Cắt, chia phôi bò doc

Cắt, chia phôi bò

1 Khái niệm
Cắt, chia phôi (vi phẫu thuật phôi) là sử dụng kỹ thuật nhằm di
chuyển nhóm tế bào phôi nằm phía trong màng trong suốt. Nhờ đó có thể
chia nhóm tế bào này làm đôi hoặc ghép các nhân hay cấu trúc nhân của các
tế bào phôi khác nhau lại với nhau.
Sau đây, chúng tôi chỉ đề cập đến một vấn đề là cắt (chia phôi) làm
đôi (dùng kỹ thuật để chia một phôi ban đầu thành hai phôi). Đây cũng là
bước đơn giản đầu tiên của quá trình nhân phôi vô tính.
2 Mục đích
- Tăng số lượng phôi: từ một phôi ban đầu giúp người chăn nuôi có
nhiều bê hơn, đặc biệt những bê giống nhau. Những bê giống nhau về di
truyền đã giúp cho việc đánh giá chính xác kiểu di truyền trong cùng một
điều kiện ngoại cảnh hoặc một yếu tố nào đấy của điều kiện ngoại cảnh ảnh
hưởng đến năng suất hay kiểu hình của vật nuôi. Một cặp sinh đôi cùng
trứng có giá trị bằng cả nhóm đối chứng 10-25 (hoặc nhiều hơn) các bê bình
thường khác (Hancock, 1954).
- Cắt phôi giúp cho việc xác định giới tính của phôi.
- Cắt phôi giúp cho việc tăng tỷ lệ bò sinh đôi, hạn chế hiện tượng
freematin (đực, cái) thường gặp khi sinh đôi ở 2 phôi thuộc 2 trứng khác
nhau.
-Cắt phôi tạo điều kiện và giúp các nghiên cứu khác phát triển. Sơ đồ
dưới đây minh họa một phần lợi ích của việc cắt phôi.
100
phôi bình
thường
Cấ
y chuyển
Tỷ
l

ệ đậu thai
65%

Sinh ra
65
?bê con










10
0 phôi

200
phôi sau

Cấ
y chuyển


T
ỷ lệ đậu

Sin

h ra 100
bình
thường
khi c
ắt
đôi
thai
50%
bê con






3 Quá trình phát triển
* Tạo sinh đôi từ một trứng
Để có nhiều con cho một thế hệ của mỗi phôi, người ta sử dụng cắt
phôi để có được những con vật hoàn toàn giống nhau về mặt di truyền, có
thể tiến hành nghiên cứu sinh lý của chúng, mặt khác cũng để khắc phục
hiện tượng vô sinh ở bò và tăng cường khả năng sức sinh sản ở con cái.
Nghiên cứu đầu tiên do Moor và cs. (1968) tiến hành nhưng không
thành công. Đến 1979, những cặp đẻ sinh đôi (do Willadsen cắt phôi) mới ra
đời. Theo ông (1980), có được những cặp đẻ sinh đôi là do kết quả cắt phôi
ở giai đoạn đầu (2-4 và 8 tế bào).
Để thu được phôi sớm: sau rụng trứng 5 ngày phải thu phôi (phương
pháp giải phẫu) trước khi phôi chuyển tới sừng tử cung. Sau đó vi phẫu phôi
để lấy ra các tế bào phôi sớm và đưa các tế bào này vào trong các màng
trong suốt mới và kín. Tất cả được bảo vệ bằng màng a-ga để tránh thất thoát
tế bào và tạo điều kiện dễ dàng cho việc kiểm soát. Sau đó những phôi cắt

được cấy vào một con vật nhận trung gian (ống dẫn trứng của cừu cái giả
chửa) trong 4 ngày. Phôi tiếp tục phát triển trong môi trường tử cung của
con vật sống đến khi trở thành phôi nang. Sau đó thu hoạch các phôi trên và
cấy truyền cho những con bò nhận, bò sẽ có chửa và đẻ con bình thường.
Willadsen (1981) cắt đôi những phôi có 8 tế bào. Những phôi có 4 tế
bào này được nuôi cấy trên con vật 4 ngày, kết quả 77% số nửa phôi phát
triển đến giai đoạn phôi nang, và 63% cấy phôi có chửa.
Ozil (1982) đề nghị phương pháp mới như phương pháp của
Willadsen nhưng phôi được cắt ở giai đoạn 6-8 ngày tuổi.
Cắt phôi được? thực hiện trên một mặt phẳng đứng bằng một lưỡi dao
vi phẫu không cần phải đưa số tế bào phôi ra khỏi màng trong suốt và sau đó
đưa phôi mới được cắt vào trong môi trường nuôi phôi trong khoảng thời
gian ngắn, sau đó cấy cho con cái nhận không cần thiết phải qua con vật cấy
ở giai đoạn trung gian. Kỹ thuật này cũng loại trừ được việc thu hoạch phôi
bằng phương pháp giải phẫu. Kết quả cấy truyền phôi giải phẫu đạt 68% có
chửa và có trên 100% bê ra đời so với số cái được cấy phôi (bảng 1).
Theo Ozil (1983), việc cấy 1/2 phôi / một cái nhận, đạt kết quả có
chửa thấp hơn là cấy cả hai nửa phôi.
Kết quả của Heyman (1985): sau khi cấy 1/2 phôi (hay cả hai nửa
phôi) và có so sánh với phôi tươi hay phôi đông lạnh, nhận thấy tỷ lệ có
chửa là 36,3% trong trường hợp cấy 1/2 phôi, còn có chửa 68,7% khi cấy cả
hai nửa phôi.
Gần đây, Heyman et al (1987) đã chứng minh ảnh hưởng dương tính
đến tế bào của phôi (4 ngày được nuôi trong môi trường nuôi cấy).
Bảng 1.? Sự phát triển của hai nửa phôi được cắt ở ngày thứ 6,? 7 và
8 sau khi cấy truyền cho bò nhận phôi
Ngày 6 7 8 T
ổng
cộng
Số phôi được cắt làm đôi 7 7 11 25

Số đôi nửa phôi 7 7 11 25
Số bò nhận phôi đư
ợc cấy
hai nửa phôi
7 7 11 25
Số bò có ch
ửa (% ở 45
ngày)
5
(71,4)
4
(57,1)
8
(72,74)
17
(68)
Số bò có chửa 2 thai 3 3 4 10
(58,8)
Số bê đẻ ra 8 7 12 27
Bảng 2.? Kết quả cấy 1/2 phôi sau khi cắt ở bò
Phôi cấy

Cái
nhận
Ch
ửa 21
ngày
Ch
ửa 90
ngày

S
ố phôi
sống
Đông
lạnh
20 10?
(50,0%)
4?
(20,0%)
4/20?
(20%)
Tươi 11 6?
(54,5%)
4
(32,3%)
4/11?
(36,3%)
Đông
lạnh
36 24?
(66,6%)
17?
(47,2%)
17/36?
(47,2%)
Tươi 45 32?
(71,0%)
26?
(57,7%)
26/45?

(37,7%)
Đông
lạnh
22 17?
(77,2%)
14?
(63,6%)
21/44?
(47,7%)
Tươi 48 38?
(79,1%)
33?
(68,7%)
47/96?
(38,9%)
Về khả năng đông lạnh các phôi đã được cắt đôi: nhiều nhà khoa học
(Lehn-Jensen và Rall, 1983; Kicard et al., 1984; Nicmann et al.; 1986;
Chesne et al., 1978; Takeda et al., 1987) đã nghiên cứu và đã có những ý
kiến khác nhau về những bước chuẩn bị đông lạnh các nửa phôi (đưa về vị
trí màng trong suốt, bao vây bằng a-ga ) và đều cho rằng tất cả những phôi
không nguyên vẹn đều cho kết quả kém, cần tiếp tục nghiên cứu thêm ở lĩnh
vực này.
Ngày nay cắt phôi và sử dụng các phôi cắt đã trở thành công việc bình
thường ở các nước chăn nuôi? phát triển, đặc biệt ở các nước áp dụng công
nghệ phôi trong chăn nuôi bò sữa hoặc bò thịt.
4 Một số nhân tố ảnh hưởng
4.1. Tuổi và chất lượng phôi
Tuổi phôi liên quan đến tỷ lệ sống sau khi cắt, và như vậy, liên quan
đến tỷ lệ có chửa sau khi cấy. Tỷ lệ bò có chửa sau khi cấy phôi cắt tăng từ
33% ở phôi ngày thứ 6 đến 57% ở phôi ngày thứ 8 (Williams, 1984). Một số

nghiên cứu khác cho rằng tuổi phôi càng cao (nhưng không vượt quá 10
ngày), tỷ lệ có chửa sau khi cấy ở phôi được cắt càng lớn.
Theo nhiều tác giả, phôi ở giai đoạn 5,? 6,? 7 ngày sau khi thụ tinh là
tốt nhất cho việc cắt phôi. Cắt phôi ở giai đoạn phôi dâu già (cuối của phôi
dâu) hoặc đầu phôi nang, khi khối tế bào đủ lớn và tế bào chưa biệt hoá, sẽ
cho kết quả cao hơn. Tất nhiên phôi phải từ loại B (tốt) trở lên, tốt nhất phôi
loại A (rất tốt), không sử dụng phôi loại C (trung bình) để cắt. Khi cắt phôi ở
giai đoạn phôi dâu, chỉ việc chia 2 khối mầm phôi. Khi cắt chia phôi ở giai
đoạn phôi nang, cần chú ý: ngoài phân chia mầm phôi, phần lá nuôi
(trophoblast) cũng chia 2. Khi cắt phôi ở giai đoạn muộn hơn, tế bào phôi đã
biệt hoá hình thành các lá phôi, xác suất cho một cơ thể trọn vẹn khó được
bảo đảm, vì vậy phôi đã ngoài 10 ngày tuổi không sử dụng để cắt, chia.
4.2. ảnh hưởng của màng trong suốt? (Zona pellucida, ZP)
ZP ở động vật có vú có cấu trúc dịch protein bao quanh trứng. Chức
năng của ZP: bảo vệ phôi chống lại sự va chạm của môi trường, kiểm soát áp
suất thẩm thấu và trao đổi dinh dưỡng giữa môi trường và phôi. Các thao tác
cắt phôi được tiến hành trong phòng thí nghiệm bằng vi phẫu thuật không
làm tổn thương đến các tế bào bên trong và bảo vệ cho ZP không bị vỡ.
Một chức năng khác của ZP là giữ cho các tế bào phôi trong quá trình
phân chia ở giai đoạn đầu tập trung với nhau, làm cho khối tế bào phôi có sự
liên kết chặt chẽ. Sự liên kết đó cho phép phân biệt giữa nhóm tế bào ở trong
cùng với khối tế bà ở ngoài. Nếu vị trí của các tế bào không xảy ra như vậy,
không có sự khác nhau trong các giai đoạn, phôi có thể không sống được
(Seidel, 1982).
Nếu phôi trong thời kỳ đầu tiên không có ZP, nhóm tế bào hình que
dính với nhóm tế bào nang lông ở ống dẫn trứng, làm cho phôi không phát
triển (Modlinski, 1970) vì khả năng phát triển của phôi sau khi cấy truyền
phụ thuộc rất nhiều vào sự hoàn hảo của ZP.
Ozil (1983) và Seidel (1983) cho rằng những phôi có tuổi cao (hơn 6
ngày) không đòi hỏi có ZP, những phôi lúc đó có khả năng hoạt động như

những đơn vị sinh học của những tế bào cá thể. Nếu tiến hành nghiên cứu
phôi trước giai đoạn các tế bào liên kết, cần phải để các mảnh tế bào phôi
trong ZP, hay được bao quanh bằng thạch a-ga. Trong khi đó, nếu chúng ta
sử dụng những phôi có tuổi lớn đã có sự liên kết thì không cần thiết. Theo
nhiều tác gia, ZP bao quanh trứng và phôi ở động vật có vú đóng một vai trò
như hàng rào bảo vệ chống lại sự xâm nhập của các virus (Bowen, 1979;
Willadsen, 1979-1980; Ozil et al., 1982; Seidel, 1982; Lambeth et al., 1983;
Ozil, 1983; Srenan, 1983; Baker, 1985).
Theo Elizabeth Singh et al. (1982, 1983, 1987), virus gây bệnh lưỡi
xanh (BTV) và virus gây bệnh ỉa chảy cho bò (BVDV) không phân lập được
khi nuôi cấy phôi của những bò cho phôi có huyết thanh dương tính với
những virus trên trong thời gian 24-28 giờ. Ông kết luận rằng virus không có
khả năng đi qua ZP.
Theo Voelkel et al. (1983), vi khuẩn gây sẩy thai truyền nhiễm không
gây bệnh cho bò nhận phôi khi cấy truyền phôi ở bò bị nhiễm bệnh. Nhiều
nghiên cứu cho thấy tầm quan trọng của ZP với giai đoạn phát triển của phôi
bò (Trounson et al., 1976; Willadsen, 1980; Lehn - Jensen, 1983; de Armas,
1985).
Theo Lehn-Jensen và Willadsen (1983), kết quả đông lạnh sẽ tốt hơn
đối với các phôi đã được cắt hai hay bốn, nếu sử dụng phôi 6-7 ngày còn
nguyên vẹn ZP và được bao bọc bằng a-ga trước khi cho đông lạnh.
4.3. ảnh hưởng của việc nuôi cấy sau khi cắt
Mục đích của việc nuôi cấy sau khi phôi bị cắt là giúp phôi nhanh ổn
định và bình phục lại vết cắt. Việc nuôi cấy các nửa phôi sau khi cắt là cần
thiết nhưng không nên quá 2-3 giờ sau khi cắt (Norio Saito, 1994) hoặc
không quá 10 giờ (Vlahov và cs., 1987). Tỷ lệ có chửa sau khi cấy sẽ giảm
đi cùng với sự tăng lên của thời gian nuôi cấy sau khi cắt? ở ngoài? cơ thể
(Armas và cs., 1992). Các công trình nghiên cứu gần đây đều thống nhất
rằng: Nếu dung dịch nuôi cấy được bổ sung một số tế bào tử cung hoặc tế
bào và dịch phân tiết của ống dẫn trứng, tỷ lệ có chửa của nửa phôi sẽ tăng

lên.
4.4. ảnh hưởng của sự đồng pha và số lượng thể vàng giữa bò cho và
bò nhận
Sau khi cấy các nửa phôi, không thấy có sự khác nhau về tỷ lệ có chửa
ở bò nhận có trạng thái sinh lý sinh dục khác tuổi phôi từ -1 ngày đến +1
ngày, nghĩa là bò nhận động dục sau hoặc trước 1 ngày hoặc động dục đồng
tuổi với bò cho phôi (Szell và Hudson, 1991). Tuy nhiên Maurer (1988) lại
thu được tỷ lệ có chửa ở bò nhận phôi động dục sau 1 ngày cao hơn bò nhận
phôi động dục trước 1 ngày.
Cũng như phôi nguyên vẹn, tỷ lệ có chửa sau khi cấy sẽ cao nếu thể
vàng bò nhận phôi phát triển và hoạt động tốt. Szell và Hudson (1991) đã
thu được tỷ lệ có chửa cao hơn, tỷ lệ sinh đôi cao hơn ở các nửa phôi được
cấy vào tử cung bò mẹ có hai thể vàng trở lên so với những bò nhận chỉ có 1
thể vàng. Điều này có lẽ liên quan đến hàm lượng cao hơn của progesteron
trong máu ở các bò có nhiều thể vàng hơn, hoặc do hoạt động phân tiết
progesteron cao hơn của thể vàng.
Ngoài các nhân tố chính kể trên, tỷ lệ có chửa của phôi sau khi cắt còn
chịu sự chi phối của một loạt yếu tố khác như: Thời tiết, khí hậu, vị trí cấy
phôi, vệ sinh các dụng cụ và môi trường, thao tác kỹ thuật, dung dịch nuôi
cấy, v.v
5. Dụng cụ và hoá chất
5.1. Dụng cụ
ă Kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại 100-300 lần.
ă Hệ thống điều khiển vi thao tác gồm hệ thống điều khiển dao cắt,
hệ thống này được gắn kết hợp với kính hiển vi.
ă Các loại ống hút, xơ-ranh, các loại đĩa petri kích thước khác
nhau.
ă Các micropipet để hút phôi và các cọng rạ khác nhau.
5.2. Dung dịch, hoá chất
ã?? Dung dịch để cắt phôi (Bisection medium), theo Her và Reed

(1991), là dung dịch Dulbecco?s Modified PBS có bổ sung 0,2M sucrose
không có huyết thanh thai bê hoặc BSA (Bovine Serum Albumin).
ã?? ?Dung dịch nuôi cấy phôi sau khi phôi đã cắt, các dung dịch đó là:
+ Han?sF
10
+ 10-20% FCS
+ TCM 199 + 5% FCS
+ Cr1aa + 5% FCS
+ Whitten?s medium + 20% FCS (Lucas-Hahn và Nieman, 1991)
Hướng sử dụng khác nhau của phôi sau khi cắt
1- Phôi chưa cắt

5- Cấy nửa phôi
đông
lạnh
2- Phôi sau khi cắt

6- Phôi bị loại thải
3- Có th
ể cấy chuyển hoặc
nuôi cấy phục vụ

7- Nuôi cấy, tiến h
ành
chia cắt lặp lại
4- Đem đông lạnh