Kỹ thuật chuyển gen cho động vật ppt

1
Kỹ thuật chuyển gen cho
động vật
I. KháI NIệM Về chuyển gen Cho động vật
1.1. Định nghĩa
Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đa một hay nhiều
gen lạ đ đợc thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế
bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào
chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp
nên các protein đặc trng dẫn tới việc xuất hiện các
đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.
đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen đợc
xem là thành công khi gen chuyển vào đợc tổ hợp vào
genom của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp
đợc duy trì ổn đinh qua các thế hệ con cháu
2
1.2.Lợc sử phát triển
1977 Gurdon chuyển ARNm và ADN vào
phôi Xenopus (ếch) và quan sát thấy sự biểu
hiện chức năng của chúng
1980 Brinster và cs nhận đợc kết quả
tơng tự ở chuột
1981 Wagner và cs đã cấy chuyển thành
công gen -globulin của thỏ vào phôi chuột
Từ 1985 nhiều tác giả thành công trong tạo
thỏ, cừu, lợn, bò chuyển gen và các vật
nuôi chuyển gen tăng trởng nhanh đợc
ứ
ng
dụng

m
ạ
nh
m
ẽ
trong
n
ô
ng
nghi
ệ
p
1.3. mục đích chuyển gen
Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi cấy để sản
xuất protein in tái tổ hợp
Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các
sản phẩm sữa, thịt, lông
Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái tổ hợp
Tạo vật nuôi chuyển gen knock out làm mô hình nghiên
cứu về y sinh học các bệnh di truyền
Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền
(của ngời)
3
1.4. Đối tợng chuyển gen
Hầu hết các phơng pháp chuyển gen đợc phát
triển trên mô hình chuột và sau đó chúng đợc ứng
dụng trên gia súc, gia cầm
Việc chuyển gen thờng đợc thao tác trên:
- Tế bào trứng đ thụ tinh
- Tế bào tinh trùng

- Mô phôi ở giai đoạn sớm
- Tế bào gốc phôi
II.Các phơng pháp chuyển
gen vào tế bào động vật
Phơng pháp chuyển gen trực tiếp :
-Chuyển gen nhờ phốt phát canxi
-Chuyển gen nhờ xung điện
-Chuyển gen nhờ vi tiêm
-Chuyển gen nhờ liposom
Phơng pháp chuyển gen gián tiếp :
Chuyển gen nhờ virus
4
II.1.Các phơng pháp Chuyển gen
trực tiếp
1.Chuyển gen nhờ phosphat canxi
Kỹ thuật phosphat canxi để đa gen vào tế bào
động vật có vú lần đầu đợc Graham và Vander
Eb đề xuất năm 1973 và cho đến nay vẫn đợc áp
dụng rộng rãi.
Kỹ thuật này có thể sử dụng để đa DNA vào tế
bào động vật có vú với mục đích các test thể hiện
chuyển nạp hay biến nạp lâu dài.
1.Chuyển gen nhờ phosphat
canxi
Nguyên tắc:
Các DNA ngoại lai đợc trộn với CaCl2 sau đó
đợc chuyển vào một dung dịch chứa ion phosphat.
Một phức hợp đồng ngng kết (coprecipitate) giữa
canxi phosphat và DNA sẽ đợc hình thành.
Phức hợp này sẽ đợc các tế bào động vật có vú tiếp

nhận khi nuôi cấy thông qua thực bào , kết quả là
có thể tạo tế bào chuyển gen với sự thể hiện gen
ngoại lai trong tế bào.
Các DNA chuyển nạp mang một gen chỉ thị chọn
lọc (nh gen aminoglycoside phosphotransferase)
để giúp cho việc thanh lọc các tế bào không tiếp
nhận DNA.
5
6
2.Chuyển gen nhờ xung điện
Nguyên tắc:
Khi trong điện trờng có một mật độ tế bào cao
và tạo ra một xung điện (điện thế cao trong một
thời gian rất ngắn), lúc đó trên màng tế bào
xuất hiện các lỗ nhỏ.
Qua các lỗ này, DNA có thể đi sâu vào trong tế
bào và ở một số tế bào chúng có thể tơng tác
với genome của tế bào tạo tế bào chuyển gen.
2.Chuyển gen nhờ xung điện
(tiếp)
Máy tạo xung điện thờng đợc thiết lập một công
suất ổn định và cả thời gian gây xung ổn định với
các điện thế biến đổi từ 500-1500 v/cm.
Đối với hầu hết tế bào, sự thiết lập nh vậy đảm
bảo 20-50% số tế bào còn sống sau khi thực nghiệm
chuyển DNA.
Quá trình chuyển gen nhờ xung điện đợc thực
hiện ở nhiệt độ phòng còn các tế bào đợc giữ liên
tục trong đá để kéo dài thời gian mở lỗ các tế bào.
7

8
M¸y t¹o xung ®iÖn
9
2.Chuy
ể
n
gen
nhờ
xung
điện
(tiếp)
Chú ý
Các DNA đã đợc duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gen
cao hơn các DNA ở dạng siêu xoắn, do ở dạng thẳng
chúng dễ tơng tác hơn vào bộ genome của tế bào đích.
Để chuyển gen bằng kĩ thuật này cần sử dụng huyền
phù tế bào đơn, tránh sử dụng các tế bào dính lại với
nhau vì các khối tế bào này hay dính vào thành bình
làm giảm hiệu quả chuyển nạp.
Nói chung, để chuyển gen bằng phơng pháp này cần
sử dụng nhiều DNA cũng nh tế bào hơn so với phơng
pháp hoá học.
Mỗi loại tế bào có các thông số kỹ thuật tối u khác
nhau khi sử dụng kĩ thuật này.
3.Chuyển gen nhờ vi tiêm
Nguyên tắc:
Tiêm trực tiếp ADN ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ dụng cụ
vi tiêm với kim tiêm rất mảnh.
Phơng pháp này cho kết quả rất cao nhng số lợng tế bào đợc xử
lý nhỏ do phải thao tác trên từng tế bào.

Phơng pháp này thờng dùng để đa ADN vào hợp tử hoặc các tế
bào phôi sớm.
Việc chuyển gen vào tế bào động vật tốt nhất là chuyển vào một
trong những nhân con của trứng đ thụ tinh trớc khi các nhân con
kết hợp với nhau để tạo ra hợp tử lỡng bội.
Bằng cách chuyển gen vào giai đoạn tiền nhân, gen chuyển vào sẽ
đợc truyền cho các thế hệ phôi tiếp theo và có thể di truyền cho con
cháu.
10
3.chuyển gen bằng vi tiêm (tiếp)
Các bớc tiến hành:
Thiết kế cấu trúc gen chuyển
Gây siêu bài non ở con cái, thu nhận hợp tử
sau khi giao phối
Chuẩn bị dung dịch ADN cho vi tiêm
Chuẩn bị tế bào hợp tử
Vi tiêm ADN vào tiền nhân
Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận
Kiểm tra gen chuyển ở con non. Lai tạo để
củng cố di truyền
11
ThiÕt bÞ chuyÓn gen b»ng vi tiªm
12
4.Chuyển gen nhờ Liposom
4.1.Nguyên lý thiết kế vectơ chuyển gen liposom
Phơng pháp dựa trên sự tơng tác ion của DNA và thể liposome
tạo ra một thể phức hợp, phức hợp này có thể phóng thích các DNA
chức năng vào tế bào nuôi cấy
Liposom cấu tạo từ các lớp màng lipid tạo dạng túi, bên trong chứa
nớc, kích thớc khoảng 10 nm đến 1000 nm. Liposom thờng có

một lớp lipid mang điện tích dơng (lipofecamin) và các phân tử
lipid trung tính nên liposom có điện tích dơng (+) vì vậy nó có thể
kết hợp với các phân tử, hoặc các chất mang điện tích âm (-) tạo
thành phức hợp ổn định.
Thiết kế tạo vectơ liposom thực chất là tạo các phức hợp liposom -
DNA. Phân tử DNA có điện tích âm (-) có thể kết hợp với liposom
tạo nên các phức hợp ổn định, đợc sử dụng làm vectơ chuyển gen.
13
S¬ ®å cÊu tróc vµ
ho¹t ®éng cña
vec t¬ liposom
14
4.Chuyển gen nhờ Liposom
(tiếp)
4.2.Cơ chế hoạt động của vectơ liposom
Vectơ liposom có khả năng tiếp xúc với màng tế bào
của các tế bào đích và chui qua màng tế bào, khi đó lớp
các phân tử lipid bị phân huỷ làm cho các gen mục tiêu
đợc đa vào trong tế bào.
Gen mục tiêu có thể đợc đa vào trong nhân, tồn tại
trong nhân nh những đơn vị gen độc lập. Trong nhân
các gen mục tiêu có thể có quá trình tái tổ hợp làm cho
gen này đợc gắn vào bộ gen của tế bào chủ tạo tế bào
đợc chuyển gen.
ii.2. chuyển gen gián tiếp nhờ virus
Nguyên lý chung
Khi xâm nhiễm vào tế bào, virus có khả năng
chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ.
Một số nhóm virus có thể gắn bộ gen hoặc một
số gen của chúng vào bộ gen tế bào chủ, tạo

thành một thể thống nhất.
Các gen virus gắn với bộ gen của tế bào chủ có
thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia
của tế bào chủ, tạo nên các provirus.
15
ii.2. chuyển gen gián tiếp nhờ
virus
(tiếp)
Khi trong cơ thể hay từ ngoài môi trờng có
một tác nhân nào đó không bình thờng tác
động vào provirus, làm cho bộ gen virus tách
khỏi bộ gen tế bào chủ, thực hiện quá trình tái
bản gen virus và các thành phần của virus
trong tế bào chủ.
Quá trình lắp ghép các thành phần của virus
tạo nên các virion, các virion hoạt động tạo nên
vô số virus mới phá vỡ tế bào chủ, tiếp tục xâm
nhiễm các tế bào khác
Chu trình
lây nhiễm
của virus
16
ii.2. chuyển gen gián tiếp nhờ
virus
(tiếp)
Trên cơ sở hiểu biết đặc điểm và cơ chế xâm nhiễm
của virus vào tế bào chủ, con ngời đ tìm ra các biện
pháp loại bỏ hoặc gây bất hoạt các gen có hại của
virus, nhng vẫn giữ lại các gen virus giúp cho sự xâm
nhiễm và gắn gen vào bộ gen của tế bào, tạo nên các

vectơ chuyển gen.
Vectơ chuyển gen hình thành từ những virus biến đổi
gen nh trên đợc gọi là vectơ chuyển gen có bản chất
virus. Trong các vectơ này, gen ngoại lai cần chuyển
nạp đợc thay thế vào vị trí một số gen của virus,
nhng vẫn đảm bảo để virus có khả năng xâm nhiễm
và chuyển gen vào tế bào, hoặc gắn gen ngoại lai với
bộ gen của tế bào đích nhằm thực hiện chức năng
chuyển gen.
ii.2. chuyển gen gián tiếp nhờ
virus
(tiếp)
Vectơ virus gồm một số loại chủ yếu:
+Vectơ retrovirus (ARN)
+Vectơ adenovirus (ADN sợi kép)
+Vectơ adeno-associated virus (ADN sợi đơn)
+ Vectơ herpes simplex virus (ADN sợi kép)
+ Vectơ baculovirus (ADN vòng kép)

17
1.chuyển gen nhờ Vectơ retrovirus
1.1. Đặc điểm cấu tạo và di truyền của retrovirus
Retrovirus là loại virus RNA có khả năng xâm nhiễm tế bào
chủ cao và có khả năng gắn bộ gen virus với bộ gen tế bào
chủ. Đó là cơ sở thuận lợi để thiết kế các vectơ chuyển gen
hiệu quả.
Cấu trúc retrovirus gồm:
Phần vỏ có 3 lớp:lớp vỏ ngoài cùng là glycoprotein, tiếp đến
lớp vỏ kép lipid, lớp trong cùng là vỏ capsid.
Bên trong lớp vỏ capsid là phần lõi RNA gồm 2 sợi đồng

dạng và các loại enzym của virus:
Enzym phiên mã ngợc (reverse transcriptase) giúp virus
chuyển bộ gen RNA sang dạng cDNA mạch kép.
Enzym cài xen (integrase) giúp cho quá trình cài xen bộ gen
của virus với bộ gen của tế bào chủ ở những điểm tơng
đồng.
Retrovirus
life cycle
18
Sơ đồ cấu trúc của Retrovirus



Bộ gen retrovirus gồm hai sợi RNA có cấu trúc và kích trớc
giống nhau (7 kb - 11 kb). Mỗi sợi RNA chứa 3 nhóm gen
chủ yếu: gag, pol, env. Cụ thể:
-Gen gag m hoá protein lõi trong thành phần cấu trúc hạt
virion
-Gen pol m hoá enzyme phiên m ngợc và các enzyme cần
thiết cho hoạt động của virus
-Gen env m hoá protein trong cấu trúc các lớp vỏ của virus.
Hai đầu mỗi sợi RNA có một trình tự lặp dài tận cùng - LTR
(long terminal repeats) mang một số trình tự cần thiết cho
quá trình biểu hiện gen của virus và một trình tự đặc hiệu
giúp cho quá trình gắn bộ gen của virus với bộ gen của tế
bào chủ.
Tại đầu 5

-LTR có một trình tự giúp quá trình đóng gói bộ
gen của virus gọi là trình tự

(psi)
19
1.1.chuy
ể
n gen nhờ Vect
ơ
retrovirus
(tiếp)
1.2.Nguyên lý thiết kế vectơ retrovirus
Thiết kế vectơ retrovirus là một quá trình phức tạp, gồm nhiều
giai đoạn khác nhau:
Loại bỏ các gen chủ yếu của virus gag, pol, env và thay thế
bằng gen cần chuyển nạp (gen mục tiêu) tạo thành vectơ bộ
gen (vector genome).
Xử lý cắt riêng các gen gag, pol và env của retrovirus nhng
vẫn đảm bảo chức năng các gen.
Đa vectơ bộ gen cùng với các gen gag, pol và env đ xử lý
của virus vào một tế bào đặc hiệu là tế bào đóng gói.
Trong tế bào đóng gói, các gen virus hoạt động tổng hợp các
thành phần vỏ của virus, các thành phần vỏ này kết hợp với
vectơ mang gen mục tiêu hình thành nên vectơ retrovirus.
Retrovirus vector
Retrovirus Packing Kit Ampho ,Company :Takara Mirus Bio, Price$252.00
This kit is designed to obtain transient high-titer recombinant retrovirus particles by co-
transfection of retrovirus vector plasmid with target gene and two unique vectors for
packaging, using calcium phosphate method. This kit contains a gag-pol expression
vector and an amphotropic env expression vector. The recombinant virus obtained using
this kit are able to infect most mammalian cells.
20

1.chuy
ể
n gen nhờ Vect
ơ
retrovirus
(tiếp)
1.3.Cơ chế hoạt động của vectơ retrovirus
Vectơ retrovirus đợc đa đến các tế bào đích bằng
nhiều kỹ thuật khác nhau. Khi tiếp cận tế bào đích ở
những thụ thể (receiptor), vectơ retrovirus đợc đa vào
bên trong tế bào. Trong tế bào chất của tế bào đích các
thành phần vỏ của vectơ bị phân huỷ, phần lõi RNA
đợc giải phóng.
Enzym phiên mã ngợc của virus xúc tác quá trình
chuyển RNA sợi đơn thành cDNA sợi kép. cDNA qua lỗ
màng nhân vào trong nhân tế bào đích, nhờ enzym cài
xencủa virus làm cho cDNA mạch kép đợc gắn xen vào
bộ gen ở những điểm tơng đồng. Gen mục tiêu cũng
đồng thời đợc gắn vào bộ gen của tế bào đích, phiên mã
và dịch mã tạo nên các protein sản phẩm của gen mục
tiêu trong tế bào đích.
Sơ đồ hoạt động của vec tơ retrovirus
Tế bào đóng gói
Tế bào đích
21
2.chuyển gen nhờ Vectơ
baculovirus
2.1.Cấu trúc baculovirus
Baculovirus có bộ gen ADN vòng, chuỗi kép lớn (từ 88 tới
200Kbp). Bộ gen này đợc liên kết với protein kiềm- giầu

arginin (6,5KDa.) nằm bên trong nucleocapsid chứa protein
capsid (39KDa.) Kích thớc của bộ gen virus xác định theo
kích thớc của nucleocapsid (chiều dài khoảng 200 400nm,
chiều rộng khoảng 36nm).
Nucleocapsid đợc gói trong vỏ lipoprotein để hình thành
tiểu phần virus hay virion.
Các virion đợc vùi trong nền polyhedron. Polyhedron gồm
nhiều protein đơn giản (polyhedrin) .
Polyhedra (hạt baculovirus) là những cấu trúc lớn có kích
thứơc 1 - 15à
àà
àm với vỏ polysacarit cứng bọc ngoài để bảo vệ.
A) Baculovirus particles, or polyhedra; B) Cross-section of a
polyhedron; C) Diagram of polyhedron cross-section. Electron
micrographs (A&B) by Jean Adams, graphic â by V. D'Amico.
22
Baculovirus Polyhedra trong tÕ bµo
23
2.2. Sự nhân lên của baculovirus in vivo
Giai đoạn ấu trùng của côn trùng rất dễ bị nhiễm Baculovirus qua
đờng tiêu hóa. Polyhedra đợc hoà tan trong môi trờng kiềm ở
ruột, giải phóng ra những virion .
Vỏ lipoprotein của virion hoà vào màng bào tơng của tế bào thành
ruột và giải phóng nucleocapsid vào trong bào tơng.
Nucleocapsid vận chuyển ADN virus vào nhân tế bào.
Baculovirus sản sinh ra 2 dang cấu trúc khác hẳn nhau trong 2 giai
đoạn của chu kỳ nhân virus:
Tế bào nhiễm vòng một tạo virus xuất ngoại (extracellular virus
ECV) đợc giải phóng vào haemolymph (huyết tơng) để gây
nhiễm cho các tế bào khác trong chính cơ thể ấu trùng.

Các tế bào bị nhiễm vòng hai của sự nhân virus trong ấu trùng
cũng sản xuất ECV nhng có thêm tiểu phần virus (virion) trong
polyhedra. Sự tích tụ polyhedra trong côn trùng đợc tiến hành cho
đến khi vật chủ biến thành một túi virus. Giai đoạn cuối này, ấu
trùng hoá lỏng và giải phóng polyhedra đi gây nhiễm cho côn
trùng khác
24
2.3.Thiết kế vectơ baculovirus
Bộ gen của baculovirus rất lớn nên rất khó gài trực
tiếp ADN ngoại lai
Sử dụng plasmid (pUC) làm vectơ vận chuyển gen
ngoại lai và có gài promoter polyhedrin, tạo vectơ
vận chuyển tái tổ hợp
Đồng chuyển nhiễm vào tế bào côn trùng (sâu
khoang-Spodoptera frugiperda) vectơ vận chuyển tái
tổ hợp và ADN cải biến của baculovirus (
Autographa
Autographa
californica
californica
nuclear
nuclear
polyhedrosis
polyhedrosis
virus
virus
-
-
AcNPV
AcNPV

)
) và
thông qua sự tái tổ hợp đồng nhất trong tế bào sâu
tạo đợc vectơ virus tái tổ hợp mang gen ngoại lai.
25
S
S
ơ
ơ
đ
đ
ồ
ồ
s
s
ả
ả
n
n
xuất
xuất
protein
protein
t
t
á
á
i
i
t

t
ổ
ổ
h
h
ợ
ợ
p
p
khi
khi
s
s
ử
ử
dụng
dụng
BaculoGold
BaculoGold
-
-
vect
vect
ơ
ơ
AcNPV
AcNPV
t
t
á

á
i
i
t
t
ổ
ổ
h
h
ợ
ợ
p
p
(
(
BD Biosciences
BD Biosciences
Pharmingen
Pharmingen )
iii.Kỹ thuật chuyển gen trong cải tiến giống
động vật
1. Các hớng nghiên cứu tạo vật nuôi chuyển gen:
Tăng trởng: làm tăng tốc độ sinh trởng và chất lợng
thành phần cơ thể động vật thông qua chuyển các gen điều
hoà hocmon tăng trởng
Kháng bệnh: Xác định và chuyển các gen có thể tác động đến
tính kháng bệnh ở vật nuôi (gen kháng bệnh chuyên biệt, gen
receptor tế bào T, gen mã hoá lymphokine, )
Cải tiến chất lợng, thành phần sản phẩm: chuyển gen làm
giảm hàm lợng lactose trong sữa, tăng hàm lợng cystein để

gia tăng sự phát triển lông
Gene-farming: dùng động vật nh hệ thống cải biến sinh học
để sản xuất các protein đặc biệt