thực thể).
Hệ gen phage
Khi chu trình sinh tan bắt đầu, phage làm chủ tế bào và tạo ra nhiều bản sao
hệ gen phage và các protein cấu trúc. Chúng chui ra khỏi tế bào khi tế bào chủ
vỡ tan (sự sống tế bào tan biến). Để xác định số lợng phage trong dịch tan, pha
loãng dịch tan nhiều lần và trộn lẫn với vi khuẩn còn lại rồi cấy lên mặt thạch.
Sau khi ủ, vi khuẩn mọc thành thảm. Phage có trong thảm làm cho vi khuẩn sinh

tan tạo ra các vết tan (plaque) trên thảm. Đếm số lợng vết tan và xác định số l-
ợng phage trong dịch tan.
Hệ gen phage vào tế bào chủ chuyển sang dạng mạch kép (dạng sao chép
RF replication form). Khi sao chép đ ợc khoảng 1000 bản sao thì rơi vào trạng
thái sao chép bất đối xứng (asymetric replication); các bản sao mạch đơn của hệ
gen phage đợc sinh ra và thoát khỏi tế bào nh các hạt M13. Vi khuẩn lúc đó
không chết (không sinh tan) nhng sinh sản và phân chia chậm hơn so với tế bào
không bị xâm nhiễm.
Tạo vector tái tổ hợp
169
Hình ảnh phage

Tạo plasmid tái tổ hơp
Tùy theo ADN tái tổ hợp (ADN, ARN) mà chọn loại vector (plasmid, virus hay
gen nhảy) phù hợp với mục tiêu (nghiên cứu sự biểu hiện gen, sản xuất protein
hữu ích hay biến đổi cấu trúc di truyền) [Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.138].
Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp
Phỏng theo Nông Văn Hải, 2002)
Tạo phage tái tổ hợp
Hệ gen phage M13 (6407 bp) không mang các gen không quan trọng (khác
phage

) Vùng gen (nằm giữa hệ gen) dùng để thiết kế một loạt các vector M13mp
bằng cách xen một đoạn polinker/lac Z

-peptid vào đó. Qua đó có thể sử dụng hệ
thống sàng lọc X-gal để phát hiện các thể tái tổ hợp ví dụ pUC. Khi M13 mọc trên
thảm vi khuẩn, các vết tan xuất hiện, các tế bào không bị sinh tan nên có thể lấy ra
tiếp tục phân tích.
Mô hình tạo phage M13 tái tổ hợp

Phỏng theo Chu Hoàng Mậu, 2005, tr.143
Biến nạp ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ
Ghép đoạn ADN vào vector
Các vector nhận ADN có kích thớc khác nhau.
Plasmid thờng có kích thớc nhỏ không mang đợc ADN có kích thớc lớn (<7
kb). Tuy nhiên vector nhân tạo YAC (yeast artifical chromosom) có thể mang
đoạn ADN cỡ 1 Mb.
Các vector hiện nay hay dùng là plasmid, phage, cosmid, BAC (bacteria
artifical chromosom).
170
Để đa một đoạn ADN vào vector (vật mang) thì các đầu dính (-NH
2
) của
vector phải liên kết với ADN theo nguyên tắc tạo cặp bổ sung. Th ờng dùng cùng
một loại men giới hạn cắt vector và ADN để tạo các đầu dính. Sau đó chúng đợc
nối với nhau nhờ men ligase. Ưu điểm của phơng pháp này là dùng chính men
giới hạn đó để lấy lại đoạn ADN từ vector chứa chúng.
ADN tái tổ hợp đợc đa vào tế bào nhận (thờng là vi khuẩn). Chúng đợc nuôi
cấy tăng số lợng. Để phân lập vi khuẩn chứa vector cần dựa vào dấu hiệu nhận
biết chúng (vector mang gen chống chịu kháng sinh mọc đợc trong môi trờng có
kháng sinh), hoặc dựa vào vị trí nằm trong vùng chứa mã di truyền của gen đánh
dấu khi ghép ADN lạ làm cho hoạt động của gen này bị thay đổi (nhận biết qua
sự thiếu vắng sản phẩm từ gen đó). Nh vậy dể dàng nhận biết và phân lập tế bào
mang vector chứa ADN lạ khỏi những tế bào khác.
Khi ADN lạ là vùng mang mã di truyền của một gen (ADNc) đợc đa vào
vector có sẵn promotor thì sản phẩm của gen đợc tổng hợp ngay trong tế bào
nhận. Loại vector này gọi là vector biểu hiện (expession vector); thông thờng
vector loại này chứa nhiều promotor tổng hợp m-ARN (promotor nguồn gôc vi
khuẩn, virus).
Loại vector biểu hiện expression vector

Ví dụ vector có đoạn nucleotid mã cho protein đánh dấu fusion protein (nh
phát huỳnh quang: GFP = Green Fluoresence Protein). Biểu hiện của gen lạ là
khi đợc ghjép vào vector thì sản phẩm của ADNc (protein) dung hợp với protein
đánh dấu GFP. Nhờ sự phát huỳnh quang của GFP mà nhận biết hàm lợng
protein, sự phân bố và chức năng của mã bởi gen lạ trong tế bào sống.
Loại vector chứa gen đánh dấu
171
Biến nạp (transform) là đa phức ADN-plasmid vào tế bào chủ. Trớc tiên các
tế bào chủ (E. coli) phải trở nên khả biến (copetent). Muốn vậy cần ngâm tế bào
chủ trong dd CaCl
2
(lạnh đóng đá). Sau đó trộn nó với các ADN-plasmid rồi ủ
trong nớc đá 20-30 phút. Cuối cùng tạo sốc nhiệt ngắn (2 phút ở 42
0
C); làm nh
vậy ADN sẽ bị dẫn vào trong tế bào. nCác tế bào đã biến nạp đợc ủ trong nớc
thịt dinh dỡng ở 37
0
C trong 60-90 phút để các plasmid ổn định và biểu hiện tính
trạng ra kiểu hình (bắt đầu hoạt động). Sau cùng các tế bào đợc đa vào môi tr-
ờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid. Tuy rất hạn chế nh ng với 1

g
ADN có thể tạo ra 10
6
-10
7
tế bào biến nạp.
Lây nhiễm tơng tự nh biến nạp, nhng không phải đa ADN-plasmid mà đa
ADN-phage vào tế bào chủ.

7.3.2 Chọn lọc tạo dòng và sự biểu hiện của gen

7.3.3 Phản ứng chuỗi tổng hợp ADN PCR (polymerase chain reaction)
Nội dung chuỗi phản ứng PCR
Phơng pháp nhân đoạn ADN hàng tỷ lần mà không cần tế bào vi khuẩn (khi
trình tự hai đầu đoạn ADN đó đã biết).
Phơng pháp PCR chỉ sử dụng ADN-polymerase và các mồi (primer) là các
đoạn oligonucleotid nhân tạo.
Các bớc cơ bản của kỹ thuật PCR:
- Bớc 1: xử lý nhiệt sợi khuôn thành các sợi đơn
- Bớc 2: ghép mồi vào từng sợi đơn khi giảm nhiệt độ (nồng độ mồi lớn ngăn
cản phục hồi sợi kép ADN).
- Bớc 3: ủ với men Taq-polymerase và 4 loại deoxy-nucleotid triphosphat (dA-
TP, dT-TP, dC-TP và dG-TP) để tổng hợp các sợi đơn bổ sung.
Chuỗi phản ứng dây truyền gồm nhiều chu kỳ liên tục, mỗi chu kỳ có 3 bớc:
172
Sơ đồ mô tả 3 chu kỳ của phản ứng chuỗi tổng hơp ADN (PCR)
Sau mỗi chu kỳ, số lợng đoạn ADN tăng gấp đôi. Kết quả sau cùng thu đợc
chủ yếu các đoạn ADN có kích thớc bằng đúng khoảng cách giữa hai mồi. Số
chu kỳ lặp lại trong mỗi phản ứng PCR thờng không quá 60 và mỗi chu kỳ thờng
kéo dài khoảng 5 phút. Số lợng sợi ADN kích thớc duy nhất gần đúng theo công
thức:
N = (2
n
- 2n).x
n: số chu kỳ
2n: số sợi có chiều dài không xác định
x: số sợi khuôn ban đầu
N: số sợi tổng hợp đợc trong phản ứng
Phản ứng PCR đối với một VNTR của một cá thể

ứng dụng chuỗi phản ứng PCR
Trong công việc hình sự
Kỹ thuật PCR đợc áp dụng rộng rãi và có những biến đổi phù hợp mục đích
nghiên cứu. Có thể kể tới các dạng kỹ thuật PCR nh Nest-PCR; reversed PCR;
RAPD-PCR; CAPs-PCR; TAIL-PCR; Ngày nay có thể nói mọi nghiên cứu sinh
học đều sử dụng kỹ thuật PCR, kể cả trong khoa học hình sự.
Sự phân bố các băng ADN với 3 VNTR khác nhau
của từng cá thể là duy nhất, không trùng nhau
173
Trong xây dựng ngân hàng cADN (cADN library)
Kích thớc của một gen bất kỳ chiếm một phần rất nhỏ so với toàn bộ genome.
Genome của động vật có vú khoảng 10
9
bp; một gen dài 10.000 bp chỉ chiếm
0,001% tổng số ADN trong tế bào. Để tách chính xác một gen phải có mồi đặc hiệu
(m-ARN từ gen đó). Đối với những protein hiếm, m-ARN của nó rất ít; mặt khác m-
ARN dễ biến tính nên rất khó thao tác trong thực nghiệm với độ chính xác cao.
Khắc phục nhợc điểm này nhờ vào các men reverse transcriptase và ADN
polymerase. Qua đó tạo ra đợc rất nhiều ADN trên số lợng rất nhỏ khuôn mẫu m-
ARN gọi là cADN (complementary ADN). Các cADN khác nhau đợc đa vào
vector và tách dòng cADN dễ dàng theo mong muốn. Các vector chứa cADN đ ợc
biến nạp vào tế bào nhận. Tập hợp các tế bào nhận chứa cADN tạo thành ngân
hàng cADN.
Cơ chế tạo cADN (sợi kép, đầu bằng)
theo khuôn m-ARN tách chiết từ tế bào
Các cADN đầu bằng rất khó đợc đa vào vector. Do vậy các Linker (L) thờng
đợc nối vào hai đầu của cADN nhờ ADN-ligase. Những đoạn nucleotid của men
giới hạn chứa vị trí nhận biết đợc tổng hợp nhân tạo. Sau đó các cADN mang
Linker chứa vị trí nhận biết cũng nh vector sẽ đợc xử lý với men tơng thích (có vị
trí nhận biết nằm trong Linker). Với các Linker, các cADN có đầu so le (đầu dính)

và dễ dàng đợc đa vào vector.
Trong xây dựng ngân hàng hệ gen (genomic ADN library)
Một phân tử cADN chỉ tơng ứng với các exon của một gen, trong khi gen
Eucaryota còn chứa các intron. Kích thớc trung bình của một gen khoảng 15-20
kb. Để có thể đa toàn bộ các gen của hệ gen ở Eucaryota vào ngân hàng, trớc
hết hệ gen phải bị cắt bởi men giới hạn thành các đoạn ADN có kích th ớc thích
hợp với vector nhận chúng.
Các men nhận biết 4-8 nucleotid thực hiện cắt genome thành các đoạn. Với
một genome, đoạn cắt này sẽ càng dài và số lợng chúng càng ít khi số nucleotid
ở vị trí cắt càng nhiều (ví dụ 8 nucleotid). Hơn nữa không dễ có đợc đoạn cắt
chứa nguyên vẹn một gen. Trong thực tế một gen thờng bị phân bố ở nhiều đoạn
cắt do vị trí nhận biết nằm ngay trong gen.
174

Để mọi vị trí nhận biết không bị cắt đồng thời cần khống chế nồng độ men
nhận biết và thời gian cho phản ứng cắt sao cho phản ứng chỉ xẩy ra ở từng phần
của genome. Sau đó đa các đoạn cắt vào vector thích hợp. Tập hợp các vector
chứa các đoạn ADN tạo thành ngân hàng hệ gen (genomic ADN library). Bảo
quản ngân hàng này bằng cách ghép vào phage (ghép đoạn ADN 10-15 kb),
cosmid (ghép đoạn ADN 50 kb) hay BAC (ghép đoạn ADN 100 kb).
Các giai đoạn chính tạo một clone (thể mang ADN lạ)
Xây dựng nhân hàng hệ gen dùng vector (hệ gen thực khuẩn)
Sử dụng loại vector khác nhau sẽ có những ngân hàng khác nhau cho một
cá thể. Từ ngân hàng hệ gen, muốn tìm đợc một clone với xác xuất P thì số
vector N mang clone (ADN) cần phải sử dụng là:
N =

)
1
1ln(

)1ln(
n
P


n: số đoạn ADN cắt từ genome
N: số vector cần sử dụng
Ví dụ genome của ngời khoảng 2,8.10
9
bp bị cắt thành các đoạn 20 kb. Ta có
n = 1,4.10
5
. Để tìm một clone với sác xuất 95% thì cần lấy từ ngân hàng N =
4,2.10
5
phân tử ADN tái tổ hợp. Nếu muốn tìm thấy với xác xuất cao hơn (99%)
thì số phân tử cần phải lấy là N = 6,5.10
5
.
Từ các mô khác nhau có thể xây dựng đợc một ngân hàng hệ gen nhng
nhiều ngân hàng cADN (từ các m-ARN) vì từ các mô khác nhau thu đợc các m-
ARN khác nhau. Nh vậy mỗi cá thể có thể xây dựng một ngân hàng hệ gen và
nhiều ngân hàng cADN khác nhau đặc trng cho từng mô khác nhau.
175
Ngân hàng hệ gen Ngân hàng cADN

Sự khác nhau giữa các clone của hai ngân hàng gen
Các yếu tố ảnh hởng tới phản ứng PCR
Yếu tố Đặc điểm
Mồi primer

-Tỷ lệ GC thờng là 40-75%
-Khoảng cách hai mồi không quá 3 kb
-Không có liên kết bậc hai giữa các nucleotid cùng mồi
-Bắt đầu tổng hợp ADN khi đầu 3 của mồi đ ghép vào sợi khuôn ADNã
-Do vậy đầu 5 của mồi có thể liên kết với linker hoặc promotor
-Nồng độ mồi 0,1-1

M (dựa vào giá tri OD đo ở 260 nm)
Liên kết
mồi-khuôn
-Liên kết tạo cặp bổ sung (lệ thuộc thời gian, nhiệt độ, nồng độ mồi, sợi khuôn):
+Nồng độ mồi >> nồng độ sợi khuôn => thời gian ngắn
+Nhiệt độ ủ (40-45
0
C) lệ thuộc chiều dài, hàm lợng GC của mồi (12-15 bp).
Nhiệt độ
-Thích hợp cho men taq là 72
0
C (vẫn giữ hoạt tính men ở nhiệt độ cao), tại nhiệt độ
cao các mồi thờng hay biến tính (tách khỏi sợi đơn) => cần bắt đầu tổng hợp ADN từ
nhiệt độ 55-60
0
C để mồi dài đợc thêm, sau đó mới tăng nhiệt độ lên 72
0
C. Nhiệt độ
trong giai đoạn này rất quan trọng:
+Nhiệt quá cao gây biến tính mồi
+Nhiệt quá thấp: mồi bám dính vào vị trí không đặc hiệu
-Thời gian mồi tìm đúng vị trí 2 phút (ở những chu kỳ đầu); Chú ý khi chỉ một vài
nucleotid ở đầu 3 bám dính vào khuôn (do ít thời gian) thì Taq-polymerase sẽ kéo dài

sợi mồi thành sợi ADN mới do mồi cha liên kết ở đầu 5.
Nồng độ ion, và 4
loại d-nucleotid-TP
-Ion Mg
2+
kích thích tổng hợp ADN,
-Muốn tổng hợp sợi ADN dài cần loại bỏ hoàn toàn KCl khỏi mồi.
-ADN có thể là ADN genome tách ra từ tế bào, từ ngân hàng genome, từ ngân hàng
cADN, là các ADN bất kỳ, ARN tổng số hoặc m-ARN.
7.3.4 Công cụ nghiên cứu sinh học
Mục tiêu
- Tạo ra một lợng lớn bản sao một trình tự ADN nhất định
- Chọn lọc một th viện gen
Các bớc kỹ thuật tách dòng
- Chọn và xử lý vector ( làm đóng băng)
176
- Phát hiện dòng cần tìm trong th viện gen
- Xử lý ADN cần tạo dòng (cắt và gắn vào vector).
- Tạo vector táI tổ hợp
- Chuyển vector vào tế bào chủ (đã bị đóng băng).
Phỏng theo Chu Hoàng Mậu, 2005, tr. 153
7.3.5 Xác định trình tự các nucleotid của gen
Nguyên tắc xác định trình tự nucleotid của gen
Có nhiều kỹ thuật xác định trình tự nucleotid của gen:
- Kỹ thuật điện di phân đoạn đánh dấu
- Xác định trình tự acid amin của protein do gen đó mã hóa rỗi suy ngợc ra
trình tự nucleotid của gen thông qua sử dụng khóa mã di truyền.
- Xác định trực tiếp thông qua phản ứng kết thúc đầu cuối của đoạn ADN để
nhận biết nucleotid tận cùng của đoạn ADN đó (chỉ dài hơn đoạn kế trớc 1
nucleotid).

Các phơng pháp xác định trình tự nucleotid
Phơng pháp hóa học của Maxam-Gilbert
Nguyên lý: Đánh dấu phóng xạ
32
P*, xử lý tạo mạch đơn ADN, xử lý hóa học
để phá hủy 1 trong 4 loại nucleotid (A, T, G, C) tạo ra những đoạn ADN mạch
đơn kích thớc khác nhau, điện di và sắc ký sản phẩm, phân tích kết quả.
Trớc hết đánh dấu phân tử ADN sợi kép tại đầu 5, rồi dùng nhiệt phân tách
thành các sợi đơn. Sau đó xử lý độc lập 4 loại hóa chất phá hủy lần l ợt các
nucleotid (ví dụ nu-A). Kết qua đợc hàng loạt đoạn ADN kích thớc khác nhau.
Các đoạn này đợc phân ly độc lập trên gen polyacrylamid và chỉ những đoạn có
gắn chất phát màu mới đợc phát hiện trên phim (do nhuộm màu phim).
177
Xác định trình tự nucleotid bằng phơng pháp Maxam-Gilbert
-tiến hành 4 phản ứng độc lập dùng 4 hóa chất khác nhau
-Chạy điện di đồng thời sản phẩm trên 4 vị trí phân biệt của màng acrylamide
Đọc trình tự các đoạn nucleotid từ 5 lên 3
Phơng pháp men Sanger (tạo đầu tận của chuỗi: chain terminator method)
Sử dụng dideoxynucleotid không có -OH ở vị trí 3 trong phản ứng tổng hợp
ADN. Do đó khi men ADN polymerase gắn chúng (các dd-nucleotid) vào sợi ADN
thì quá trình tổng hợp bị dừng lại. Vì vậy còn gọi là phơng pháp dideoxy (dideoxy
method).
dA-TP = dideoxy-adenosin-triphosphat
dG-TP = dideoxy-guanosin-triphosphat
dT-TP = dideoxy-thymidin-triphosphat
dC-TP = dideoxy-cytosin-triphosphat
Đầu tiên sợi đúp ADN (cần đọc trình tự nuc leotid) biến tính bởi nhiệt thành
hai sợi đơn và đợc lai với mồi (ddA-TP, ddT-TP.ddC-TP hay ddG-TP = dideoxy A-,
T-, C- hay G-triphosphat) có sự tham gia của men ADN-polymerase. Mỗi phản
ứng gồm (sợi khuôn ADN, mồi, men, 1 loại ddN-TP) và 4 loại dN-TP theo tỷ lệ

1/100. Sản phẩm của 4 phản ứng độc lập đợc đồng thời điện di trên gel
178
polyacrylamid tại 4 vị trí khác nhau. Các vạch ADN quan sát đợc nhờ có gắn P
32
vào mồi hoặc vào một trong 4 loại nucleotid (A, T, C và G) bình thờng.
Phơng pháp ADN footprint
Phát triển dựa trên phơng pháp xác định trình tự, phơng pháp ADN footprint
cho phép xác định vị trí protein (protein điều khiển, factor phiên
mã ) liên kết với ADN. Thông thờng các đoạn ADN ngoài vùng
chứa mã di truyền có protein bám dính giữ vai trò quan trọng (kiểm
soát hoạt động của gen).
Tại vị trí liên kết có protein bám dính, đoạn ADN này không tạo ra sợi đơn nên
không quan sát đợc trên gen (khoảng trống = dấu vết footprint)
trên băng điện di hiển thị vạch mầu. Qua đó xác định đợc vị trí
protein kiểm soát phiên mã.
Xác định trình tự nucleotid trên máy tự động
179
Trong những năm gần đây đã xuất hiện một số phơng pháp mới xác định
trình tự nucleotid bên cạnh phơng pháp thông thờng sử dụng các gel để phân ly
các đoạn ADN có độ dài khác nhau vài hoặc chỉ một nucleotid:
- Phát hiện huỳnh quang các nucleotid bị đánh dấu
- Xác định trình tự ADN bằng khối phổ
- Xác định trình tự ADN bằng lai với oligonucleotid nhân tạo
- Quan sát bề mặt ADN, phân biệt nucleotid bằng kính hiển vi điện tử
- Sử dụng tấm chip gắn các oligonucleotid (phân biệt > 50.000 pt ADN khác
nhau). Tơng lai có thể gắn hàng nghìn oligonucleotid lên một chíp nhỏ đa vào
phần mềm máy tính.
Phơng pháp tạo đầu tận cùng của chuỗi cải tiến cho phép đọc tự động trình
tự trên máy (automagic sequencing). Sử dụng các KIT khác nhau, trong đó đầu
tận cùng đợc gắn chất phát huỳnh quang (dye terminator sequencing). Phản ứng

gắn các nucleotid đánh dấu vào sợi ADN tổng hợp đợc tiến hành trên máy PCR
(còn gọi kỹ thuật chuỗi đọc trình tự: cycle sequencing). Sản phẩm từ PCR đợc
điện di bằng máy tự động trên gel acrylamid cho phép phân biệt các đoạn ADN
hơn kém nhau 1 nucleotid. Kết quả đợc phân tích bằng phần mềm máy tính
chuyên dụng.
Thông thờng 4 loại nucleotid đợc đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang
khác nhau. Đầu đọc laser kích hoạt các chất này khiến chúng hấp thụ và phát
màu; mỗi màu ứng với một loại nucleotid và đợc hiển thị bằng một đỉnh đồ thị
điện di. Phản ứng gắn nucleotid vào sợi ADN tổng hợp trên sợi khuôn đợc thực
hiện trên máy PCR (.). Hai loại nucleotid dG-TP và dT-TP đợc thay thế bởi dI-TP
và dU-TP nhằm hạn chế sự trùng lặp đỉnh. Sản phẩm PCR đợc tinh sạch, loại bỏ
nucleotid và primer (chất đệm) thừa trớc khi đa vào máy đọc. Các trình tự đọc đ-
ợc trên máy tự động thờng dài 600-1000 bp.
u điểm của phơng pháp là kết quả đợc đa trực tiếp vào máy tính, giảm bớt lỗi
đọc bằng mắt; không đòi hỏi lợng ADN khuôn (dạng sợi kép) nhiều nhng các sợi
đơn cần đọc đợc khuyếch đại lên rất nhiều lần.
Trong chơng trình nghiên cứu hệ gen (của ngời hay arabidopsis ), hệ gen đ-
ợc cắt bởi men giới hạn thành những đoạn lớn có đầu gối lên nhau. Chúng đ ợc đ-
a vào vector (plasmid hoặc BAC) và đợc lấy ra ngẫu nhiên để xác định trình tự.
Số liệu đọc đợc phân tích trên máy để tìm ra các đoạn trùng nhau. Khoảng trống
gap bất kỳ giữa các đoạn đã biết đợc xác định khi thiết kế primer dựa vào trình
tự hai đầu tận cùng của khoảng trống.
Trình tự hệ gen, các loại ADN (các đoạn ADN hệ gen, các cADN, các đoạn
đích EST expressed sequence tags của cADN ) đợc xác định ngày càng nhiều
đã thúc đẩy hớng nghiên cứu mới bio.informatic (tin sinh). Ba ngân hàng dữ liệu
chính lu giữ hầu hết các thông tin về ADN là EMBL (thuộc viện tin học châu âu
European informatic institude), Genbank (thuộc trung tâm công nghệ sinh học
180
Mỹ - US National Centre for Biotechnology) và DDBS (thuộc ngân hàng dữ liệu
của nhật - DNA DataBase of Japan)

7.3.6 Công nghệ protein (protein engineering) - proteomic
Tách chiết protein
Loại bỏ lipit: Vật chất trong cơ thể sinh vật chủ yếu là protein, lipit và gluxit.
Để tách chiết protein, trớc hết các mẫu thô phải đợc loại bỏ vỏ cellulo (ở thực
vật), sau đó các mẫu thô giữ ở 4
0
C, tiếp theo cần loại bỏ lipit (ở thực vật và động
vật) bằng các chất lỏng hòa tan lipit (petroleum ete) ở 4
0
C rồi ly tâm 14.000
vòng/phút và loại bỏ dịch ly tâm (lặp lại ly tâm vài lần). Bột cặn giữ ở 4
0
C trong
24 giờ. Sau 24 giờ hòa mẫu bột vào dd chiết đợc nh nớc (pH = 7,0), NaCl 1M (pH
= 7,0) hay dd đệm phosphat hoặc đệm citrat (pH = 10), và ly tâm 14.000
vòng/phút trong 30 phút, sau đó thu lấy dịch ly tâm (chứa protein tổng số gồm
albumin và globulin). Dịch ly tâm (mẫu dịch - phân đoạn I) đợc bảo quản ở nhiệt
độ 20
0
C, dùng nhiều lần cho định lợng và một lần cho phân tích điện di.
(1) Dùng cho phân tích định lợng protein: Mẫu dịch (phân đoạn I) đợc ly tâm
14.000 vòng/phút trong 20 phút, sau đó loại bỏ cặn ly tâm (chứa tinh bột và tạp
chất) bằng cách thẩm tích. Dịch thẩm tích chứa protein tổng số đợc ly tâm; dịch
ly tâm (lần II chứa hầu hết albumin (phân đoạn II), cặn ly tâm (protein không tan
trong nớc) đợc hòa tan vào dd NaCl 1M (phân đoạn III).
(2) Dùng cho phân tích điện di: Mẫu dịch (đã chiết bằng nớc cất phân đoạn
I) đợc ly tâm 14.000 vòng/phút. Dịch ly tâm chứa phần lớn albumin và một phần
globulin (phân đoạn IV). Căn ly tâm đợc chiết tiếp bằng NaCl 1M và ly tâm lấy
dịch (phân đoạn VII). Dịch ly tâm (IV) đợc thẩm tích, dịch thẩm tích chứa phần
lớn albumin (phân đoạn V). Cặn thẩm tích đợc hòa tan trong NaCl 1M, dịch thẩm

tích (phân đoạn VI) chứa phần lớn globulin).
Phân tích định lợng protein
Định lợng ni-tơ tổng số phơng pháp Keldjal
181
Nguyên tắc: Nitơ tổng số = nitơ protein + nitơ phi protein
Hợp chất chứa nitơ + H
2
SO
4
(đặc)
cao ộđNhiệt
tác Xúc
> NH
3
+ H
2
O +
Hơi NH
3
: NH
3
+ H
2
O
tác xúc
nóng NaOH,dd
> NH
4
OH (hấp thụ vào H
2

SO
4
)
Chuẩn độ lợng H
2
SO
4
còn d bằng NaOH. Từ lợng H
2
SO
4
ban đầu và lợng
H
2
SO
4
d (từ chuẩn độ) tính đợc lợng H
2
SO
4
đã hấp thụ NH
3
. Từ đó qui ra lợng nitơ
tổng số.
Xác định hàm lợng nitơ ph protein theo phơng pháp Barstein trên máy phân
tích đạm tự động Vapodest của hãng Gerhardt và máy Keldjal.
Từ những kết quả trên: N
protein
= N
tổng số

- N
phi protein
Định lợng protein tan tổng số
Nguyên tắc: sử dụng các thuốc thử (Folin, Bradford, Gordan ) đợc hấp thụ
ở những bớc sóng khác nhau trên máy quang phổ Uvis, đồng thời sử dụng mẫu
protein chuẩn (hàm lợng xác định) để tính hàm lợng protein của mẫu khảo sát.
Phơng pháp Lowry: Dựa vào sự hình thành phức chất biure; phức này tơng
tác với thuốc thử Folin-ciocalteu cho màu đặc trng. Đo màu mẫu trên máy so
màu quang điện ở bớc sóng

= 750 nm. Đối chiếu kết quả với đồ thị kết quả của
protein chuẩn (ở đây là albumin đã biết hàm lợng).
Phơng pháp Brardford: Thuốc thử Bradford gồm Coomáte Brilliant Blue G,
ethanol, H
3
PO
4
, nớc cất và protein chuẩn. Trớc hết sử dụng protein chuẩn và
thuốc thử để xây dựng đờng cong chuẩn (đo mật độ quang trên máy quang phổ ở
bớc sóng 595 nm). Căn cứ đờng cong chuẩn sẽ xác định đợc hàm lợng protein
của mẫu khảo sát.
Phân tích thành phần acid amin
Xác định hàm lợng từng loại acid amin bằng phơng pháp sắc ký trên giấy
hoặc sắc ký trên máy. Hiện nay thờng sử dụng các máy: máy sắc ký tự động
Biochrom của hãng Pharmacia Biotech, máy HP-Amino-Quant (amino quant
series II - Operotor HADNbook). Sử dụng OPA (ortho phthal-aldehyd) tạo dẫn
suất đối với acid amin bậc I (-NH
2
) và PMOC (9- Floureryl methyl chlorofamat)
đối với acid amin bậc II (-NH-). Mẫu protein trớc khi đo đợc xử lý thủy phân ở

105
0
C trong 24 giờ.
Tùy theo mục đích có thể xác định hàm lợng acid amin tự do trong tế bào
(nghiên cứu mối liên quan hàm lợng một acid amin nào đó với tính trạng - mùi
thơm) hoặc xác định hàm lợng acid amin liên kết (nghiên cứu chất lợng sản
phẩm) trong protein.
Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di protein
Phân tử protein khác nhau mang điện tích và có khối lợng không giống nhau,
do vậy chúng di chuyển khác nhau trong điện trờng. Phân tích kết quả điện di
protein theo những mục đích nghiên cứu khác nhau.
182
Kỹ thuật điện di một chiều: tách các phân tử protein khác nhau có trong mẫu
(protein tan tổng số trong dd NaCl 1M, và protein tan trong nớc). So sánh kết
quả điện di giữa các mẫu nghiên cứu để xác định tính đa hình protein và tính đa
dạng sinh học của sinh vật. Ví dụ kết quả điện di protein SDS-PAGE$ đã phát
hiện những sai khác trên băng điện di ở kích thớc phân tử protein 10-16 kDa giữa
các thể đột biến ở 5 giống lúa khác nhau.
Kỹ thuật điện di hai chiều: có thể đợc ứng dụng để phát hiện đột biến do thay
thế nucleotid hay do biến đổi trình tự nucleotid.
Tiến trình điện di:
- Gây biến tính protein ở 100
0
C
- Điện di ở thế hiệu khác nhau
- Nhuộm màu, chụp ảnh băng điện di
- Phân tích băng điện di theo mục đích nghiên cứu
Cơ cấu băng (gel) điện di:
Thành phần
Gel

(%)
Nớc
(ml)
30% degassed
acrylamid/Bis
(ml)
Gel buffer
(ml)
SDS
(ml)
Gel cô mẫu
4% 6,1 1,3 2,5 0,1
Gel phân lập
protein
12% 3,4 4,0 2,5 0,1
Phân tích ảnh điện di: So sánh hình ảnh các mẫu khảo sát (1-9) với hình ảnh
mẫu chuẩn (M) rồi đa ra những nhận xét tùy theo mục đích nghiên cứu
183
Hình ảnh phổ điện di protein chiết bằng nớc cất
Từ Chu Hoàng Mậu, 2005, tr. 86
Mỗi vạch trên cọc mầu tơng ứng một loại protein trong một mẫu. Cạo lấy
riêng từng vạch rồi xử lý và đa vào điện di hai chiều. Kết quả điện di hai chiều
của mỗi mẫu so với của mẫu protein chuẩn giúp phân tích trình tự các acid amin,
sự sắp xếp peptid, nhận dạng protein
Phân tách từ gel điện di Các pha xử lý Kết quả phân tích tiểu phần
- Làm sạch
- Sấy khô
- Hòa tan và thêm protease
- Chiết
- Cắt phân đoạn

- Phân tích tiểu phần
Theo Phan văn Chi, 2022; từ Chu Hoàng Mậu, 2005, tr. 86
Phân tích men
Xác định hoạt độ men
Protein tích lũy (trong hạt, mầm, mô bào) lần lợt chịu tác động của các men
endopeptidase, exopeptidase và aminopeptidase phân giải thành globulin,
polipeptid, oligopeptid và cuối cùng thành các acid amin.
Tinh bột thực vật đợc men

-amylase phân giải.
Hoạt độ men

-amylase đợc xác định bằng phơng pháp Heinkel dựa vào l-
ợng tinh bột bị phân giải = mức giảm cờng độ màu của hỗn hợp phản ứng trong
dd Iod (Lugol). Đơn vị hoạt độ men là lợng men phân giải 1 mg tinh bột trong 30
phút. Cách thức tiến hành từng bớc nh sau:
- Cân mẫu, nghiền nhỏ và cho vào dd đệm phosphat/citrat có pH = 6,8
- Chiết men

-amylase bằng dd đệm phosphat/citrat có pH = 6,8.
- Ly tâm lạnh hỗn dịch ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chứa men
(mẫu thí nghiệm = mẫu TN). lần lợt cho 0,25 ml tinh bột 1%, 0,25 ml NaCl
0,1%, 0,5 ml dd đệm phosphat/citrat (pH = 6,8) và 1,25 ml dd mẫu. Lắc đều và
để tủ ấm ở 30
0
C trong 30 phút.
- Lấy dd mẫu ra và lần lợt cho thêm vào các ống mh sau:
+ống TN: 1 ml dd mẫu + 1,25 ml sulfosalisilic 20% + 9 ml dd Iod 1/150
+ống KT: 1,25 ml sulfosalisilic 20% + 1 ml dd mẫu + 9 ml dd Iod 1/150
+ống ĐC: 1 ml nớc cất + 1,25 ml sulfosalisilic 20% + 9 ml dd Iod 1/150

- Lắc đều cả 3 ống và sau 10 phút mang đo trên máy quang phổ UV Visible
Spectrophotometer ở bớc sóng 560 nm.
- Tính kết quả
184
7.3.7 Các phơng pháp chẩn đoán mới
Loài gia súc Tính trạng sản xuất Hệ số di truyền
Bò sữa
Sản lợng sữa 0,2-0,3
Tỷ lệ mỡ sữa 0,5-0,6
Tỷ lệ protein sữa 0,5-0,6
Sức sinh sản 0,0-0,1
Bò thịt
Tăng khối lợng g/ngày 0,4-0,5
Tiêu tốn thức ăn kg/kg tăng khối lợng 0,35.0,45
Tỷ lệ thịt xẻ 0,55-0,65
Lợn
Tăng khối lợng g/ngày 0,4-0,5
Tiêu tốn thức ăn kg/kg tăng khối lợng 0,35-0,4
Tỷ lệ thịt xẻ 0,55-0,65
Độ dày mỡ lựng 0,45-0,55
Số con/lứa 0.08-0,12
Gà đẻ trứng
Sản lợng trứng 0,2-0,3
Khối lợng trứng 0,5
Tuổi đẻ quả trứng đầu tiên 0,15-0,25
Gà thịt
Khối lợng cơ thể 0,40
Tốc độ tăng khối (sinh trởng) 0.50
185