Tiểu luận Công nghệ sinh học KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH INVITRO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ĐỀ TÀI
KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH INVITRO
GVHD: PGS.TS Lý Thị Thúy Anh
Thành viên nhóm thực hiện:
1.
Đồng Văn Dương 550330
2.
Nguyễn Thị Vân Trang 560884
3.
Chu Thị Nhàn 560842
4.
Bùi Thị Khánh Linh 560820
5.
Phạm Thị Thúy Hằng 560800
6.
Lê Thị Bích 560777
7.
Nguyễn Kim Tuyến 570845
8.
Hoàng Thị Tình 560878
1

I.
Khái niệm
Nhângiốngvôtính chính là phương pháp nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới
dựa theo sinh sản vô tính, nghĩa là phương pháp tạo nhân lên hoặc tạo ra cơ thể
mới từ tế bào, mô, cơ quan của cơ thể bố hoặc mẹ.
Nhân giống vô tính invitro là quá trình sản xuất một lượng lớn cây
hoàn chỉnh từ các bộ phận cơ quan như: Chồi, mắt ngủ, vảycủ, thân lá của

cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nc in vitro.
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống (micropropagators) dùng thuật ngữ
nhân giống in vitro và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức
nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy
in vitro (in vitro culture).
Nhân giống in vitro bắt đầu bằng các mảnh cắt nhỏ của thực vật, sạch vi
sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng. Thuật ngữ đầu tiên dùng trong quá trình
nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương với các phương thức nhân giống
khác là cutting (cành giâm), layer (cành chiết), scion (cành ghép) hoặc seed
(hạt).
II.Tính cấp thiết của kỹ thuật in vitro
Từ xa xưa ông cha ta đã biết nhân giống cây trồng bằng phương pháp vô
tính truyền thống như giâm, chiết, ghép…Nhưng các biện pháp đó ngày càng
bộc lộ nhiều hạn chế: giống bị nhân nhiều lần làm thái hóa giống, mắc nhiều
bệnh hơn, năng suất giảm, phân ly…Kỹ thuật nhân giống in vitro với công nghệ
vô trùng cao đã khắc phục được những hạn chế trên, nâng cao năng suất chất
lượng của giống cây trồng cả về giá trị nông học và giá trị thương phẩm.Vì vậy
việc nghiên cứu, phát triển kỹ thuật in vitro ngày nay là rất quan trọng cần được
chú trọng đầu tư.
Ưu điểm:
1.
Đưa ra sản phẩm nhanh hơn: Từ một cây ưu việt bất kỳ đều có thể
tạo ra một quần thể có độ đồng đều cao với số lượng không hạn
chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù cây đó là dị hợp về mặt di
truyền.
2.
Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: Trong hầu hết các trường
hợp, công nghệ vi nhân giống đáp ứng tốc độ nhân nhanh cao, từ 1
cây trong vòng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây.
2

3.
Sản phẩm cây giống đồng nhất: Vi nhân giống về cơ bản là công
nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ
cây mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
4.
Tiết kiệm không gian: Vì hệ thống sản xuất hoàn toàn trong phòng
thí nghiệm, không phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu
có kích thước nhỏ. Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn
hơn rất nhiều so với sản xuất trên đồng ruộng và trong nhà kính
theo phương pháp truyền thống.
5.
Nâng cao chất lượng cây giống: Nuôi cấy mô là một phương pháp
hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm
bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thường tăng năng
suất 15 - 30% so với giống gốc.
6.
Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản
phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống như cây
con in vitro (trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống
có thể được bán ở dạng cây, củ bi hay là thân củ.
7.
Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thước nhỏ có thể vận
chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong
điều kiện vô trùng được xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm
an toàn, đáp ứng các qui định về vệ sinh thực vật quốc tế.
8.
Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất
kỳ thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ.
Nhược điểm
1.

Chi phí cao hơn các phương pháp nhân giống khác nên khó cạnh tranh
2.
Một số cây rất rễ bị biến dị khi nhân giống in vitro
3.
Nhân giống in vitro không thể áp dụng trên tất cả các đối tượng
III. Đối tượng nhân giống vô tính in vitro gồm:
+ Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành.
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus).
3
+ Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
IV.Các bước tiến hành nhân giống vô tính in vitro:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ:
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ( cây
cho nguồn mẫu nuôi cấy).
Cây mẹ phải là cây sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus ở thời gian sinh trưởng
mạnh.
Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm
sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu
nhiễm, tăng khả năng sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động:
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro.
Yêu cầu: tỷ lệ nhiễm bệnh thấp, tỷ lệ sống sót cao, mô tồn tại, sinh trưởng phát
triển tốt.
Cần chú ý chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít
chuyên hóa ( đỉnh chồi, mắt ngủ…)
Cần xác định chế độ khử trùng mẫu thích hợp. Thường dùng các chất: HgCl2
0.1% xử lý trong 5-10 phút.
Bước 3: Nhân nhanh:

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng
thông qua: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Chú ý xác định điều kiện môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để hiệu
quả đạt cao nhất: theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều xytokinin sẽ kích
thích tạo chồi, nhiều auxin sẽ kích thích ra rễ. Chế độ nuôi cấy thường là: 25-
27o C, 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000lux.
Bước 4: tạo cây in vitro hoàn chỉnh:
Để tạo rễ cho chồi cần phải cấy truyền từ môi trường nhân nhanh sang môi
trường ra rễ.
4
Môi trường ra rễ thường bổ sung 1 lượng nhỏ auxin. Tuy nhiên, có một số chồi
có thể phát sinh rễ ngay khi chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môi trường
không chứa chất điều tiết sinh trưởng.
Đối với các phôi vô tính thường chỉ gieo trên môi trường không có chất điều
tiếtsinh trưởng hoặc có nồng độ xytokinin thấp để phôi phát triển thành cây.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên:
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm có tỷ lệ sống cao cần phải chú ý những
điểm sau:
Cây đạt tiêu chuển hình thái nhất định: số lá, chiều cao cây, bộ rễ…
Có giá thể sạch, tơi xốp, thích hợp để nhận cây con in vitro.
Chủ động điều chỉnh hàm lượng dinh dưỡng, ẩm độ, ánh sáng trong vườn ươm.
V. Các phương thức nhân giống vô tính in vitro
Phương pháp nhân giống vô tính invitrothực chất là một tiến bộ
vượt bậc của các phương pháp nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành,
giâm chồi, chiết, ghép, tách dòng… Ở đây giá trị thực tiễn của các tiến bộ
khoa học kỹ thuật là đã biến những phương thức cổ điển đó thành những
phương thức hoàn toàn mới về chất cho phép giải quyết những khó khăn
mà phương pháp cổ điển không thể vượt qua.
1.Hoạt hóa chồi nách
Sơđồ1.Mẫumôtrựctiếptạochồivàcâyhoànchỉnh(thôngqua

5
phươngthứctăngkhảnăngphátsinhchồinách)
Chồi nách nhô lên từ vị trí bình thường trong nách lá mang đỉnh sinh
trưởng phụ có khả năng mọc thành chồi giống thân chính. Tùy theo các loại cây
riêng biệt, chỉ có một số giới hạn đỉnh sinh trưởng nách lá phát triển, phần lớn
bị ức chế bởi ưu thế ngọn.
Khi các mẫu cấy là chồi đã được làm giảm ưu thế ngọn, sẽ dẫn tới sự sản
xuất chồi nách ở mỗi lá. Như thế một số lượng lớn chồi con có thể tách ra và
cấy chuyền, hoặc tiếp tục nhân chồi mẹ hoặc tạo rễ và ươm thành cây con.
Trong nhiều loại cây trồng, chồi nách xuất hiện tùy thuộc vào sự cung cấp
cytokinin, chồi nách thường phát triển sớm. Kết quả của sự phân nhánh sớm
này dẫn tới sự phát triển chồi bậc 2, bậc 3 trong sự tăng sinh cụm chồi. Khi
các cụm chồi như vậy phát triển, chúng có thể được phân chia thành cụm chồi
nhỏ hơn hay các chồi được tách ra để hình thành cụm chồi giống như vậy khi
cấy chuyền trên môi trường mới.
Tiến trình phân chia có thể tiếp tục không hạn định. Nếu sử dụng cytokinin ở
nồng độ tối ưu (tổng quát trong khoảng từ 0,5 đến 10mg/l) và nuôi cấy trong
điều kiện tối ưu, tốc độ nhân giống có thể đạt gấp 5 - 10 lần trong chu kỳ đều
đặn 4 - 8 tuần .
Nói chung, kỹ thuật nhân giống bằng chồi nách được áp dụng cho bất cứ
cây trồng sản xuất chồi nách bình thường và có phản ứng với cytokinin như BA,
2iP và Zeatin .
2. Tạo chồi bất định
6
Sơđồ2.Mẫumôphátsinhcallus,callustạochồivàpháttriểncâyhoàn
chỉnh(thôngquaphươngthứcphátsinhchồibấtđịnh)
Chồi bất định là cấu trúc thân và lá mọc một cách tự nhiên trên mô cây trồng, ở
vị trí khác vùng nách lá binh thường.
Đỉnh chồi bất định mới có thể phát triển hoặc trực tiếp trên mẫu vật hoặc gián
tiếp từ mô callus, mà mô callus này hình thành trên bề mặt vết cắt của mẫu vật.

Một số loại mẫu vật được dùng như sau:
- Đoạn thân: thuốc lá, cam, chanh, cà chua, bắp cải…
- Mảnh lá: thuốc lá, cà chua, bắp cải, cà phê, ca cao…
- Cuống lá: thủy tiên…
- Các bộ phận của hoa: súp lơ, lúa mỳ, thuốc lá…
- Nhánh củ: họ hành, họ lay ơn, họ thủy tiên…
- Đoạn mầm: măng tây.
Sự phát sinh chồi bất định trực tiếp bắt đầu bằng các tế bào nhu mô nằm
ở trong biểu bì hoặc ngay phía dưới bề mặt của thân; một số tế bào này trở
thành mô phân sinh và các túi nhỏ gọi là thể phân sinh phát triển. Các thể phân
sinh này rõ ràng có nguồn gốc từ các tế bào đơn. Tuy nhiên, chiều hướng phản
ứng của thực vật cũng tùy thuộc vào nồng độ phytohormone. Nghiên cứu sự tạo
7
chồi ở mô nuôi cấy của cây linh sam Douglas cho thấy cytokinin (BAP 5 µM)
cần thiết cho sự phát sinh chồi bất định, nhưng có ba kiểu phản ứng khác nhau
có kết quả tùy thuộc vào nồng độ của auxin được cung cấp. Nồng độ auxin thấp
(NAA < 5 µM) chỉ có chồi phát triển. Khi nồng độ auxin cao hơn (NAA > 5
µM) lá mầm tạo ra cả callus và nhiều chồi. Khi cung cấp chỉ riêng auxin (NAA
= 5 µM) thì chỉ có callus được tạo thành.
Sự phát triển các chồi bất định gián tiếp đầu tiên qua giai đoạn hình thành
callus cơ sở từ các chồi được tách trong nuôi cấy. Các chồi sau đó phát triển từ
ngoại vi mô callus và không có quan hệ ban đầu với các mô có mạch dẫn của
mẫu vật.
3. Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính
Sơđồ3.Mẫumôphátsinhcallus,callusphátsinhphôisoma(hoặcnuôicấy
dịchhuyềnphùtếbàophátsinhphôisoma)vàtừphôithuđượccâyhoàn
chỉnh
Một phương thức nhân giống vô tính nữa là tạo phôi vô tính từ tế bào mô
sẹo. Năm 1958, Street và Reinert là hai tác giả đầu tiên mô tả sự hình thành phôi
vô tính từ các tế bào đơn của cà rốt (Daucus carota). Đến năm 1977, Murashige

cho rằng phôi vô tính có thể trở thành một biện pháp nhân giống in vitro. Ở một
số loài, sự phát sinh phôi vô tính hình thành trực tiếp từ những phôi bất định
nằm trong phôi tâm. Đến nay, công nghệ phôi vô tính được coi là công nghệ rất
8
có triển vọng cho nông nghiệp trong thế kỷ 21.
Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các tế bào
soma. Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và sinh lý,
nhưng do không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và giao tử
cái, và vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền các phôi vô tính có nội
dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra chúng.
Ở trường hợp phôi hữu tính, sự kết hợp giao tử đực và cái cho ra hợp tử
(zygote). Hợp tử phân chia nhiều lần tạo nên phôi hữu tính có cấu trúc hai cực:
rễ và ngọn. Khi hợp tử phát triển, miền sinh trưởng rễ và miền sinh trưởng ngọn
cùng phát triển và cuối cùng tạo thành cây hoàn chỉnh, qua các giai đoạn phôi
học như sau:
- Trường hợp cây hai lá mầm:
Dạng cầu → dạng thủy lôi → dạng có lá mầm
- Trường hợp cây một lá mầm:
Dạng cầu → dạng scutellar → dạng diệp tiêu
Ở rất nhiều cây, người ta nhận thấy các tế bào đang phân chia vô tổ chức
đã tạo nên callus khi nuôi cấy. Có thể thay đổi hướng phát triển của chúng để
tạo ra các phôi vô tính với các bước phát sinh hình thái rất giống với trường hợp
phôi hữu tính. Điểm khác nhau cơ bản giữa phôi hữu tính và phôi vô tính là
phôi hữu tính luôn luôn đi kèm với nội nhũ là cơ quan dự trữ năng lượng và
chất dinh dưỡng phục vụ cho quá trình nảy mầm, còn ở phôi vô tính hoàn toàn
không có nội nhũ. Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài
các điều kiện vật lý, hóa học thuận lợi cho sự tạo phôi, còn phụ thuộc rất lớn
vào loài, vào các giống, dòng trong cùng một loài.
VI/Hạn chế của vi nhân giống
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Trong điều kiện kỹ thuật hiện nay,

không phải tất cả cây trồng đều co the nhân giống thương phẩm bằng vi nhân
giống. Nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân
9
nhanh để đáp ứng nhu cầu thương mại hoặc bảo quản nguồn gen. Nhiều vấn
đề lý thuyết liên quan đến nuôi cấy và tái sinh tế bào thực vật in vitro vẫn chưa
được giải đáp.
- Chi phí sản xuất
cao: Vi nhân giống đòi hỏi nhiều lao động kỹ thuật thành thạo, quy trình
nuôi cấy từ lúc lấy mẫu cho dến khi đưa ra môi trường chăm sóc phải tuân thủ
nghiêm ngặt . Do đó, giá thành sản phẩm còn khá cao so với các phương pháp
truyền thống như chiết, ghép và nhân giống bằng hạt.
+Công nghệ nhân nhanh giống cây trồng bằng quang tự dưỡng cần nhiều
chi phí cho việc điều khiển môi trường ( ánh sáng, nhiệt độ, CO2, O2, ) giữ
cho môi trường nuôi cấy vô trùng và chuẩn bị giá thể
+Công nghệ bioreactor đòi hỏi thiết bị hiên đại, đắt tiền, vận hành phức
tạp, đặc biệt là khâu chống ô nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.
- Hiện tượng sản phẩm có thể bị biến đổi kiểu hình: Cây con nuôi cấy mô
có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị tế bào soma. Kết quả
là cây con không giữ được các đặc tính quý của cây mẹ. Tỷ lệ biến dị thường
thấp ở giai đoạn đầu nhân giống, nhưng sau đó có chiều hướng tăng lên khi nuôi
cấy kéo dài và tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng. Hiện tượng biến
dị này cần được lưu ý khắc phục nhằm đảm bảo sản xuất hàng triệu cây giống
đồng nhất về mặt di truyền.
VII. QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY BA KÍCH (Morinda
officenalisHow)
Ba kích còn có tên khác là ba kích thiên, dây ruột gà. Là cây thảo, sống
lâu năm, leo bằng thân quấn. Thân non mầu tím, có lông, phía sau nhẵn. Cành
non, có cạnh.
Theo y học cổ truyền, ba kích có vị cay ngọt, tính ôn, vào kinh can thận.
Tác dụng bổ thận tráng dương, cường cân tráng cốt, khu phong trừ thấp. Dùng

cho các trường hợp liệt dương di tinh, bế kinh, đau lưng mỏi gối,
Vì vậy việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống ba kích có chất lượng
tốt đang là yêu cầu cấp bách. Nguồn cung cấp cây giống ba kích hiện nay chủ
yếu bằng phương pháp giâm cành, nhưng hệ số nhân giống đạt rất thấp, chỉ đạt
0,6 lần/năm, chất lượng cây giống lại không cao (Triệu Văn Hùng, 2007). Để
cải thiện hệ số nhân giống cây ba kích, một số tác giả đã nghiên cứu sử dụng
10
phương pháp nuôi cấy mô tế
1. Vật liệu nghiên cứu
Đoạn thân cây ba kích 1 năm tuổi có nguồn
gốc từ huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh.
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1 Phương pháp khử trùng mẫu cấy
Đoạn thân ba kích chứa mắt ngủ có kích thước khoảng 1,5 cm sau khi cắt
từ cây mẹ được ngâm trong nước sạch. Sau đó được rửa bằng nước xà phòng
loãng và rửa lại dưới vòi nước chảy. Tiếp theo, mẫu cấy được khử trùng bằng
cồn 70% trong 1 phút, khử trùng lần 1 bằng Ca(HClO)2 10% trong 15 phút, lần
2 bằng HgCl20,1% trong 5 phút, rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3-4 lần. .
2.2 Phương pháp tái sinh chồi từ mẫu cấy
Mẫu cấy sau khi khử trùng được cấy vào môi trường nền MS (Murashige
và Skoog, 1962) bổ sung 0,25 mg/l kinetin kết hợp với BA với nồng độ 1 mg/l
để tái sinh chồi, cụm chồi
2.3Phương pháp nhân nhanh
Chồi tái sinh từ mẫu cấy có chiều cao 2-2,5 cm và 2-3 cặp lá được chuyển
sang môi trường nhân nhanh là môi trường MS, bổ sung 3mg/l BA.Các chồi
được cấy chuyển sang môi trường mới 45 ngày 1 lần.
2.4 Phương pháp tạo rễ cho chồi in vitro
Các chồi có chiều cao 3-3,5cm, sinh trưởng và phát triển bình thường
được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0.2mg/l IBA, 0,4mg/l than hoạt
tính để kích thích tạo rễ.Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước

khi hấp khử trùng ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 20 phút. Điều kiện
nuôi cấy in vitro: 14h sáng, cường độ ánh sáng 2000 -2500 lux, nhiệt độ 25 ±
20C.
2.5 Phương pháp thích nghi cây ngoài vườn ươm
Cây in vitro hoàn chỉnh được chuyển ravườn ươm, sử dụng giá thể đất
(đất cát pha và đất tầng B - lớp đất thứ 2 từ trên mặt xuống, sau lớp tầng đất mặt
hay tầng lớp canh tác (đất tầng A), tích tụ các chất rửa trôi từ tầng A xuống)
11
hoặc giá thể hữu cơ gồm 50% bột dừa và 50% phế liệu sản xuất nấm ăn. Giá
thể trước khi sử dụng được xử lý bằng KMnO4 1-2%, sau đó đóng vào bầu làm
từ sợi vải dệt hữu cơ (nhập khẩu từ Trung Quốc) có kích thước 8 x 13 cm.Cây
được đặt trong nhà lưới, che phủ bằng nylon và lưới che râm. Lưới che râm có
khả năng cản 70% ánh sáng. Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên
và 2 lần/ngày từ tháng thứ 2. Tưới thúc bằng phân bón NPK Đầu Trâu sau 15-
20 ngày chuyển cây ra vườn ươm với nồng độ tăng dần từ 0,4-1%, định kỳ 10
ngày/lần.
Đoạn thân
Khử trùng: 15 phút Ca(HClO)2 10% và 5 phút HgCl2 0,1%
Nuôi cấy khởi động
MS + 0,25 mg/l Kinetin + 1,0 mg/l BA, 30 ngày
Tái sinh chồi
MS + 3,0 mg/l BA + 0,2 mg/l IBA + 10 mg/l Riboflavin, 45 ngày
Nhân nhanh chồi
½ MS + 0,2 mg/l IBA + 0,4 g/l than hoạt tính, 35 ngày
Tạo cây hoàn chỉnh
Thích nghi cây ngoài vườn ươm
Giá thể hữu cơ (50% bột dừa + 50 % phế liệu sản xuất nấm ăn)
12