Nghiên cứu tỉ lệ đột biến gen P53 tại vị trí 249ser và nồng độ protein P53 ở một số thể bệnh do nhiễm vi rut viêm gan B

ĐẶT VẤN ĐỀ
Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm virut viêm gan B (HBV) an
toàn và hiệu quả nhưng bệnh do nhiễm HBV vẫn đang là một vấn đề
thách thức của y tế thế giới và trong nước. Ước tính hàng năm trên thế
giới có khoảng 600.000 đến 1 triệu người chết do HBV. Việt Nam là một
trong những nước có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Theo thống kê có
10-20% trong quần thể bình thường nhiễm HBV và có từ 20 đến 40%
người nhiễm HIV có HBV (+). Ước tính đến năm 2025 nước ta có khoảng
8 triệu người nhiễm HBV, 58000 bệnh nhân xơ gan (XG), 25000 bệnh
nhân ung thư gan (UTG) và có hơn 40000 người chết do nhiễm HBV.
Phần lớn các bệnh nhân UTG đều được phát hiện muộn, khi
khối u đã hình thành, không còn khả năng cứu chữa. Do đó, việc phát
hiện sớm UTG đang là một đòi hỏi bức thiết hiện nay. Thực vậy, hiện
nay chẩn đoán UTG chủ yếu dựa vào: khám xét lâm sàng, siêu âm,
chụp cắt lớp vi tính và xét nghiệm AFP. Nhưng kết quả của nhiều
nghiên cứu cho thấy ngay cả khi lấy giá trị ngưỡng của AFP là > 600
ng/ml thì vẫn có hơn 40% bệnh nhân UTG không được chẩn đoán.
Vì vậy, các dấu ấn phân tử là một trong những mục tiêu tìm
hiểu được các nhà khoa học quan tâm hiện nay. Trong đó, đột biến
các gen của HBV như HBx, Precore, Pre S , hay các gen của người
bệnh đã và đang là những dấu ấn được nghiên cứu nhiều nhất.
UTG là một bệnh được sinh ra do biến đổi gen qua nhiều giai
đoạn. Trong số các gen được nghiên cứu thì gen TP53 là được quan
tâm nhất. Gen này mã hóa cho protein P53 có chức năng điều hoà
kiểm soát sự phát triển tế bào và ức chế sự hình thành u bằng con
đường thúc đẩy tế bào chết theo chương trình và khả năng làm dừng
1
sự phân chia của tế bào. Từ trước tới nay người ta chủ yếu quan tâm
gen TP53 trong trường hợp UTG nhiễm Aflatoxin. Tuy nhiên, gần
đây có nhiều bằng chứng cho thấy đột biến gen TP53 có liên quan
chặt chẽ với nhiễm HBV trong sinh bệnh học UTG. Kết quả nghiên

cứu cho thấy khi bệnh nhân vừa nhiễm HBV vừa mang gen TP53 đột
biến điểm 249
ser
thì nguy cơ tiến triển thành UTG là 399 lần.
Ở Việt nam có một số tác giả đã nghiên cứu đột biến gen TP53
trên 1 số bệnh ung thư, nhưng các nghiên cứu về đột biến gen TP53
trên các bệnh do nhiễm HBV còn rất ít.
Vì những lý do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài "Nghiên
cứu tỉ lệ đột biến gen TP53 tại vị trí 249
ser
và nồng độ protein P53 ở
một số thể bệnh do nhiễm vi rut viêm gan B" nhằm các mục tiêu sau:
1. Xác định tỉ lệ đột biến gen TP53 tại vị trí 249
ser
và mối liên
quan của nó với một số thể bệnh do nhiễm virut viêm gan B.
2. Định lượng nồng độ protein P53 và tìm hiểu mối liên quan
của nó với một số thể bệnh do nhiễm virut viêm gan B
Giới thiệu luận án:
* Cấu trúc luận án: Luận án có 107 trang, gồm các phần: Đặt
vấn đề 2 trang; chương 1: Tổng quan: 35 trang; chương 2: Đối tượng
và phương pháp nghiên cứu 20 trang; chương 3: Kết quả nghiên cứu
25 trang; chương 4: Bàn luận 23 trang; Kết luận 1 trang; Kiến nghị 1
trang; có 19 bảng; 24 biểu đồ; 21 hình. Có 149 tài liệu tham khảo;
Tiếng Việt 38, Tiếng Anh 111; phần phụ lục có danh sách bệnh nhân
và mẫu phiếu theo dõi bệnh nhân.
2
Đóng góp mới của luận án:
1. Là công trình đầu tiên nghiên cứu về đột biến gen TP53 trên
các nhóm bệnh do nhiễm HBV (NMVR, VGM, XG, UTG) bằng

phương pháp PCR - RFLP và khẳng định lại kết quả bằng giải trình
tự gen.
2. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến gen TP53 tương
đối thấp ở các nhóm, nhưng có thể liên quan đến tiến triển ung thư
gan trên bệnh nhân nhiễm HBV.
3. Nồng độ protein P53 trong huyết tương khác nhau ở các thể
bệnh do nhiễm HBV, và thấp nhất ở nhóm UTG và VGC.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cấu trúc của vi rut viêm gan B
Trên sợi DNA có bốn đoạn gen tương ứng với bốn khung đọc
mở (KĐM - Open reading frame). Đây là các vùng được mã hóa để
tổng hợp ra các protein của vi rut.
- KĐM S: KĐM S gồm vùng S và pre-S. Vùng pre-s được chia
hai phần là pre-S1 và pre-S2. Đây là đoạn gen mã hóa tổng hợp các
protein bề mặt (HBsAg).
- KĐM C mã hóa tổng hợp protein lõi (HBcAg) và HBeAg.
- KĐM P mã hóa tổng hợp enzym DNA polymerase. Sản phẩm
của gen này là một enzym vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ
thuộc RNA lại xem như một enzym sao chép ngược (reverse
transcriptase) mã hóa tổng hợp chuỗi DNA mới từ sợi RNA tiến bộ
gen (pregenome).
- KĐM X: KĐM X mã hóa tổng hợp protein HBx. Protein
HBx có vai trò chuyển hóa (transactivation) trong quá trình sao chép
của vi rut. Vì vậy, protein HBx có vai trò quan trọng trong cơ chế
sinh ung thư ở các tế bào gan bị nhiễm.
HBx có thể truyền đạt thông tin trực tiếp hoặc gián tiếp cho
nhiều gen đích của tế bào, làm trung gian hay đối lập cho nhiều chức
3
năng khác nhau của tế bào như điều hòa chu trình tế bào, mã hóa

tổng hợp các phân tử kết dính, hoạt hóa các gen sinh ung thư hoặc
các gen ức chế ung thư của tế bào
1.2. Gen TP53 và đột biến gen TP53
1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen TP53
Gen TP53 nằm trên nhiễm sắc thể 17 ở đoạn cánh tay ngắn
17p13, đây là khu vực thường có các đột biến mất đoạn trên các
bệnh nhân ung thư.
Gen TP53 có kích thước 22000 bp, gồm 11 exon mã hoá cho
một RNA thông tin có kích thước 2.2 Kb. Quá trình dịch mã được bắt
đầu từ exon 2. Gen TP53 đã được nghiên cứu hơn 30 năm qua, nó là
một protein có trọng lượng phân tử khoảng 53 kDa, TP53 thường
được tìm thấy với nồng độ cao trong các tế bào ung thư. Khoảng một
thập kỷ đầu, TP53 được xem là một kháng nguyên ung thư với khả
năng biến đổi mạnh. Mãi tới những năm cuối của thập kỷ 80 của thế
kỷ trước người ta mới chứng minh được nó thực chất là một chất ức
chế khối u. Gen TP53 mã hóa tổng hợp protein P53 có nhiều chức
năng sinh học quan trọng: Điều hòa kiểm soát sự phát triển của tế
bào, cảm ứng cho quá trình chết theo chương trình của tế bào
(apoptosis), tham gia sửa chữa các thương tổn ADN bằng cách làm
ngừng chu kỳ phân bào ở G1/S và G2/M, do đó các tế bào có thời
gian sửa chữa thương tổn, các tế bào con sau khi phân bào sẽ bình
thường như tế bào mẹ trước khi bị thương tổn. Do các chức năng trên
nên gen TP53 được cho là gen ức chế quan trọng nhất trong hàng
chục gen ức chế ung thư khác nhau. Gen TP53 đột biến có thể làm
giảm tổng hợp protein P53 có chức năng sinh học bình thường. Như
vậy, khi gen TP53 đột biến sẽ kích hoạt sự hình thành các khối u.
1.2.2. Mối liên quan giữa TP53 với HBV
HBx là một gen nhỏ nhất của HBV, nhưng có vai trò rất quan
trọng trong sinh bệnh học nhiễm HBV, đặc biệt là trong cơ chế gây
ung thư gan. Nhiều nghiên cứu cho thấy gen HBx có khả năng liên

kết với TP53 dẫn đến làm mất chức năng của TP53, gây rối loạn chết
có chương trình và mất kiểm soát tăng sinh tế bào, cuối cùng là hình
thành các khối u.
4
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu là các bệnh nhân được chẩn đoán
viêm gan B cấp tính, viêm gan B mạn hoạt động, xơ gan và UTG có
HBsAg(+) được đến khám và điều trị tại Bệnh viện Trung ương
Quân đội 108 và 16 bệnh nhân viêm gan B cấp được điều trị tại Bệnh
viện Bạch Mai, trong thời gian từ tháng 11 năm 2007 đến tháng 4
năm 2010, và nhóm người mang virut viêm gan B mạn tính không
triệu chứng.
- Gồm 263 bệnh nhân chia thành 5 nhóm (5 thể bệnh) và 1
nhóm chứng
+ Nhóm 1 (NMVR): 53 người mang vi rut viêm gan B mạn
tính không triệu chứng.
+ Nhóm 2 (VGC): 31 bệnh nhân viêm gan B cấp tính
+ Nhóm 3 (VGM): 53 bệnh nhân viêm gan B mạn tính
+ Nhóm 4 (XG): 32 bệnh nhân xơ gan có HBsAg (+)
+ Nhóm 5 (UTG): 94 bệnh nhân UTG có HBsAg (+)
+ Nhóm chứng: 100 người khỏe mạnh
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn: Theo Dienstag J.L, (Harrison's 2007)
2.1.1.1 Viêm gan B cấp tính:
+ Lâm sàng khởi phát từ từ và diễn biến thành 2 giai đoạn rõ rệt là giai
đoạn tiền hoàng đản và giai đoạn hoàng đản.
+ Tiền sử: - Chưa có vàng da, vàng mắt trước khi mắc bệnh

+ Xét nghiệm: - HBsAg (+), Anti HBc IgM (+) và Anti HBc IgG (-)

- Enzyme gan (AST, ALT) tăng cao, từ 400 - 4000UI/ml hoặc hơn.
2.1.1.2 Viêm gan B mạn tính
+ LS: Bệnh nhân mệt mỏi, đau vùng gan…
+ HBsAg (+) > 6 tháng hoặc HBsAg (+) và anti HBcIgG(+)
5
+ HBV – DNA huyết thanh ≥ 10
5
copies/ml ở nhóm HBeAg(+)
hoặc HBV – DNA ≥ 10
4
copies/ml ở nhóm HBeAg (-)
+ Enzyme gan (AST, ALT) tăng liên tục hoặc từng đợt, ít nhất ≥ 2
lần giá trị bình thường, có thể từ 100 - 1000UI/ml.
+ Mô bệnh học: có hình ảnh viêm gan mạn hoạt động
2.1.1.3. Xơ gan có HBsAg (+)
Bệnh nhân xơ gan có đầy đủ hội chứng:
+ Hội chứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa:
+ Hội chứng suy chức năng gan:
+ Thay đổi ở gan: gan to chắc hoặc gan teo…
+ Xét nghiệm: HBsAg (+), Enzyme gan (AST, ALT) tăng nhẹ ít
khi đến 300UI/ml, Protein máu giảm, Albumin giảm, A/G <1, tỷ lệ
Prothrombin giảm,
2.1.1.4. UTG có HBsAg (+)
+ Lâm sàng: Mệt mỏi ăn uống kém, gầy sút cân nhanh
+ Xét nghiệm: Xét nghiệm huyết thanh học HBsAg (+),
AFP tăng cao, Bilirubin trực tiếp và gián tiếp có thể tăng, Enzyme
gan (AST, ALT) hoặc phosphataza kiềm tăng.
+ Siêu âm gan có khối khu trú hoặc tổn thương lan toả.
+ Chụp CT Scanner hoặc MRI xác định được vị trí, kích thước
của khối u.

+ Tế bào bệnh học: xác định có UTG và mức độ biệt hóa
kèm theo.
2.1.1.5. Người mang HBV mạn tính không triệu chứng
+ Lâm sàng: Hoàn toàn khoẻ mạnh, không có bất kỳ các triệu
chứng lâm sàng nào, tình cờ phát hiện có HBsAg (+), tiền sử chưa bị
viêm gan
+ Các xét nghiệm về chức năng gan trong giới hạn bình thường.
2.1.1.6. Nhóm chứng: Hoàn toàn khỏe mạnh không có triệu chứng viêm
gan, không mắc bệnh mạn tính. Xét nghiệm HBsAg(-), Anti HCV(-),
Anti HIV (-), tiền sử chưa bị viêm gan.
6
2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ
Loại trừ các bệnh nhân sau:
+ Trẻ em và phụ nữ có thai
+ Bệnh nhân có anti HIV (+), anti HCV (+).
+ Bênh nhân đã được điều trị bằng các thuốc kháng vi rut và
các thuốc điều biến miễn dịch, người nghiện rượu và ma túy.
+ Bệnh kết hợp: Viêm gan do thuốc, do hóa chất, viêm gan tự
miễn, Đái tháo đường, viêm đường mật…
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang có so sánh.
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Khám lâm sàng và xét nghiệm chọn các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn
của các nhóm nghiên cứu
2.2.2.Phương pháp nghiên cứu lâm sàng
- Mỗi bệnh nhân được đăng ký theo dõi vào phiếu theo dõi đã được
xây dựng có đầy đủ các chỉ tiêu về dịch tễ, lâm sàng và xét nghiệm.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu cận lâm sàng
- Tất cả bệnh nhân đều được lấy máu ngay trong tuần đầu nhập
viện. Các số liệu về huyết học, sinh hóa, miễn dịch được tiến hành

ngay trong ngày. Các mẫu máu để làm xét nghiệm HBV DNA, giải
trình tự gen TP53 được tách lấy huyết tương ngay sau khi mẫu đến
Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TWQĐ 108. Sau đó được lưu giữ
trong tủ lạnh sâu âm 80
0
C. Các bệnh nhân VGC được chẩn đoán và
điều trị ở Bệnh viện Bạch Mai được lấy máu chuyển đến khoa sinh
học phân tử Bệnh viện 108 làm xét nghiệm sinh học phân tử.
 Xét nghiệm sinh học phân tử: Thực hiện tại khoa Sinh học
phân tử Bệnh viện TƯQĐ 108:
+ HBV – DNA: Phương pháp Real time - PCR
+ Xác định đột biến gen TP53:
1. PCR – RFLP: Dùng Enzyme Hae III
2. Giải trình tự gen trên hệ thống phân tích trình tự tự động
CEQ 8800 (Beckman Coulter, Mỹ).
7
Trình tự mồi khuếch đại gen TP53 như sau:
P53 F1: 5’-CTTGCCACAGGTCTCCCCAA-3’,
P53 R1: 5’-AGGGGTCAGCGGCAAGCAGA-3’.
+ Phương pháp định lượng nồng độ protein P53:
Protein P53 được định lượng bằng bộ Kit ELISA (P53 Human
ELISA Kit) của hãng Abcam. Mã code ELISA: AB 46067, ngưỡng
phát hiện ≥ 1,5U/ml.
+ Xác định đột biến gen HBx:
Giải trình tự gen trên hệ thống phân tích trình tự tự động CEQ
8800 (Beckman Coulter, Mỹ).
Trình tự mồi được sử dụng giải trình tự gen HBx là:
HBV-1369 F: 5’-TTTCCATGGCTGCTAGGCTGTACT-3’
HBV-1961 R: 5’-AAGGCAAAAACGAGAGTAACTCC-3'
 Xét nghiệm miễn dịch: Tại khoa miễn dịch

 Xét nghiệm huyết học: Tại khoa huyết học
 Xét nghiệm sinh hóa: Tại khoa sinh hóa
 Siêu âm gan, CT Scanner gan, MRI: Tại khoa chẩn
đoán hình ảnh
 Mô bệnh học: Tại khoa giải phẫu bệnh
2.2.4. Nội dung nghiên cứu
2.2.4.1. Đặc điểm chung của 5 nhóm nghiên cứu
2.2.4.2. Xác định tỷ lệ đột biến gen TP53 ở 5 nhóm nghiên cứu
2.2.4.3. Định lượng nồng độ P53 trên các nhóm nghiên cứu
2.2.4.4. Đánh giá mối liên quan của đột biến gen TP53, nồng
độ protein P53 với các thể bệnh
2.3. Xử lý thống kê- Các số liệu được phân tích bằng thuật toán non -
parametric Mann - Whitney U-test, khi bình phương (χ
2
test), so sánh
không đối xứng T-test, so sánh 2 tỷ lệ, 2 số trung bình, tỷ suất chênh (OR),
mối tương quan (RR) bằng các phần mềm Statview version 4.5, chương
trình STATA.
8
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đặc điểm chung các nhóm nghiên cứu
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
Bảng 3.1: Đặc điểm về giới và tuổi của các nhóm bệnh nhân
nghiên cứu
Chỉ số
Nhóm
Nam
(n,%)
Nữ

(n,%)
Tuổi (năm)
SDX
±
NMVR (n=53) (1) 37(69,8) 16(30,2) 29,6±11,1
VGC (n=31) (2) 23(74,2) 8(25,8) 27,5±8,3
VGM (n=53) (3) 45(84,9) 8(15,1) 41,8±12,3
XG (n=32) (4) 24(75) 8(25) 54,5±14,6
UTG (n=94) (5) 83(88,3) 11(11,7) 55,1±13
Tổng (n =263) 212 (80,6) 51 (19,4)
p P1-5<0,05 4,5-1,2,3<0,05
Nhận xét: Tổng số có 212/263 bệnh nhân nam chiếm 80,6%,
51/263 bệnh nhân nữ chiếm 19,4%. Tuổi ở các nhóm có sự khác biệt,
trong đó tuổi cao nhất là nhóm UTG và xơ gan. Sự khác biệt về tuổi
của 2 nhóm này với các nhóm còn lại là có ý nghĩa thống kê
(p<0,01). Giữa 2 nhóm xơ gan và UTG không có sự khác biệt về
tuổi. Tuổi thấp nhất ở nhóm VGC.
9
3.1.2. Đặc điểm một số triệu chứng lâm sàng của các nhóm
nghiên cứu
Bảng 3.2: Đặc điểm một số triệu chứng lâm sàng của các nhóm
nghiên cứu
Triệu chứng
VGC
n=31
VGM
n=53
XG
n=32
UTG

n=94
Mệt mỏi (n,%) 31 (100) 30 (56,6) 32 (100) 82 (87,2)
Đau vùng gan (n,%) 8 (26,6) 2 (3,7) 5 (15,6) 76 (80,8)
Sốt (n,%) 3 (9,67) 0 (0) 1 (3,1) 5 (5,3)
Sút cân (n,%) 1 (3,22) 1 (1,9) 6 (18,75) 65 (69,14)
RLTH (n,%) 5 (16,1) 5 (9,4) 10 (31,25) 25 (26,59)
Gan to (n,%) 25 (80,6) 35 (66,03) 2 (6,25) 32 (34,04)
Vàng da (n,%) 20 (64,5) 6 (11,32) 28 (87,5) 23 (14,8)
Sao mạch (n,%) 0 (0) 9 (17) 20 (62,5) 29 (30,8)
Không triệu chứng
(n,%)
0 (0) 7 (13,2) 0 (0) 3 (3,19)
Nhận xét: Các triệu chứng lâm sàng thường gặp của viêm gan
cấp tính là mệt mỏi, gan to, vàng da, đau tức vùng gan, rối loạn tiêu
hóa; trong khi đó các triệu chứng thường gặp của viêm gan mạn là
gan to, mệt mỏi, sao mạch; của xơ gan là mệt mỏi, sao mạch, vàng
da, rối loạn tiêu hóa; của UTG là mệt mỏi, đau vùng gan, sút cân, gan
to và sao mạch.
Có 7 bệnh nhân VGM (13,2%) và 3 bệnh nhân UTG
(3,19%) không có triệu chứng lâm sàng, tình cờ phát hiện khi
kiểm tra sức khỏe.
10
3.1.3. Đặc điểm một số xét nghiệm cận lâm sàng của các nhóm
nghiên cứu
Bảng 3.3: So sánh một số chỉ số huyết học và miễn dịch thông
thường giữa các nhóm
Chỉ số

Nhóm
HBeAg(+)

(n,%)
HBeAg(-)
(n,%)
TC (G/L)
SDX
±
Tỉ lệ
Prothrombin
SDX
±
NMVR
(n=53) (1)
28(52,8) 25(47,2)
293,7 ± 63
93,5 ± 9,7
VGC
(n=31) (2)
18(58) 13(42)
167,5 ± 35
92 ± 7,7
VGM
(n=53) (3)
31(58,5) 22(41,5)
212,7 ± 73
91,5 ± 12,5
XG
(n=32) (4)
16(50) 16(50)
121,4 ± 15
78,4 ± 20,2

UTG
(n=94) (5)
54(57,4) 40(42,6)
188,1 ± 97
86,7 ± 15,5
p > 0,05 4-1,2,3,5<0,01 4-1,2,3,5<0,05
Nhận xét: Không có khác biệt giữa các nhóm nghiên cứu về
tình trạng mang kháng nguyên e. Tiểu cầu ở nhóm XG và VGC
thấp hơn có ý nghĩa so với các nhóm NMVR, VGM và UTG. Tuy
nhiên, chỉ có nhóm xơ gan là tiểu cầu thấp dưới giá trị bình
thường (<150 G/L).
11
Bảng 3.4: So sánh một số chỉ số sinh hóa thông thường giữa các nhóm
Chỉ số
Nhóm
AST (U/L)
SDX
±
ALT (U/L)
SDX
±
Bilirubin TP
(µMol/L)
SDX
±
NMVR (n=53) (1) 27,7±5,8 29 ± 5,8 9,8 ± 0,9
VGC (n=31) (2) 829,4± 344,7 1046±488,6 82,2±105,2
VGM (n=53) (3) 355± 472 412,5±530,8 60,8±102,4
XG (n=32) (4) 193,4±254,6 133,13±178 144,3±190,8
UTG (n=94) (5) 116±140,7 86,8±78 35,4 ±15,1

p
1-
2,3,4,5<0,001
2-3,4,5<0,001
4-5<0,05
1-
2,3,4,5<0,001
2-3,4,5<0,001
4-5<0,05
1-2,3,4<0,01
4-2,3,5<0,01
Nhận xét: Nồng độ enzyme AST và ALT tăng cao nhất ở nhóm
VGC, tăng cao hơn có ý nghĩa so với các nhóm còn lại. Nồng độ
Bilirubin TP tăng cao nhất ở nhóm XG, sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê so với tất cả nhóm khác (p<0,01).
Bảng 3.5: So sánh nồng độ protein toàn phần, albumin và AFP
giữa các nhóm
Chỉ số
Nhóm
Protein TP (g/L)
SDX
±
Albumin (g/L)
SDX
±
AFP(ng/ml)
SDX
±
NMVR (n=53) (1) 74,6 ± 4
39,4 ± 2,9

VGC (n=31) (2) 72,5 ± 5,9
38,3 ± 2,1
15,6 ± 22,5
VGM (n=53) (3) 74,7 ± 5,2
38,2 ± 3,5
10,5 ± 13,3
XG (n=32) (4) 66,2 ± 5,4
33,1 ± 2,2
16,6 ± 22,3
UTG (n=94) (5) 75,7 ± 5,5
36,7 ± 4,4
131,2 ± 132,7
p 4-1,2,3,5<0,01 4-1,2,3,5<0,05 5-2,3,4 < 0,05
Nhận xét: protein và albumin thấp nhất ở nhóm xơ gan, thấp
hơn có ý nghĩa so với các nhóm khác. AFP cao nhất ở nhóm UTG, sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nhóm khác (p < 0,05).
12
Bảng 3.6: Nồng độ HBV DNA ở 5 nhóm nghiên cứu
Chỉ số HBV DNA (copies/ml)
p
SDX
±
NMVR (1) 107 x 10
7
380 x 10
7
p1-5<0,05
VGC (2) 72 x 10
7
99 x 10

7
p2-5<0,0001
p2-4<0,001
VGM (3) 83 x 10
7
150 x 10
7
p3-5<0,01
XG (4) 2,8 x 10
7
2,5 x 10
7
p4-5<0,05
UTG (5) 14 x 10
7
29 x 10
7
Nhận xét: Nồng độ HBV DNA cao nhất ở nhóm NMVR, thấp
nhất ở nhóm XG. Sự khác biệt giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê.
3.2. Đột biến gen TP53 và mối liên quan với biểu hiện bệnh nhiễm
HBV
3.2.1. Kết quả xác định đột biến gen TP53 tại vị trí 249
ser
bằng
PCR RFLP.
Hình 3.1. Kết quả điện di sau khi cắt sản phẩm PCR bằng
enzyme HaeIII.
Ghi chú: băng 1,3 là mẫu không đột biến bị cắt và cho sản
phẩm là 2 đoạn băng có kích thước 66 và 92 bp; băng 2 là mẫu đột
biến gen dị hợp tử, sau khi cắt enzyme cho 3 sản phẩm có kích thước

66, 92 và 158 bp; băng 4 là mẫu không cắt enzyme, có kích thước
158 bp; M là thang chuẩn.
3.2.2. Kết quả xác định đột biến gen TP53 tại vị trí 249
ser
bằng
13
giải trình tự gen
Giải trình tự gen TP53 được tiến hành để khẳng định kết quả
PCR RFLP cho 2 mẫu có đột biến và 2 mẫu bình thường qua kết quả
PCR RFLP. Đồng thời, trong số 328 mẫu nghiên cứu có 5 mẫu
(1,5%) không xác định được bằng phương pháp PCR RFLP nên phải
tiến hành giải trình tự gen. Để đảm bảo kết quả giải trình tự là chính
xác chúng tôi đã tiến hành giải trình tự gen TP53 bằng cả mồi xuôi và
mồi ngược, dùng phần mềm CEQ 8800 và BioEdit để xác định chính
xác chuỗi trình tự giải được. Kết quả một số ví dụ minh họa được
trình bày ở trong các hình và các bảng sau:
Hình 3.2. Kết quả phân tích gen phát hiện đột biến gen TP53.
Nhận xét: So với trình tự không có đột biến thì mẫu TP53 3G
H04_10101411DF có đột biến tại vị trí nt 14073 (Guanine được thay
thế bằng Thymine và Guanine) (hình 3.2).
Từ trình tự nucleotide chúng tôi tiến hành phân tích trên
phần mềm BioEdit để so sánh trình tự axit amin giữa mẫu bình
thường và mẫu đột biến gen. Kết quả cho thấy tại vị trí 249 của
gen TP53 trên mẫu bình thường có axit amin là Arginine, trong
khi đó tại mẫu đột biến được thay thế bằng axit amin Serine. Do
đó, người ta ký hiệu điểm đột biến này là 249 Ser (Hình 3.3).
14
Hình 3.3. Trình tự acide amin tại vị trí 249 thay đổi từ Arginine
thành Serine, vị trí được đánh dấu.
3.2.3. So sánh tỷ lệ đột biến gen TP53 trên các nhóm nghiên cứu

Bảng 3.7: So sánh tỷ lệ đột biến gen TP53 trên các nhóm nghiên cứu
Đột biến Axit amin
Chứng
n = 100
1
NMVR
n=50
2
VGM
n=53
3
XG
n=31
4
UTG
n = 94
5
Tổng
n = 328
TP53,
n (%)
Arg249Ser
3
(3)
0
(0)
1
(1,8)
2
(6,7)

12
(12,7)
18
(5,48)
p
(5-1,2,3,4)
< 0,05
Nhận xét: Tổng số có 18/328 (5,48%) mẫu có đột biến gen
TP53. Tỷ lệ đột biến gen ở nhóm tương ứng là chứng (3%), NMVR
(0%), VGM (1,8%), XG (6,7%) và UTG (12,7%). Sự khác biệt có ý
nghĩa thống kê giữa nhóm UTG với các nhóm còn lại.
3.2.4. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với UTG
15
Bảng 3.8: Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với UTG
Nhóm NC
Gen TP53
Không
ung thư
n = 234
UTG
n = 94
OR (95%,IC) P
TP53, n (%) 6 (2,56) 12 (12,7) 5,5 (1,8-18,5) <0.001
Nhận xét: Nguy cơ UTG ở bệnh nhân mang đột biến gen TP53
cao hơn bệnh nhân không mang gen đột biến là 5,5 lần.
3.2.5. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với các chỉ số huyết học
Bảng 3.9: So sánh số lượng tiểu cầu, tỷ lệ prothrombin trên bệnh
nhân mang gen TP53 đột biến và bình thường ở nhóm UTG
Gen TP53
Chỉ số HH

TP53 đột biến
(n=12)
TP53 bình thường
(n=82)
p
SL tiểu cầu (G/L)
SDX
±
204,5±158,2 185,8±87,1 >0,05
Prothrombin (%)
SDX
±
90,5±13,8 86,1±15,8 >0,05
Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số lượng
tiểu cầu và tỷ lệ prothrombin giữa nhóm có và không có đột biến gen TP53.
3.2.6. Mối liên quan giữa đột biến TP53 với một số chỉ số sinh hóa
Bảng 3.10: Mối liên quan giữa đột biến TP53 với một số chỉ số sinh
hóa
Gen TP53
Chỉ số SH
TP53 đột biến
(n=12)
TP53 bình thường
(n=82)
p
AST (U/L)
SDX
±
135±259,3 112,9±112,7 >0,05
ALT (U/L)

SDX
±
51,8±26,3 92,5±82,3 >0,05
Bilirubin TP (µmol/L)

SDX
±
19,7±13,8 22,7±14,1 >0,05
Protein (G/L)
SDX
±
76,2±6,1 75,7±5,5 >0,05
Albumin (%)
SDX
±
37,9±4,8 36,5±4,3 >0,05
Nhận xét: Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về chỉ số
sinh hóa giữa nhóm TP53 đột biến và nhóm TP53 bình thường.
3.2.7. Mối liên quan giữa đột biến TP53 với AFP và HBV DNA
16
Bảng 3.11: Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với AFP và
HBV DNA
Gen TP53
Chỉ số SH
TP53 đột biến
(n=12)
TP53 bình thường
(n=82)
p
AFP (ng/ml)

SDX
±
144,1±150,5 129±130,5 >0,05
HBV DNA (copies/ml)

SDX
±
9,5.10
7
±2,6.10
7
1,4.10
8
±3.10
7
>0,05
Nhận xét: Không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến
gen TP53 với nồng độ AFP và nồng độ HBV DNA trong huyết tương.
3.2.8. Mối liên quan giữa đột biến TP53 với mức độ biệt hóa
tế bào gan
Bảng 3.12: Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với mức độ biệt
hóa tế bào gan
Mức độ biệt hóa
Gen TP53
Cao
n=20
Kém
n=14
Vừa
n=60

p
ĐB (n,%) 4 (20) 2 (14,3) 6 (10)
>0,05
BT (n,%) 16 (80) 12 (85,7) 54 (90)
Nhận xét: Không có mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với
mức độ biệt hóa tế bào gan
3.2.9. Mối liên quan giữa đột biến TP53 với đột biến gen HBx tại
2 vị trí A1762T và G1764A
Bảng 3.13: Mối liên quan giữa đột biến TP53 với đột biến gen
HBx tại 2 vị trí A1762T và G1764A
Gen HBx A1762T G1764A
ĐB (n=78) BT (n=16) ĐB (n=77) BT (n=17)
ĐB (n,%) 12 (100) 0 (0) 12 (100) 0 (0)
BT (n,%) 66 (84,6) 16 (25,4) 65 (84,4) 17 (25,6)
p > 0,05 > 0,05
Nhận xét: 100% bệnh nhân có đột biến gen TP53 đều có đột biến
gen HBx.
17
Ngoài ra, không có mối liên quan nào được ghi nhận giữa đột
biến gen TP53 với các chỉ số khác như tuổi, giới
3.3. Protein P53 trong huyết tương
3.3.1. So sánh tỷ lệ bệnh nhân định lượng được nồng độ protein
P53 trong huyết tương
Bảng 3.14: So sánh tỷ lệ bệnh nhân định lượng được nồng độ
protein P53 trong huyết tương
Chỉ số
Nhóm
Protein
P53(+)
n (%)

Protein
P53 (-)
n (%)
p
NMVR (n=50) (1) 28(56) 22 (44) 1-5<0,0001
VGC (n=30) (2) 12 (40) 18 (60) 2-6<0,05
VGM (n=53) (3) 24 (45) 29 (55) 3-6<0,05
XG (n=30) (4) 23 (76,7) 7 (23,3) 4-5<0,0001
UTG (n=94) (5) 11 (11,7) 83 (88,3) 5-1,2,3,4,6<0,05
Chứng (n=50) (6) 36 (72) 14 (28) 5-6<0,0001
Tổng (n =308) 134 (43,5) 174 (56,5)
Nhận xét: Trong tổng số 308 mẫu có 134 mẫu (43,5%) định
lượng được protein P53 trong huyết tương. Tỷ lệ bệnh nhân định
lượng được protein P53 trong huyết tương giảm dần từ nhóm chứng
đến XG, NMVR, VGM, VGC và cuối cùng là nhóm UTG. Sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê.
18
Biểu đồ 3.25. So sánh tỷ lệ bệnh nhân định lượng được protein
P53 ở các nhóm nghiên cứu.
3.3.2. So sánh nồng độ protein P53 trong huyết tương ở các nhóm
nghiên cứu
Bảng 3.15: So sánh nồng độ protein P53 trong huyết tương ở các
nhóm nghiên cứu
Nhóm nghiên cứu
Protein P53 (U/ml)
SDX
±
p
Chứng (n=50) (1) 41,6 ± 47,9 1-4<0,01
NMVR (n=50) (2) 37,1 ± 37,8 2-4<0,01

VGC (n=30) (3) 9,56 ± 4,03 3-1, 2, 5 < 0,01
VGM (n=50) (4) 13,5 ± 14,9 4-5<0,05
XG (n=30) (5) 44,7 ± 55,7 5-6<0,001
UTG (n=94) (6) 11,9 ± 11,1
1-6<0,0001
2-6<0,0001
Nhận xét: Tương tự như tỷ lệ % bệnh nhân định lượng được
protein P53 thì nồng độ protein P53 cũng thấp nhất ở nhóm UTG và
VGC, cao nhất ở nhóm người khỏe mạnh. Sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê.
19
55
45
3.3.3. So sánh nồng độ protein P53 ở nhóm có gen TP53 đột biến
và gen TP53 bình thường
Bảng 3.16: So sánh nồng độ protein P53 ở nhóm có gen TP53 đột
biến và gen TP53 bình thường
Gen TP53
Protein
Đột biến
(n = 18)
Bình thường
(n = 310)
p
Protein P53 (U/ml)
SDX
±
6,7 ± 2,6 28,5 ± 37,7 <0,05
Nhận xét: Ở nhóm bệnh nhân có gen TP53 đột biến tại điểm 249
ser

,
nồng độ protein P53 thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân có gen
TP53 bình thường (6,7 ± 2,6 so với 28,5 ± 37,7 U/ml, p<0,05).
Chương 4
BÀN LUẬN
4.1. Đặc điểm chung của các nhóm nghiên cứu
4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
Kết quả cho thấy chủ yếu là bệnh nhân nam chiếm 80,6%, nữ
chiếm 19,4% (bảng 3.1) tương đối phù hợp với các tác giả khác.
Riêng nhóm ung thu gan tỉ lệ nam (88,3%) nữ (11,7%) cao
hơn hẳn nhóm NMVR, nam (69,8%) sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê (p > 0,05). Có thể cùng nhiễm và mang HBV, nhưng nam giới
nguy cơ UTG cao hơn nữ.
Về tuổi: trẻ nhất là nhóm VGC, cao tuổi nhất là nhóm UTG,
XG (bảng 3.1).
4.1.2. Một số đặc điểm lâm sàng và xét nghiệm của các nhóm
nghiên cứu.
Vì chúng tôi chọn bệnh nhân nghiên cứu theo tiêu chuẩn quốc
tế điển hình, nên triệu chứng lâm sàng và các xét nghiệm sinh hóa,
huyết học, miễn dịch là điển hình cho các nhóm, không có gì đặc
biệt: AST, AST cao nhất ở VGC; protein toàn phần Albumin, tỉ lệ
protein thấp nhất ở nhóm XG, Bilirubin toàn phần cao nhất ở nhóm
XG, AFP cao nhất ở nhóm UTG.
HBV DNA cao nhất ở nhóm NMVR, thấp nhất ở nhóm UTG,
sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p <0,05) (Bảng 3.6)
20
4.2. Đột biến gen TP53 và mối liên quan với biểu hiện bệnh
nhiễm HBV:
4.2.1. Tần suất xuất hiện đột biến gen TP53 trên các nhóm
nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy: Tổng số có 18/328 mẫu (5,48%)
có đột biến gen TP53. Tỉ lệ chung và ở các nhóm chứng, NMVR,
VGM, XG (6,7% ) tương đối thấp, nhưng ở nhóm UTG (12,7%) cao
hơn hẳn, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm UTG với các
nhóm còn lại (p < 0,05)
So sánh với tác giả Lê Thị Thúy và cộng sự, thấy tỉ lệ đột biến
gen TP53 trên UTG là 11,7%, khá phù hợp với kết quả của chúng tôi.
Còn so sánh với nghiên cứu ở Gambia, nơi mà tỉ lệ nhiễm và
mang HBV cao (11 - 16%) tương tự ở Việt Nam, Kirk và cộng sự
thấy tỉ lệ đột biến gen TP53 ở XG là 15%, UTG 45%; kết quả tỉ lệ
đột biến gen TP53 ở Gambia cao hơn hẳn của chúng tôi, có thể liên
quan đến yếu tố địa lý môi trường, chủng tộc.
4.2.2. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với ung thư gan.
Trong nghiên cứu này, tỉ lệ đột biến gen TP53 ở nhóm không
UT tương đối thấp (2,56%) còn tỉ lệ đột biến gen TP53 ỏ nhóm UTG
cao hơn hẳn (12,7%)
Qua các thuật toán thống kê so sánh, chúng tôi thấy nguy cơ
UTG ở bệnh nhân mang gen TP53 đột biến cao hơn bệnh nhân mang
gen TP53 không đột biến là 5,5 lần (p < 0,001)
4.2.3. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với các chỉ số sinh
hóa, huyết học
Do tỉ lệ bệnh nhân mang gen TP53 đột biến ở các nhóm
NMVR, VGM, XG thấp, nên chúng tôi chỉ tiến hành phân tích mối
liên quan của đột biến gen TP53 với các chỉ số sinh hóa, huyết học,
miễn dịch trên nhóm UTG.
Kết quả cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về
các chỉ số: sinh hóa, huyết học, HBV - DNA, AFP giữa các bệnh
nhân có đột biến gen TP53 và không đột biến gen TP53 ở nhóm
UTG. Có thể các bệnh nhân này đều là UTG nên các biến động về
các chỉ số là tương đương nhau.

21
Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy không có mối liên quan giữa
đột biến gen TP53 mức độ biệt hóa tế bào gan trên nhóm UTG.
4.2.4. Mối liên quan giữa đột biến gen TP53 với đột biến gen HBx
tại hai vị trí A 1762 T và G1764 A.
Như phần tổng quan đã trình bày: HBx là đoạn gen nhỏ nhất của
HBV, nhưng có vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm và bệnh
sinh UTG. Hơn nữa gen HBx có đoạn liên kết với gen TP53 của người
bệnh. Trong nghiên cứu chung của chúng tôi có một nghiên cứu về đột
biến gen HBx, kết quả cho thấy trên 60% bệnh nhân UTG có đột biến
gen HBx ở 2 vị trí A1762T và G1764A. Đột biến gen HBx còn liên
quan đến mức độ biệt hóa tế bào trên các bệnh nhân UTG.
Qua nghiên cứu so sánh, chúng tôi thấy 100% bệnh nhân có
đột biến gen TP53 đều có đột biến gen HBx.
Ngoài ra, không có mối liên quan nào được ghi nhận giữa đột
biến gen TP53 với các chỉ số khác như tuổi, giới
4.3. Protein P53 trong huyết tương.
4.3.1. So sánh tỉ lệ bệnh nhân định lượng được nồng độ protein
P53 trong huyết tương.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng Kit Elisa của hãng
Abcam để định lượng nồng độ protein P53 không đột biến ở các
nhóm nghiên cứu ngưỡng phát hiện là ≥ 1,5 UI/ml, kết quả cho thấy
có 43,5% mẫu định lượng được protein P53 trong huyết tương. Tỉ lệ
định lượng được protein P53 trong huyết tương giảm dần từ nhóm
chứng đến XG, NMVR, VGM, cuối cùng là nhóm UTG và VGC.
So sánh với tác giả Charuruk (2001), tỷ lệ bệnh nhân định
lượng được protein P53 trong huyết tương chỉ là 22,7%; thấp hơn hẳn
so với chúng tôi. Có thể sự khác biệt này là do đối tượng khác nhau
và bộ kit ELISA hiện nay nhạy hơn 10 năm trước.
22

4.3.2. So sánh nồng độ protein P53 trong huyết tương ở các nhóm
nghiên cứu.
Tương tự như tỉ lệ % bệnh nhân định lượng được protein P53
thì nồng độ protein p53 cũng thấp nhất ở nhóm UTG và VGC. Sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,0001).
Như trên đã đề cập, do P53 là một protein có tác dụng ức chế
khối u phát triển nên thông thường trên các đối tượng khỏe mạnh
nồng độ protein này sẽ cao hơn so với nhóm bệnh ung thư. Ngược
lại, nồng độ P53 đột biến lại cao hơn ở bệnh nhân ung thư so với
người khỏe mạnh. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kit của
hãng Abcam để định lượng nồng độ P53 không đột biến. Kết quả cho
thấy trên nhóm chứng và nhóm NMVR nồng độ P53 cao hơn có ý
nghĩa so với VGC và VGM. Đặc biệt là trong nghiên cứu này nồng
độ P53 ở bệnh nhân VGM lại cao hơn VGC. Phải chăng có sự tác
động qua lại giữa các gen của HBV và gen người trong quá trình
viêm gan mạn tính
Như trên đã trình bày, protein P53 có thể liên kết với protein
HBx để tạo thành phức hợp protein-protein. Kết quả dẫn đến làm bất
hoạt hóa chức năng hoạt hóa dịch mã của protein này. Phân tích trình
tự gen P53 thể hoang dại cho thấy nó có thể liên kết với chuỗi trình
tự TGCCTTGCCT của bất kỳ DNA nào. Khi liên kết này được thực
hiện thì nó sẽ loại bỏ chức năng hoạt hóa của gen kiểm soát phát triển
đặc hiệu. Chính HBV có một đoạn trình tự gen của HBx có thể liên
kết với P53 qua đoạn gen này
4.3.3. So sánh nồng độ protein P53 ở nhóm có gen TP53 đột biến
và gen TP53 bình thường.
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhóm bệnh nhân có gen P53
đột biến tại điểm 249
ser
nồng độ protein P53 thấp hơn có ý nghĩa

so với nhóm bệnh nhân có gen P53 bình thường (6,7 ± 2,6 so với
28,5 ± 37,7 U/ml (p < 0,05).
Đây chỉ là kết quả bước đầu chúng tôi ghi nhận ở nghiên cứu
này. Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của đột biến gen TP53 tới nồng
độ protein P53 còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nữa, ở đây
chúng tôi chỉ nghiên cứu đột biến gen TP53 tại điểm 249
ser
.
Ngoài ra, không có mối liên quan nào giữa nồng độ protein
P53 với các chỉ số sinh hóa, huyết học, miễn dịch ở các nhóm
nghiên cứu.
23
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu đột biến gen TP53 và protein P53 trên 5 nhóm
bệnh nhân nhiễm HBV (NMVR, VGC, VGM, XG, UTG) và nhóm
chứng khỏe mạnh bước đầu chúng tôi xin rút ra một số kết luận sau:
1. Tỷ lệ đột biến gen TP53 tại điểm 249
ser
tương đối thấp và bước đầu
cho thấy có thể liên quan đến ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm HBV
- Tổng số có 18/328 (5,48%) mẫu mang gen TP53 đột biến tại vị
trí 249
ser
. Tỷ lệ đột biến gen TP53 ở các nhóm tương ứng là: chứng
(3%), NMVR (0%), VGM (1,8%), XG (6,7%) và UTG (12,7%). Sự
khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm UTG với các nhóm còn lại
(p<0,05).
- Bệnh nhân mang đột biến gen TP53 tại vị trí 249
ser
có nguy

cơ ung thư gan cao hơn so với bệnh nhân không mang gen đột
biến (OR, KTC 95%) là 5,5 lần (1,8-18,5), (p<0,001).
2. Nồng độ protein P53 trong huyết tương khác nhau ở các thể
bệnh do nhiễm HBV, thấp nhất ở nhóm UTG và VGC.
- Tỷ lệ bệnh nhân định lượng được protein P53 trong huyết
tương giảm dần từ nhóm chứng (72%), XG (76,6%) đến NMVR
(56%), VGM (45%), VGC (40%) và cuối cùng là nhóm UTG
(11,7%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
- Nồng độ protein P53 thấp nhất ở nhóm UTG (11,9 ± 11,1
U/ml) và VGC (9,56 ± 4,03 U/ml), tiếp đến là các nhóm VGM (13,5
± 14,9 U/ml), NMVR (37,1 ± 37,8 U/ml), chứng (41,6 ± 47,9 U/ml)
và cao nhất ở nhóm XG (44,7 ± 55,7 U/ml). Sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê (p<0,05).
- Ở nhóm bệnh nhân có gen TP53 đột biến tại điểm 249
ser
,
nồng độ protein P53 thấp hơn có ý nghĩa so với nhóm bệnh nhân có
gen TP53 bình thường (6,7 ± 2,6 so với 28,5 ± 37,7 U/ml, p<0,05).
KIẾN NGHỊ
Nên có nghiên cứu dọc để đánh giá giá trị tiên lượng ung thư
gan của đột biến gen TP53 tại điểm 249
ser
ở các bệnh nhân nhiễm
HBV tại Việt Nam.
24