vai trò công nghệ sinh học

VAI TRÒ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG BẢO
VỆ MÔI TRƯỜNG

1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ NGUYÊN LÝ CỦA KỸ THUẬT TÁI TỔ
HỢP GEN ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC
1.1. Công nghệ sinh học cổ điển (hay CNSH đại phân tử) và công nghệ sinh học
hiện đại (hay CNSH phân tử)
CNSH đại phân tử là lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng sinh vật và vi sinh
vật (VSV) ở mức độ nguyên trạng, tức là chưa đi sâu vào tìm hiểu và ứng dụng
ở mức độ cấu trúc phân tử mà chỉ tận dụng những đặc tính kiểu gen (genotype)
và kiểu hình (phenotype) của chúng để sử dụng và chọn lọc loại tối ưu cho mục
đích đặt ra.
CNSH phân tử (Molecular Biotechnology) là một lĩnh vực tổng hợp có
liên quan rất lớn đến các ngành di truyền phân tử, tế bào học, VSV học, sinh
hoá học
CNSH phân tử có hai lĩnh vực chính là CNSH phân tử cơ bản và CNSH
phân tử ứng dụng.
• CNSH phân tử cơ bản: bao gồm các thao tác DNA ở mức độ phân tử như
cắt, nối, ghép, chuyển nạp, dẫn truyền các loại gen ngoại lai hữu ích vào
các dòng tế bào chủ thích hợp để duy trì gen đó.
• CNSH phân tử ứng dụng: chọn lọc, nhân lên, sản xuất những dòng tế bào
đã được tái tổ hợp để thu được những sản phẩm có ích cho con người.
CNSH phân tử cơ bản và CNSH ứng dụng là hai bước kế tiếp nhau để đưa
nguyên lý tái tổ hợp gen thành hiện thực, sản xuất các thành phẩm hữu ích theo
công nghệ mới- Công nghệ sinh học.
1.2. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật tái tổ hợp gen ứng dụng trong CNSH
1.2.1. Mở đầu và khái niệm:
Năm 1970, lần đầu tiên, Baltimore và Temin độc lập phát hiện loại
enzyme có tác dụng sao chép ngược (reverse transcriptase) có tác dụng tham gia
hoạt hoá cho quá trình tổng hợp ngược DNA từ khuôn RNA (reverse
transcription). Điều này cho phép một khi đã có một RNA thông tin (mRNA)

của một gen ở dạng sợi đơn, chúng ta có thể chuyển đổi thành 1 gen hoàn toàn
(ở dạng DNA chuỗi xoắn kép) theo cơ chế bổ sung sao chép ngược, có sự tham
gia của enzyme nói trên. Đây chính là nguyên lý tạo DNA bổ sung
(complementary DNA-cDNA) từ mRNA.
Cũng trong năm 1970, Smith và Wilcon công bố đã tách chiết được một
loại enzyme nội bào từ vi khuẩn Haemophills influenzae, có khả năng cắt DNA
ở những điểm nhất định, tạo nên nhiều đoạn DNA rời nhau, đã mở hướng cho
một kỹ thuật thao tác mới ở mức độ phân tử, đó là có thể cắt và nối các đoạn
DNA thích hợp để tạo nên các hỗn hợp lai DNA khác nhau. Về sau một loạt các
loại enzyme có hoạt tính như trên đã được phân lập, người ta gọi đó là các
enzyme hạn chế (restriction enzyme)
Cũng trong những năm 70 tiếp theo, song song với sự phát triển và hoàn
thiện những kỹ thuật thao tác vật liệu thông tin di truyền, việc phát hiện và sử
dụng một số thực thể vi sinh sống cộng sinh trong các loại tế bào vi sinh vật như
nấm men, vi khuẩn có một ý nghĩa ứng dụng hết sức to lớn. Đó chính là các
loại plasmid. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc dẫn truyền các gen
ngoại lai đã được tái tổ hợp vào tế bào vi sinh vật chủ tương ứng của chúng.
Gần đây, trong những năm 80, phản ứng nhân bản gen (Polymerase
Chain Raction-PCR) đã được phát hiện trên nguyên lý: deoxyribonucleic acid
(DNA) có cấu trúc chuỗi xoắn kép, gồm hai mạch nucleotide bổ sung cho nhau
theo quy luật A-T và G-C bằng các mối liên kết hydro. Giữa A-T có 2 và G-C
có 3 mối liên kết hydro. Liên kết này không phải là liên kết hoá học bền vững,
do đó dưới một tác dụng nào đó (ví dụ nhiệt độ cao trên 90
o
C, gần đến 100
o
C)
thì hai mạch nucleotide sẽ tách nhau ra, nhưng khi hạ nhiệt thì hai mạch lạ xoắn
trở lại. Sự phát hiện này đã nâng cao hơn nữa kỹ thuật tái tổ hợp DNA và ứng
dụng thành quả của kỹ thuật đó.

Như vậy, bằng enzyme hạn chế, ta có thể cắt một chuỗi DNA nào đó
thành nhiều đoạn, rồi ghép một đoạn nào đó vào plasmid cũng đã bị cắt bằng
một enzyme tương tự để tạo nên một plasmid mới mang đoạn DNA ngoại lai.
Nếu đoạn DNA đó là một gen hoàn chỉnh chúng ta có một plasmid mới mang
gen ngoại lai. Kỹ thuật cắt-nối-ghép và tạo nên một thực thể vi sinh mới, mang
một hay nhiều đoạn DNA ngoại lai, được gọi là kỹ thuật tái tổ hợp DNA
(recombinant DNA technology). Plasmid mang DNA ngoại lai đó được gọi là
plasmid tái tổ hợp (recombinant plasmid). Khi pla smid đó được đưa vào tế bào
vi sinh vật chủ, quá trình đó được gọi là quá trình chuyển nạp (transformation).
Plasmid mang DNA ngoại lai đóng vai trò chuyển DNA vào trong tế bào chủ
được gọi là vector dẫn truyền (cloning vector).
Vector dẫn truyền có thể là plasmid hay bất kỳ một loại thực thể vi sinh
khác, như virus chẳng hạn. Khi một vi sinh vật chủ (nấm men hay vi khuẩn )
đã tiếp nhận vector dẫn truyền để thực hiện những quá trình sinh học tiếp theo
với DNA ngoại lai đã được chuyển nạp, thì dòng VSV đó được gọi là VSV tái
tổ hợp (recombinant microorganism).
Khi nuôi cấy VSV tái tổ hợp, nếu DNA ngoại lai là một gen hoàn chỉnh,
được bố trí trong điều kiện có cấu trúc vector dẫn truyền thích hợp, thì gen đó
có thể tổng hợp được protein ở trong tế bào vật chủ. Vector dẫn truyền có cấu
trúc đặc biệt này được gọi là vector biểu thị gen (expression vector).
1.2.2. Các thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen
Kỹ thuật tái tổ hợp gen bao gồm nhiều công đoạn khác nhau,có thể được tóm
tắt như sau:
• Cắt DNA bằng enzyme hạn chế (RE)
• Phân lập đoạn DNA đã được cắt
• Cắt plasmid tương ứng bằng enzyme hạn chế thích hợp
• Nối ghép đoạn DNA ngoại lai vào plasmid
• Chuyển nạp vào tế bào VSV chủ thích ứng
• Chọn lọc dòng đã được tái tổ hợp theo nguyên tắc kháng kháng sinh
• Nhân dòng đã chọn lọc

• Kiểm tra xác định kết quả
Vì vậy, các thành phần tham gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen rõ ràng có liên
quan đến:
a) Nguồn cung cấp DNA
Nguồn cung cấp DNA bao gồm tất cả các loại hình có chứa DNA của vi
sinh vật, nấm men, thực vật, động vật bậc cao. Các loại DNA này cần
phải được làm sạch khỏi các thành phần khác của tế bào và bảo quản ở
nhiệt độ -20
o
C. Cũng có thể là mRNA nhưng phải được chuyển sang
dạng cDNA. Ngoài ra, nguồn cung cấp DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen
có thể là sản phẩm PCR tinh khiết. Mối quan tâm hàng đầu của các kỹ
thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận các phân tử này ở trạng thái
nguyên vẹn tối đa không bị phân huỷ bởi các tác nhân cơ học (phân tử bị
gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hoá học (phân tử bị thuỷ giải bởi các
enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các
nucleic acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế
hoạt động của các enzyme nội bào (desoxyribonuclease-DNase và
ribonuclease-RNase)
- Phương pháp tách chiết DNA: gồm 3 bước cơ bản sau:
§ Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân (tế bào eucaryote). Thông
thường, tế bào, mô được nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (detergent
như SDS, sarcosyl) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ
màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời
phân huỷ các protein liên kết với DNA.
§ Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ
yếu là các protein. Mẫu được lắc thật mạnh trong một dung dịch phenol
và chloroform. Dung dịch phenol và chloroform có tác dụng làm biến
tính protein đồng thời không hoà tan nucleic acid. Protein khi biến tính
sẽ không còn hoà tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly

tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol:chloroform.
Pha nước có chứa nucleic acid được thu nhận lại.
§ Bước 3: Tủa các nucleic acid. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận
nucleic acid dưới dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân
huỷ của các enzyme, mặt khác để có thể hoà tan chúng trở lại trong dung
dịch theo nồng độ mong muốn. Phương pháp thông dụng là tủa trong
isopropanol với tỉ lệ thể tích isopropanol/thể tích mẫu là 1/1. Các DNA
có TLPT thấp không bị tủa, do đó có thể loại chúng ra khi dùng cách tủa
trong isopropanol. Sau đó, nucleic acid sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm.
Tiếp theo, cặn tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các dấu
vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Bảo quản ở nhiệt độ -20
o
C.
- Phương pháp tách chiết RNA toàn phần và mRNA
Các phân tử RNA không bền, dễ bị phân huỷ bởi các enzyme
ribonuclease (RNase). Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng bao gồm
các bước cơ bản như đối với DNA:
Tế bào, mô được nghiền trong một dung dịch gồm một chất tẩy
mạnh (SDS, sarcosyl) ở nồng độ cao, một tác nhân gây biến tính
protein biến tính mạnh (guanidinium thiocyanate), một chất khử (2-
mercaptoethanol). Hai loại chất sau có tác dụng ức chế hoạt động
của các Rnase nội bào và tách các protein liên kết khỏi phân tử
RNA.
Các protein được loại bỏ khỏi mẫu qua xử lý phenol:chloroform
và li tâm.
RNA hoà tan trong pha nước được kết tủa bằng ethanol và được
thu nhận lại qua li tâm. RNA có thể được bảo quản trên một năm
dưới dạng tủa trong dung dịch ethanol hoặc đông lạnh ở -70
o
C trong

nước có chứa RNasine (một chất ức chế RNase)
Sau khi một mRNA được phân lập khỏi tế bào, để có thể đưa chúng tham
gia vào kỹ thuật tái tổ hợp gen, trước hết chúng phải được chuyển sang dạng
cDNA bằng kỹ thuật DNA bổ sung. Chỉ ở dạng DNA mới có thể cắt nối bằng
enzyme hạn chế và ghép vào plasmid được.
- Phản ứng nhân bản gen PCR (Polymerase Chain Reation)
Như đã nói ở trên, nguồn cung cấp DNA cho kỹ thuật tái tổ hợp gen còn có
thể là sản phẩm PCR tinh khiết.
Phản ứng PCR là một phản ứng nhân tạo thực hiện trong PTN với sự tham
gia của các thành phần sau:
DNA làm khuôn
Oligonucleotide (hay còn gọi là primer): là hai chuỗi nucleotide
ngắn, được tổng hợp nhân tạo, có thể bám vào những vùng đặc hiệu trên
sợi DNA làm khuôn và trượt theo chiều tiến lại gần nhau.
Taq DNA polymerase: là loại enzyme rất bền và hoạt động tốt đến
nhiệt độ 96
o
C, được chiết xuất từ Thermus aquaticus (Taq)- một loại vi
khuẩn sống trong suối nước nóng.
Hỗn hợp deoxyribo-nucleotide triphosphate (dNTP): bao gồm các
thành phần deoxyribo-adenine triphosphate (dATP), deoxyribo- thymine
triphosphate (dTTP), deoxyribo-guanine nucleotide triphosphate (dGTP),
deoxyribo-cytosine triphosphate (dCTP) được hỗn hợp theo một tỷ lệ
thích hợp. Hỗn hợp này có nhiệm vụ cung cấp nguồn nucleotide cho quá
trình tổng hợp DNA xảy ra trong PCR.
Môi trường đệm (buffer): đảm bảo độ pH cần thiết.
Mg
2+
với hợp chất cung cấp là MgCl
2

với nồng độ 1.5-2.0 mM trong
phản ứng PCR.
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm 3 bước:
Bước 1: trong một dung dịch phản ứng bao gồm tất cả các thành phần
cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao
hơn Tm của phân tử, thường là 94-95
o
C trong vòng 30 giây đến 1-2 phút.
Chuỗi DNA bị bung mối liên kết hydro và tạo nên hai sợi DNA làm
khuôn. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation)
Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp xuống khoảng 37-65
o
C (thấp hơn Tm
của các primer), thông thường là 45-55
o
C (mà cho phép các primer bắt
cặp với các sợi DNA làm khuôn ở những vị trí thích hợp của chúng ),
trong khoảng từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization)
hay gắn (annealing)
Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72
o
C giúp cho DNA polymerase
hoạt hoá các primer để chúng trượt trên các sợi khuôn, lấy các dNTP
trong môi trường bổ sung vào sợi mới và tạo nên DNA mới. Thời gian
của bước này tuỳ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại,
thường kép dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay
kéo dài (elongation)
Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, thường sau 25-
35 chu kỳ là tốt nhất.

Sản phẩm PCR là một đoạn DNA có độ dài từ vài chục đến vài chục nghìn
nucleotide, thông thường đến 3000. Vì lẫn tạp nhiều thành phần khác tham gia
phản ứng PCR, nên sau khi được sản phẩm PCR, trước hết cần kiểm tra độ dài
của đoạn DNA trong sản phẩm có đúng với đoạn ước định cần có không bằng
phương pháp điện di khuếch tán trên thạch (agarose gel electrophoresis). Sau
đó, cần thiết phải được tinh khiết trước khi sử dụng làm vật liệu DNA cho kỹ
thuật tái tổ hợp gen.
- Phương pháp điện di:
Sau quá trình tách chiết, các nucleic acid có thể được tinh sạch nhờ một
số kỹ thuật như siêu ly tâm, sắc ký, hay điện di.
Phương pháp điện di được sử dụng cả trong phân tích định tính và thu
nhận mẫu nucleic acid. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính
cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên
khắp bề mặt, nên khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực
dương của điện trường. Tính linh động của phân tử trong bản thạch (gel) dưới
tác động của điện trường được tính theo công thức:
Log u = Log u
o
- K
r
C
Trong đó: Log u
o
là tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng, K
r
là hằng số làm chậm do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lượng
của phân tử nucleic acid, C là nồng độ của gel.
Vì vậy, tính linh động của phân tử phụ thuộc vào hai yếu tố: khối lượng
phân tử tức là số lượng nucleotide hay cặp nucleotide (DNA mạch đôi) và nồng
độ các chất cấu thành gel. Hai loại gel được sử dụng trong nghiên cứu nucleic

acid là gel polyacrylamide và gel agarose. Việc chọn loại gel cũng như nồng độ
các chất tạo thành gel tuỳ thuộc kích thước trung bình của các đoạn nucleic acid
cần phân tách.
Bảng 1. Tương quan giữa nồng độ gel và kích thước các đoạn cần phân tách
% acrylamide

4
5
8
11
Kích thước các đoạn cần phân tách
(cặp nucleotide)
200-800
80-200
40-100
10-50
% agarose

0.6-0.8
0.9-1.2
1.2-1.5
Kích thước các đoạn cần phân tách
(kb)
1-20
0.5-7
0.2-5
§ Gel agarose:
Là loại gel thông dụng nhất bởi thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách
những đoạn có kích thước 0.5-20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang
và điện di được thực hiện thep phương nằm ngang. Sau điện di, các nucleic acid

trong gel agarose sẽ hiện hình ở dạng những vạch màu đỏ cam dưới tia tử ngoại
(UV có λ=300 nm) nhờ sự có mặt của ethidium bromide (được cho vào gel
trước khi đổ)-có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới
tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Bên cạnh đó, để ước lượng kích
thước của các trình tự nucleic acid trong gel agarose, thường dùng một yếu tố
đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker). Đây là một tập hợp
nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết trước được gọi là thang DNA (DNA
ladder), thông thường sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể λ được thuỷ giải
bởi enzyme giới hạn Hind III.
§ Gel acrylamide:
Được dùng để tách các đoạn kích thước nhỏ (dưới 1000 cặp base. Thao tác
với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose, nên chỉ được sử dụng cho
những mục đích đặc hiệu như:
- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp
- Xác định trình tự DNA
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base.
Gel được đổ giữa 2 tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng
đứng. Nguyên tắc của loại điện di này là dựa vào sự thay đổi hướng điện trường
trong quá trình điện di. Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA
phải tự định hướng lại. Phân tử có kích thước càng lớn thì thời gian tự đinh
hướng càng lớn khiến cho nó di chuyển chậm hơn một phân tử kích thước nhỏ.
Một DNA đơn giản có thể tạo ra chỉ một ít băng. Nếu DNA ban đầu là rất
lớn và phức tạp, việc nhuộm gel sẽ cho thấy một băng đại diện cho sự biến thiên
hầu như là liên tục về kích thước của đoạn. Băng hay là phần chứa đoạn mong
muốn sẽ được định vị với kỹ thuật Southern blotting và được chuyển ra. Bởi vì
một một băng có thể đại diện cho một hỗn hợp vài đoạn, nó được điện di trên
một gel với một nồng độ khác nhau để tách các đoạn có kích thước tương tự.
- Thu nhận acid nucleic:
Điện di trên gel agarose còn được sử dụng để thu nhận mẫu. Sau khi điện
di, các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại

theo một trong các phương pháp sau:
Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA
được thu nhận sau khi đã khuếch tán từ gel agarose vào một dung dịch
đệm thích hợp.
Phương pháp 2: Một giếng nhỏ được khoét trong agarose ngay trước
vạch DNA. Giếng này được bơm dầy dung dịch đệm và điện trường được
tái lập. DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dịch đệm và được thu
nhận lại.
Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc
biệt có điểm nóng chảy rất thấp (65
o
C). Sau điện di, vạch DNA được cắt
ra, ủ ở trong một dung dịch đệm ở nhiệt độ 65
o
C. Khi agarose đã hoàn
toàn tan chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và
tủa.
b) Các enzyme thông dụng trong kỹ thuật di truyền
Các enzyme giới hạn (Restriction enzyme-RE)
Các thực khuẩn thể (phage) xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi
nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số luợng phage tăng lên đến hàng
triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên trong một số trường
hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiên tượng
này có thể là do DNA của phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt
khi vừa mới xâm nhập. Hệ thống bảo vệ này là các RE. DNA vi khuẩn không
bị chính các RE của chúng cắt là nhờ cơ chế gắn nhóm methyl vào A hay C ở
các vị trí cắt của các RE bởi enzyme methylase . Khi đó RE không còn nhận
biết được các vị trí cắt. Đây chính là hiện tượng giới hạn và các RE hợp thành
hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote.
Các RE là các endonuclease có khả năng nhận biết và cắt DNA mạch đôi

một cách lặp lại ở những vị trí (trình tự) xác định, và được ứng dụng chủ yếu
trong phương pháp tạo dòng.
• Ví dụ về RE:
EcoRI là enzyme đầu tiên được tìm thấy ở E.coli

↓
EcoRI 5’G A ATT C3’
3’C TTA A G5’
↑
(Dấu mũi tên thẳng đứng chỉ vị trí cắt)

Các enzyme thông dụng khác:
- Các polymerase: gồm 2 nhóm:
Các DNA polymerase xúc tác cho sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. Phần
lớn các DNA polymerase dùng DNA làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp DNA
(DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA
polymerase đặc biệt là enzyme phiên mã ngược (Reverse transcriptase) laị sử
dụng khuôn là RNA để tổng hợp DNA. Cuối cùng là Terminal transferase)- một
DNA polymerase không tổng hợp mạch mới từ khuôn mà chỉ thêm các
nucleotide vào đầu của một phân tử DNA đã có sẵn. Các DNA polymerase, để
hoạt động, phải cần một mồi (primer). Mồi là một đoạn oligonucleotide bắt cặp
bổ sung với phần đầu của khuôn, để từ đó các polymerase mới nối dài tạo cặp
bổ sung.
Các RNA polymerase tham gia tổng hợp RNA, thông dụng nhất là SP6, T7
và T3 RNA polymerase.
Cả hai nhóm này được sử dụng khi cần tạo một số lượng lớn bản sao của
nucleic acid (tạo mẫu dò, xác định trình tự nucleotide, ).
- Các ligase
Đây là các enzyme xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA (DNA
ligase) hay RNA (RNA ligase) và thường được sử dụng trong lĩnh vực tạo dòng.

- Các nuclease
Đây là nhóm các enzyme phân cắt DNA (DNase) và RNA (RNase)n một
cách không chuyên biệt. Trong khi các RE đã được đề cập ở phần trên cũng là
những nuclease nhưng mang tính chuyên biệt trình tự cao hơn.
c) Plasmid vector:
Plasmid là một thực thể vi sinh đơn giản nhất, có cấu trúc DNA khép kín
tạo thành vòng tròn, độ dài của plasmid có thể thay đổi từ vài nghìn nucleotide
đến vài trăm nghìn nucleotide, nằm ngoài hệ gen của một vi khuẩn hay VSV,
nhưng có liên hệ chặt chẽ với tế bào vật chủ theo lối cộng sinh, nhân lên cùng
với sự nhân lên của NST.
Plasmid được sử dụng để làm vector (vật có khả năng tải và truyền những
sản phẩm sinh học từ cá thể này sang cá thể khác) trong kỹ thuật tái tổ hợp gen
nhờ trong cấu trúc của chúng có một vùng đặc biệt gọi là vùng ori. Vùng này là
một chuỗi ngắn nucleotide, nằm ở một nơi nào đó trong vòng tròn DNA của
plasmid, có chức năng quan trọng trong quá trình tự nhân lên tạo nhiều plasmid
mới. Đây là nơi mà DNA polymerase và các loại protein bám vào, mở đầu cho
chu kỳ nhân lên. Ngoài ra, nhờ vào đặc tính của một số plasmid mang gen
kháng kháng sinh (antibiotics) quy định khả năng sản xuất enzyme kháng kháng
sinh. Đó cũng là nguyên lý chọn lọc dựa trên khả năng kháng kháng sinh trong
kỹ thuật tái tổ hợp gen.
Để tạo được một plasmid vừa có khả năng dẫn truyền (cloning plasmid
vector), từ plasmid tổ tiên, trước tiên người ta tiếp tục đưa vào những vùng mới,
đặc biệt là vùng chứa tổ hợp gen chỉ thị nào đó (chẳng hạn gen chỉ thị là gen
kháng tetracyclin hay tổ hợp gen sản xuất các loại protein nhất định), mà thông
thường trong gen đó lại có một dãy các vị trí cắt của RE (dãy này được gọi là
polylinker hay multiple cutting site-MCS). Đó là nơi để thực hiện các thao tác
cắt, nối, ghép DNA, hay còn gọi là tái tổ hợp DNA. Nguyên lý chọn lọc được
dòng tế bào chủ tiếp nhận plasmid tái tổ hợp được dựa trên nguyên lý kháng
kháng sinh hay đặc tính hình thành màu khuẩn lạc do không có sự tổng hợp loại
protein chỉ thị trên

d) Tế bào chủ thích ứng cho plasmid (host cell)
Trong kỹ thuật tái tổ hợp gen, tế bào chủ phải là loại có khả năng thu
nhận plasmid dễ dàng, lưu giữ bền vững và tạo điều kiện cho plasmid nhân lên
nhiều và sản xuất tốt các sản phẩm tái tổ hợp.
Hiện nay có nhiều dòng tế bào E. coli như JM 101, JM 102, JM
109 được sử dụng làm tế bào chủ trong kỹ thuật tái tổ hợp gen (còn gọi là tế
bào thuần dưỡng-competent cell). Quá trình xâm nhập vào tế bào E. coli thuần
dưỡng được gọi là quá trình biến nạp (transformation).
Nếu sản xuất theo lối công nghệ vi sinh, plasmid trong vi khuẩn sẽ tổng
hợp ra một hay nhiều sản phẩm được mong muốn.

Lai phân tử- Lai trên pha rắn
1. Nguyên tắc
Hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích- trình tự cần tìm) được cố
định trên một giá thể rắn.
2. Các yếu tố kỹ thuật
Giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid là các màng lai. Có hai loại
màng lai:
- Màng lai bằng nỉtro-cellulose: là loại giá thể được sử dụng đầu tiên-
hiện nay không còn thông dụng do hai nhược điểm là độ bền cơ học kém nên
thao thác khó khăn, không thể tách rời các phân tử lai trên màng lai để lai trở lại
với một mẫu dò (probe) khác.
- Màng lai bằng nylon, có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với
nhiều mẫu dò khác nhau (cần loại bỏ mẫu dò cũ trước khi lai với mẫu dò mới)
3. Phương pháp Southern blot
Phương pháp này được sử dụng để định vị những trình tự đặc biệt trên
DNA bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid
Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (transfer) DNA từ gel lên
màng lai do Southern mô tả năm 1975.
- Các đoạn DNA được phân tách và được làm biến tính (biến thành hai

mạch đơn ) ngay trên gel rồi được chuyển lên màng lai và theo các bước sau:
Từ bồn chứa, dung dịch đệm được hút bởi giấy thấm dày, di chuyển theo lực
mao dẫn lên phía trên. Khi đi qua gel, dung dịch đệm sẽ kéo theo các acid
nucleic và chuyển chúng lên màng lai. Ngoài kỹ thuật chuyển nhờ lực mao dẫn,
hiện nay người ta còn sử dụng kỹ thuật chuyển nhờ dòng điện và chuyển trong
chân không cho hiệu quả cao hơn tuy đòi hỏi một số điều kiện kỹ thuật đặc biệt.
- DNA được cố định trên màng lai được đem lai với mẫu dò có đánh dấu
phóng xạ. Vật nặng đặt trên cùng giúp nén sát các thành phần tham gia vào quá
trình này. Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không
bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng.
- Cuối cùng, dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) hay sử
dụng một film nhạy cảm với tia xạ áp sát màng lai để định vị các phân tử lai
(DNA bộ gen: mẫu dò)

Sanger Dideoxy Sequencing
Sản phẩm kéo dài được phát triển bởi sự hình thành một cầu nối phosphodiester
giữa nhóm 3´-hydroxyl tại đầu cuối đang kéo dài của primer và nhóm 5´-
phosphate của deoxynucleotide sắp gắn. Sự kéo dài được tiến hành theo hướng
5´-3´. Điều đáng lưu ý là DNA polymerases cũng có thể gắn những chất tương
tự với các nucleotide bases. Phương pháp dideoxy trong sequencing DNA đã
được phát hiện bởi Sanger (1977) đã lợi dụng khả năng này bằng việc sử dụng 2
´,3´-dideoxynucleotides như là cơ chất. Khi một dideoxynucleotide được gắn
vào vị trí 3´ tận cùng của chuỗi đang kéo dài, sự kéo dài chuỗi được kết thúc
một cách chọn lọc tại A, C, G, hay T bởi chuỗi thiếu một nhóm 3´-OH tận cùng
của chuỗi đang kéo dài.
Fluorescent Sequencing
Các nhãn được gắn vào các sản phẩm DNA kéo dài bằng cách sử dụng
dideoxynucleotide triphosphates được dán nhãn thuốc nhuộm ở đầu 3´. Applied
Biosystems DNA sequencers phát hiện các hùynh quang từ 4 loại thuốc nhuộm
khác nhau mà được sử dụng để xác định các phản ứng kéo dài A, C, G, and T.

Mỗi thuốc nhuộm sẽ phát sáng tại một bước sóng khác nhau khi chiếu bởi một
argon ion laser. Vì vậy, tất cả 4 màu và 4 bases có thể được phát hiện và phân
biệt. trong một bản gel đơn hay được truyền mao dẫn.
2.1. PHỤC HỒI SINH HỌC (BIOREMEDIATION)
Bioremediation được sử dụng cho các hệ thống sinh học để làm giảm ô
nhiễm từ không khí hay từ nước hay các hệ thống đất đai. Các vi sinh vật và
thực vật là các hệ thống sinh học mà thường được sử dụng. Sự phân huỷ sinh
học bởi các vi sinh vật xuất hiện thường xuyên nhất trong bioremediation. Vi
sinh vật có thể phân giải hầu hết các hợp chất để sử dụng cho sinh trưởng, phát
triển và/hoặc nhu cầu năng lượng của chúng. Các quá trình phân huỷ sinh học
này có thể cần hay không cần không khí. Trong một số trường hợp, các con
đường đồng hoá mà các cơ thể thường sử dụng cho sự sinh trưởng, phát triển và
nguồn năng lượng cũng có thể được sử dụng để phân giải các phân tử gây ô
nhiễm. Trong các trường hợp này mà được biết như là đồng-đồng hoá (co-
metabolism), vi sinh vật không đem lại lợi ích trực tiếp. Các nhà nghiên cứu tận
dụng hiện tượng này và sử dụng nó cho các mục đích phục hồi sinh học. Một
quá trình phân huỷ sinh học hoàn toàn sẽ đưa đến việc khử độc tố bởi việc
khoáng hoá các chất gây ô nhiễm thành CO
2
, nước và các muối vô cơ vô hại.
Quá trình phân huỷ không hoàn toàn sẽ tạo ra các sản phẩm bị phân giải mà có
thể (hay không thể) là ít độc hại hơn so với chất ô nhiễm ban đầu. Ví dụ, quá
trình phân huỷ không hoàn toàn tri- hay tetrachloroethylene có thể tạo ra
vinylchloride mà là độc và có tính năng gây ung thư cao hơn so với các hợp
chất ban đầu.
Phân huỷ sinh học có thể xuất hiện một cách tự phát mà trong trường hợp
ấy các thành ngữ “phục hồi sinh học cố hữu- intrinsic bioremediation” hay
“phân giải tự nhiên- natural attenuation” thường được sử dụng. Tuy nhiên, trong
nhiều trường hợp các hoàn cảnh tự nhiên là không đủ thuận lợi cho điều này xảy
ra do sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng, oxygen hay vi khuẩn thích hợp. Tình

trạng như vậy có thể được cải thiện bằng cách bổ sung một hay nhiều hơn các
điều kiện tiên quyết này. Ví dụ, các chất thêm vào đã được sử dụng để đẩy
nhanh tốc độ phân giải dầu bị tràn trên 1000 miles đường bờ biển Alaska vào
1989. Xu hướng tương lai trong phục hồi sinh học là nhìn vào tốc độ phân huỷ
sinh học không được hỗ trợ trước tiên và chỉ thực hiện nếu có hoạt động không
thích hợp cho việc loại bỏ chất gây ô nhiễm một cách nhanh chóng đủ để ngăn
chặn bất kỳ nguy cơ được lường trước nào của chất gây ô nhiễm.
Các kỹ thuật phục hồi sinh học có thể được sử dụng để giảm thiểu hay để
loại bỏ chất thải độc hại gây ô nhiễm môi trường. Chúng cũng có thể được sử
dụng để xử lý các dòng chất thải trước khi chúng được thải ra khỏi nhà máy.
Một số các ứng dụng của phục hồi sinh học được bàn luận sau đây.
2.1.1 Nước thải và chất thải công nghiệp:
Vi sinh vật trong các nhà máy xử lý nước thải đã loại bỏ các chất gây ô
nhiễm thông thường từ nước thải trước khi nó được thải vào các con sông hay
biển. Sự ô nhiễm do các hoạt động công nghiệp và nông nghiệp càng ngày càng
tăng dẫn đến một nhu cầu lớn hơn về các quá trình loại bỏ các chất gây ô nhiễm
đặc biệt, như là các hợp chất nitrogen và phosphore, các kim loại nặng và các
hợp chất chlorine. Các phương pháp mới bao gồm các quá trình hiếu khí, kị khí
và hoá- lý trong các hệ thống lọc cố định (fixed-bed filters) trong các bể phản
ứng sinh học (bioreactors) mà ở đó các vật liệu và các vi sinh vật được lưu giữ
trong dạng dịch huyền phù. Các chi phí xử lý nước thải có thể được giảm bởi
sự chuyển hoá các chất thải thành các sản phẩm hữu ích. Ví dụ, các kim loại
nặng và các hợp chất sulphur có thể được loại bỏ từ các các dòng chất thải của
công nghiệp mạ kền bởi các vi khuẩn đồng hoá sulphur và tái sử dụng. Một ví
dụ khác là sản xuất thức ăn động vật từ sinh khối nấm mà còn lại sau khi sản
xuất penicillin. Hầu hết các hệ thống xử lý nước thải kị khí sản xuất khí sinh
học (biogas) có ích.
2.1.2. Nước uống:
Một phương diện rất quan trọng của công nghệ sinh học là tiềm năng của
nó trong việc phục hồi và tinh sạch nước thải cho sự tái sử dụng. Sự quan tâm

của cộng đồng về chất lượng nước uống cũng tăng lên. Không chỉ nước cần
được quay vòng trong sự phát triển của việc sử dụng bền vững các nguồn tài
nguyên mà chất lượng toàn diện cũng phải được cải thiện để thoả mãn người
tiêu dùng. Trong nhiều vùng nông nghiệp trên thế giới, chất thải động vật và
phân bón dư thừa dẫn đến nồng độ cao của nitrate trong nước uống. Công nghệ
sinh học đã cung cấp các phương pháp thành công mà trong đó các hợp chất này
có thể được loại bỏ khỏi nước đã được sử dụng trước khi nó được phân phối đến
người tiêu dùng.
2.1.3. Không khí và khí thải:
Ban đầu, các hệ thống xử lý khí thải công nghiệp đã được dựa trên các bộ
phận lọc rẻ tiền được chứa đầy phân hữu cơ (compost) mà đã loại bỏ được các
mùi. Các hệ thống như thế vẫn tồn tại. Tuy nhiên, tốc độ thực hiện chậm và thời
hạn sử dụng của các bộ phận lọc là ngắn đã đưa các nghiên cứu tìm ra các
phương pháp tốt hơn như là bioscrubbers mà trong đó các chất gây ô nhiễm
được rữa sạch bằng cách sử dụng một dịch huyền phù tế bào và các bộ lọc nhỏ
giọt sinh học (biotrickling) mà trong đó chất gây ô nhiễm được phân huỷ bởi
các vi sinh vật được cố định trên một giá thể cố định và được cung cấp với một
lớp mỏng chất dinh dưỡng lỏng mà nhỏ giọt qua thiết bị. Sự chọn lựa vi sinh vật
mà có hiệu quả hơn trong việc đồng hoá các chất gây ô nhiễm cũng đã tạo ra
các bộ lọc sinh học làm sạch không khí và khí thải tốt hơn. Ví dụ là một
bioscrubber dựa trên hệ thống loại bỏ đồng thời nitrogen và sulphur oxides từ
khí ống khói của lò cao mà đã được phát triển như là một lựa chọn cho quá trình
nung vôi truyền thống, và sự loại bỏ styrene từ khí thải của các ngành công
nghiệp sản xuất polystyrene bởi một bộ lọc sinh học chứa nấm.
2.1.4. Xử lý đất và mặt đất:
Cả hai phương pháp in-situ (tại chính vị trí ban đầu của nó) và ex-situ
(một nơi nào khác) được khai thác một cách thương mại cho mục đích làm sạch
đất và nước ngầm kết hợp. Việc xử lý tại chỗ (in-situ treatment) có thể bao gồm
việc bổ sung các vi sinh vật (bioaugmentation), thông khí và/hoặc thêm các
sung dịch dinh dưỡng (biostimulation). Việc xử lý khác chỗ phát hiện (ex-situ

treatment) liên quan đến việc di chuyển đất và nước ngầm và xử lý nó trên mặt
đất. Đất có thể được xử lý như là phân bón hữu cơ (compost), trong các đống
đất hay trong các lò phản ứng bùn chuyên dụng. Nuớc ngầm được xử lý trong
các lò phản ứng bùn và hoặc được bơm trở lại vào đất hay được tháo vào nước
bề mặt. Phục hồi sinh học thường là rẻ hơn phương pháp lý học và các sản
phẩm của nó là vô hại nếu quá trình khoáng hoá hoàn toàn xảy ra. Tuy nhiên,
hoạt động của nó có thể là tiêu tốn thời gian, chiếm dụng một thời gian dài vốn
đầu tư và đất đai. Phục hồi sinh học tại chỗ (in-situ bioremediation) đất nằm
dưới các trạm xăng dầu giờ đây đã trở nên phổ biến, nhưng đối với các dung
môi chứa clo như là tri- và tetrachloroethylene, việc phục hồi sinh học tại chỗ
cũng là có thể. Khả năng ứng dụng việc phục hồi sinh học có thể sẽ phụ thuộc
vào các thông số lý học của đất, chủ yếu là các đặc điểm vận chuyển của nó.
Phục hồi sinh học sử dụng thực vật được gọi là phytoremediation. Kỹ thuật này
hiện nay được sử dụng để loại bỏ các kim loại từ các đất và nước ngầm bị ô
nhiễm và tương lai sẽ được ứng dụng cho việc xử lý các chất ô nhiễm khác.
Việc sử dụng kết hợp thực vật và vi khuẩn cũng là có thể. Các vi khuẩn cộng
sinh với rễ thực vật và phụ thuộc vào các chất được tiết ra bởi rễ cây. Các vi
khuẩn vùng rễ (rhizobacteria) như thế, mà số lượng của chúng là lớn hơn nhiều
so với số lượng của các vi khuẩn đất khác, có thể được biến đổi di truyền để phá
vỡ các chất ô nhiễm. Nghiên cứu đang được tiến hành để kiểm tra giả thuyết
này.
2.1.5. Chất thải rắn (Solid waste): các chất thải rắn nội địa là một vấn đề chính
trong xã hội tiêu dùng của chúng ta. Việc loại bỏ chúng được theo dõi thường
xuyên bởi liên quan đến ô nhiễm nước ngầm và không khí. Tuy nhiên, chúng
bao gồm một phần lớn là các chất hữu cơ dễ phân huỷ sinh học. Vì vậy, nguồn
được phân biệt là chất thải sinh học có thể được chuyển thành một nguồn tài
nguyên có giá trị bởi việc ủ và phân giải kỵ khí. Trong những năm gần đây, quá
trình này đã có những bước phát triển đáng ghi nhận về cả thiết kế và điều chỉnh
quá trình. Cụ thể là, sự phân giải kị khí các chất thải rắn trong các bể phân giải
kị khí tốc độ cao đã đạt được sự chấp nhận ngày càng tăng của công chúng bởi

nó cho phép phục hồi một số lượng lớn khí sinh học có giá trị cao cùng với các
cặn bã hữu cơ ổn định có chất lượng cao và điều này không làm tăng sự khó
chịu cho môi trường. Hơn thế nữa, sự phân giải kỵ khí của các chất thải rắn hỗn
hợp đang được tập trung phát triển bởi vì trong tương lai gần, nó có thể là một
bước quan trọng trong vòng tuần hoàn của chất thải rắn và là một giải pháp
được chọn lựa cho sự phân huỷ rác.
2.2. NGĂN CHẶN (PREVENTION)
Càng ngày càng có nhiều nhà máy công nghiệp phát triển các quy trình
với khả năng tác động đến môi trường đã được giảm thiểu đáp ứng với lời kêu
gọi toàn cầu về sự phát triển của một xã hội bền vững. Có một khuynh hướng
rộng khắp về các sản phẩm và các quy trình ít gây hại; cách xa việc xử lý “end-
of-pipe” của các dòng thải. Công nghệ sinh học là thích hợp hơn hẳn để đóng
góp vào khuynh hướng này trong nhiều trường hợp, cả việc cải thiện các quy
trình đang tồn tại và phát triển các quy trình mới.
2.2.1. Cải tiến quy trình:
Nhiều quy trình công nghiệp đã được thiết kế sao cho thân thiện hơn với
môi trường bởi việc sử dụng các enzymes. Enzymes là những chất xúc tác sinh
học mà có hiệu quả cao và có ưu điểm hơn nhiều so với các chất xúc tác không
phải là sinh học. Chúng không độc và có thể được phân giải sinh học, hoạt động
tốt nhất ở các nhiệt độ vừa phải và trong các điều kiện ôn hoà, và có các phản
ứng phụ ít hơn so với các phương pháp truyền thống bởi vì chúng có tính đặc
hiệu cao. Các phương pháp sản xuất mà ứng dụng các enzymes nói chung
không chỉ là sạch hơn và an toàn hơn so với các phương pháp khác, mà hầu như
cũng kinh tế hơn về năng lượng và tiêu dùng tài nguyên. Tuy nhiên, tính đặc
hiệu của chúng ngụ ý là thường không dễ dàng tìm thấy enzyme thích hợp cho
một ứng dụng cần thiết. Các enzymes đã được ứng dụng rộng rãi trong công
nghiệp nhiều năm qua. Các kỹ thuật mới và các hướng tiếp cận liên quan đến
thiết kế protein và mô hình phân tử đang tạo điều kiện cho các nhà nghiên cứu
có thể phát triển các enzyme mong muốn hoạt động được tại các nhiệt độ cao,
trong các dung môi không lỏng và dưới dạng các chất rắn.

2.2.2. Đổi mới sản phẩm (Product innovation):
Công nghệ sinh học cũng có thể giúp cho việc sản xuất các sản phẩm mới
mà ít tác động đến môi trường hơn là các tiền nhiệm của chúng. Việc sản xuất
các vật liệu sinh học mới như là nhựa sinh học tránh việc sử dụng các nguồn tài
nguyên không thể tái tạo được như các năng lượng hoá thạch. Khoai tây bình
thường chứa 80% amylopectin nhưng cũng chứa khoảng 20% amylose mà
không được mong muốn trong nhiều ứng dụng. Để phân lập amylopectin tinh
khiết, một lượng lớn nước và năng lượng được tiêu thụ. Một công ty Hà Lan đã
phát triển một giống khoai tây được biến đổi di truyền mà không chứa amylose
và vì vậy có thể có quy trình hoạt động với ít tác động đến môi trường hơn.
Việc sử dụng các giống thực vật được biến đổi gen mà có khả năng kháng côn
trùng và/hoặc dịch bệnh có thể được hạn chế đáng kể việc sử dụng thuốc trừ sâu
mà không chỉ ngăn chặn việc sử dụng các vật liệu thô hầu như không thể tái tạo
được, năng lượng và nhu cầu lao động cho việc sản xuất chúng, mà cũng sẽ làm
giảm các tác động có hại của việc tích luỹ chúng. Có nhiều hơn các giả pháp
công nghệ sinh học này cho sự ô nhiễm đã và đang được phát triển. Chẳng hạn,
lợn và gà không thể sử dụng phosphate từ phytate có trong thức ăn của chúng,
vì vậy sẽ hiện diện trong phân của chúng. Bằng việc thêm enzyme phytase vào
thức ăn của chúng, lượng phosphate mà được thải ra bởi các động vật này có thể
được giảm gần hơn 30 %. Ở Nam Phi, các vi khuẩn được sử dụng để phân lập
vàng từ quặng vàng. Điều này cũng được gọi là biomining tiết kiệm một số
lượng lớn năng lượng gây nóng chảy và tạo ra chất thải ít hơn nhiều. Việc sản
xuất hoá chất indigo, là thuốc nhuộm mà được sử dụng cho quần jean xanh và
tiến hành qua 8 bước, việc sử dụng các hoá chất rất độc và quy định bảo vệ đặc
biệt cho người vận hành quy trinh và môi trường. Việc sản xuất indigo bằng
công nghệ sinh học mà sử dụng một vi khuẩn được biến đổi di truyền chứa các
enzymes phù hợp, chỉ tiến hành trong 3 bước, proceeds trong nước, sử dụng các
vật liệu thô đơn giản như đường và muối và chỉ tạo ra indigo, carbon dioxide và
sinh khối mà có thể được phân giải sinh học.
Các phát triển trong tương lai có thể liên quan đến nhiều điều mà tại thời

điểm này dường như là khoa học viễn tưởng đối với hầu hết người dân như là sự
thay thế các siêu sợi được sản xuất bằng phương pháp hoá học bởi sợi tơ mạng
nhện được sản xuất bằng phương pháp vi sinh vật. Tuy nhiên, một điều mà
không nên bị quên là việc sử dụng gia tăng các hệ thống sinh học trong công
nghiệp nên được kèm theo bởi sự tập huấn và sự bảo vệ thích hợp cho các công
nhân làm việc với những hệ thống này, như là trong các bộ phận khác của công
nghệ.
2.3. PHÁT HIỆN VÀ GIÁM SÁT (DETECTION AND MONITORING)
2.3.1. Phát hiện và giám sát các chất ô nhiễm (Detection and monitoring of
pollutants):
Một phạm vi rộng của các phương pháp sinh học rõ ràng được sử dụng để
phát hiện các biến cố ô nhiễm và giám sát một cách liên tục các chất gây ô
nhiễm. Các thước đo đã được thiết lập từ lâu bao gồm: đếm số lượng các loài
thực vật, động vật và vi sinh vật, đếm số lượng các cá nhân trong những loài đó
hay phân tích nồng độ oxygen, methane hay các phức hợp khác trong nước. Gần
đây hơn, các phương pháp phát hiện sinh học sử dụng các cảm biến sinh học
(biosensors) và các xét nghiệm miễn dịch (immunoassays) đã được phát triển và
bây giờ đang được thương mại hoá. Hầu hết các biosensors là một sự kết hợp
của các thiết bị sinh học và điện tử-thường hay được xây dựng trên một
microchip. Hợp phần sinh học có thể đơn giản là là một enzyme hay kháng thể,
hoặc thậm chí là một khuẩn lạc vi khuẩn, một màng, điểm nhận thần kinh, hay
một cơ thể toàn vẹn. Được cố định trên một cơ chất, các đặc tính của chúng thay
đổi tương ứng với một số ảnh hưởng môi trường trong một cách mà có thể được
phát hiện bằng điện hay quang học. Sau đó số lượng của chất gây ô nhiễm có
thể được xác định với một sự chính xác hết sức hay sự nhay cảm rất cao. Các
cảm biến có thể được thiết kế có chọn lựa kỹ lưỡng, hay nhạy cảm đối với một
phổ rộng các phức chất. Ví dụ, một phổ rộng các chất diệt cỏ có thể được phát
hiện trong nước sông bằng cách sử dụng các biosensors từ tảo; những áp lực tác
động lên các cơ thể được đánh giá dựa vào sự thay đổi trong các đặc tính quang
học của chlorophyll của thực vật. Các biosensors vi sinh vật là các vi sinh vật

mà sinh ra một phản ứng khi tiếp xúc với chất được nhận biết. Thông thường
chúng phát sáng nhưng ngừng lại để thực hiện phản ứng khi tiếp xúc với các
chất mà là độc đối với chúng. Cả hai loại vi sinh vật phát sáng xuất hiện một
cách tự nhiên cũng như là vi sinh vật được phát triển một cách đặc biệt đều
được sử dụng. Các biosensors vi khuẩn hoạt động một cách chắc chắn đã được
tạo ra mà bắt đầu phát sáng khi tiếp xúc (và sau đó là phản ứng) với một chất
gây ô nhiễm đặc hiệu. Ở Mỹ, một vi khuẩn phát sáng như thế đã được chấp
nhận cho mục đích phát hiện các polyhalogenated aromatic hydrocarbons trong
các test thực địa.
Các xét nghiệm miễn dịch sử dụng các kháng thể đã được dán nhãn (các
protein phức tạp được sản xuất ra trong đáp ứng sinh học với các tác nhân đặc
hiệu) và các enzymes để đo các nồng độ của chất gây ô nhiễm. Nếu một chất
gây ô nhiễm hiện diện, kháng thể sẽ gắn vào nó; nhãn làm cho nó có thể được
phát hiện hoặc là thông qua sự thay đổi màu sắc, phát huỳnh quang hoặc là hoạt
động phóng xạ. Các xét nghiệm miễn dịch của các dạng khác nhau đã được phát
triển cho việc quản lý thuốc trừ sâu như là dieldrin và parathion một cách liên
tục, tự động và không đắt. Bản chất của những kỹ thuật này, mà những kết quả
của chúng có thể đơn giản như là một sự thay đổi màu sắc, khiến cho chúng đặc
biệt thích hợp cho các test thực địa có độ nhạy cảm cao, nơi mà thời gian và các
trang thiết bị lớn là được cần cho việc kiểm tra truyền thống hơn là không thực
tế. Tuy nhiên việc sử dụng chúng bị giới hạn đối với các chất gây ô nhiễm mà
có thể phá vỡ các kháng thể sinh học. Nếu các chất ô nhiễm là phản ứng quá
mạnh, chúng hoặc là sẽ tàn phá kháng thể hoặc là kiềm chế hoạt động của nó và
vì vậy cũng kiềm chế sự hiệu quả của việc kiểm tra.
2.3.3. Phát hiện và giám sát các vi sinh vật được sử dụng cho phục hồi sinh học:
Khi các vi sinh vật được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm được gây cấy
vào một vị trí phục hồi sinh học (bioaugmentation), thường cần giám sát sự hiện
diện của chúng và/hoặc sự tăng số lượng để kiểm tra tiến trình của quá trình.
Điều này là đặc biệt đúng và thậm chí được yêu cầu khi liên quan đến các vi
sinh vật được biến đổi di truyền. Các kỹ thuật truyền thống nhằm phát hiện sự

hiện diện của các vi sinh vật trong đất là đặt trực tiếp trên các đĩa chứa các môi
trường đặc hiệu (selective media). Điều này là thuận lợi lớn nếu cơ thể chứa
một dấu hiệu (marker) mà có thể được tuyển chọn. Các kỹ thuật mới hơn bao
gồm các kỹ thuật thiết bị cảm biến sinh học dựa vào miễn dịch và ánh sáng như
đã được đề cấp trên đây. Sự phân bố về mặt không gian của các vi sinh vật đặc
biệt trong một mẫu vật có thể được xác định bằng kính hiển vi và bằng non-
invasively bởi việc sử dụng fluorescent in situ hybridisation (FISH) của vi sinh
vật. Kỹ thuật nhạy cảm và đặc hiệu nhất là phân lập trực tiếp và khuếch đại
DNA từ đất, mà càng ngày càng được sử dụng rộng rãi.
2.3.4. Phát hiện và giám sát các ảnh hưởng sinh thái học:
Phục hồi sinh học đặt ra mục đích cải thiện chất lượng môi trường bằng
việc loại bỏ chất gây ô nhiễm. Tuy nhiên, sự biến mất của chất gây ô nhiễm ban
đầu không phải là tiêu chuẩn duy nhất mà nhờ đó sự thành công của một quá
trình phục hồi sinh học được xác định. Các sản phẩm chuyển hoá là độc (thậm
chí còn độc hơn) có thể được sinh ra từ chất ô nhiễm hay một vi khuẩn có khả
năng phân huỷ sinh học có thể gây ra các bệnh hay sinh ra các chất mà là độc
hại cho các vi sinh vật có ích, thực vật, động vật hay con người. Tất cả các ảnh
hưởng tiêu cực này tất nhiên là được loại trừ trước nhiều như có thể bằng cách
thu thập thông tin liên quan với cơ thể thông qua các nghiên cứu tổng quan lớn
và các nghiên cứu nhỏ mà trong đó quá trình phục hồi sinh học được tái hiện
trong phòng thí nghiệm. Để tránh các ảnh hưởng không mong đợi, đặc biệt là
sau khi bổ sung thành viên mới của hệ sinh thái như là một cơ thể được biến đổi
di truyền, việc giám sát các ảnh hưởng sinh thái của một quá trình phục hồi sinh
học có thể được yêu cầu. Vấn đề của việc giám sát các ảnh hưởng sinh thái là
cái gì được giám sát . Các ảnh hưởng sinh thái có thể là rất phong phú, nhưng
không phải tất cả chúng có thể liên quan đến hay thậm chí là kết quả của sự vận
hành quá trình phục hồi sinh học. Các thông số được giám sát thông thường
được xác định ttừ trường hợp này sang trường hợp khác (case-by-case). Các kỹ
thuật giám sát có thể bao gồm tất cả các kỹ thuật đã được đề cập đến trong hai
tiểu phần trước đây về phát hiện và giám sát.

2.4. KỸ THUẬT DI TRUYỀN (GENETIC ENGINEERING)
Kỹ thuật DNA tái tổ hợp đã có những ảnh hưởng đáng ngạc nhiên trong vài
năm qua. Các nhà sinh học phân tử đã lập bản đồ toàn bộ bộ gen, nhiều phương
thuốc mới đã được phát triển và được giới thiệu, và các nhà nông nghiệp đang
tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng bệnh mà không thể có được thông
qua việc tạo giống truyền thống. Một vài ví dụ đã được đề cập trước đây như
khoai tây không chứa amylose và các vi khuẩn sản xuất indigo (thuốc nhuộm
chàm) cũng liên quan đến việc sử dụng các cơ thể được biến đổi di truyền bằng
kỹ thuật DNA tái tổ hợp . Nhiều enzymes thường cũng được sản xuất bởi các cơ
thể biến đổi di truyền. Trước sự đa dạng rất lớn của loài, các phân tử sinh học và
các con đường đồng hoá trên hành tinh này, kỹ thuật di truyền về nguyên tắc có
thể là công cụ đắc lực trong việc tạo ra các lựa chọn thân thiện hơn với môi
trường cho các sản phẩm và các quy trình mà hiện tại gây ô nhiễm môi trường
hay sử dụng cạn kiệt các nguồn tài nguyên không tái tạo. Chính trị, kinh tế và xã
hội cuối cùng sẽ xác định các khả năng nào của khoa học sẽ trở thành hiện thực.
Ngày nay, các cơ thể cũng có thể được bổ sung với những đặc điểm di truyền
thêm vào cho khả năng phân huỷ sinh học của các chất gây ô nhiễm đặc biệt
nếu các cơ thể xuất hiện một cách tự nhiên là không thể làm được công việc đó
một cách thích hợp hay không đủ nhanh. Bằng việc kết hợp các khả năng đồng
hoá khác trong cùng một vi sinh vật, các cổ chai trong sự làm sạch môi trường
có thể được. Cho đến bây giờ điều này vẫn chưa được thực hiện trên bất kỳ một
quy mô đáng kể nào. Nguyên nhân chính của sự thật này là trong hầu hết các
trường hợp, các vi sinh vật xuất hiện một cách tự nhiên có thể được phát hiện
hay tuyển chọn, mà có thể làm sạch một vị trí bị ô nhiễm. các ví dụ đã được
phát hiện tại nơi mà các vi khuẩn đất đã phát triển các đặc tính mới đáp ứng với
sự đưa vào các chất ngoại lai xenobiotics (đó là các hoá chất nhân tạo mà thông
thường không được phát hiện trong tự nhiên). Trong một vài trường hợp chúng
thậm chí dường như có các đặc tính được đòi hỏi từ các loài khác nhau. Ở Mỹ,
một vài vi khuẩn được biến đổi di truyền đã được chấp nhận cho các mục đích
phục hồi sinh học nhưng các ứng dụng ở quy mô lớn vẫn chưa được báo cáo. Ở

Châu Âu chỉ các test thực địa được được khống chế là được công nhận. Bởi vì
các cơ thể mới có thể được tạo ra bởi kỹ thuật di truyền mà có thể chưa bao giờ
được tạo ra do chọn lọc tự nhiên dẫn đến sự tiến hoá, tồn tại những quan tâm về
việc không thể tiên đoán được các mối quan hệ qua lại có thể có của chúng với
hệ sinh thái. Các cơ thể biến đổi di truyền mà được giữ một cách thích hợp
trong các confines of their approved production facilities là ít được quan tâm
hơn nhiều so với các cơ thể được biến đổi di truyền mà được thả nào trong môi
trường như các cây kháng bệnh hay các vi khuẩn đất cho sự phục hồi sinh học.
Các ảnh hưởng sinh thái học có thể có của vấn đề sau thậm chí là khó khăn hơn
để đánh giá do sự thật là các vi khuẩn đất được biết rõ rằng thường xuyên trao
đổi vật liệu di truyền (cũng xảy ra giữa các loài khác nhau). Điều này cùng với
sự thật rằng chúng ta ít được biết đến phần rất lớn của các loài vi khuẩn sống
trong đất, khiến cho hầu như không thể tiên đoán được số phận của mỗi bản sao
DNA của một đặc tính di truyền mới được đưa vào trong một vi khuẩn đất. Nếu
DNA thêm vào có nguồn gốc từ một vi khuẩn đất khác, là hợp lý để tranh cãi
rằng một ngày nào đó vi khuẩn được biến đổi di truyền cũng có thể tiến hoá
đồng thời do sự trao đổi thường xuyên vật liệu di truyền trong đất.