Tiểu luận Công nghệ sinh học KỸ THUẬT NUÔI CẤY

MỤC LỤC
A. Đặt vấn đề.
B. Nội dung chính.
I. Khái niệm về thể đơn bội.
1. Thể đơn bội.
2. Các cách hình thành thể đơn bội.
3. Một số đặc điểm của thể đơn bội.
II. Ý nghĩa của cây đơn bội trong chọn giống, nghiên cứu di truyền.
III. Kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn và bao phấn.
1. Nguyên lý.
2. Các giai đoạn cơ bản trong nuôi cấy hạt phấn và bao phấn tách rời.
3. Các phương thức sinh sản vô tính đực in vitro tạo cây đơn bội.
4. Các phương pháp cơ bản.
5. Kỹ thuật nuôi cấy.
6. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cáy hạt
phấn và bao phấn in vitro.
7. Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng.
IV. Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh.
1. Khái niệm.
2. Quy trình tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh.
3. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh.
V. So sánh nuôi cấy: hạt phấn tách rời, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
VI. Hiện trạng.
VII. Ví dụ cụ thể về nuôi cấy tạo cây đơn bội: nuôi cấy noãn và phôi non của cây
ngô.
1. Xác định thành phần của môi trường nuôi cấy.
2. Môi trường nuôi cấy noãn và phôi non của cây ngô.
3. Các bước tiến hành nuôi cấy.
VIII. Kết luận.
IX. Tài liệu tham khảo.
ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong chọn tạo giống cây trồng việc tạo ra được dòng đồng hợp tử tuyệt
đối là một vấn đề rất được quan tâm. Các dòng này đã được tạo ra bằng nhiều
con đường khác nhau như: tự phối, nuôi cấy tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục…
Trong đó tạo cây đơn bội từ tế bào sinh dục là một kĩ thuật mới có nhiều ưu điểm
so với các kĩ thuật khác.
Hầu hết các loài cây trồng của chúng ta đều có mức bội thể lớn hơn 1, phổ
biến là nhị bội (2n) và tứ bội (4n). Như vậy, mỗi đặc điểm di truyền ở những cá thể
này đều bị hai hay nhiều allen của một gen chi phối. Nếu đó là những cá thể dị hợp
tử, tức là các gen trong mỗi hệ gen nhị bội hay tứ bội khác nhau thì biểu hiện tính
trạng (phenotype) của gen đó hoàn toàn tùy thuộc vào tính trạng lặn hay trội của
chúng quyết định. Vì vậy, mức bội thể lý tưởng để tiến hành nghiên cứu di truyền
các tính trạng phải là mức đơn bội (1n) hoặc các mức đa bội khác nhưng chúng
phải đồng nhất tuyệt đối.
NỘI DUNG
I) Khái niệm về thể đơn bội
1) Thể đơn bội
Các thể đơn bội là những cá thể thường là của những loài nhị bội hay đa bội
khác nguồn mà trong tế bào của chúng số lượng nhiễm sắc thể bằng nửa số lượng
nhiễm sắc thể của loài khởi đầu, trong mỗi cặp nhiếm sắc thể tương đồng nó chỉ có
một nhiễm sắc thể (n).
2) Các cách hình thành thể đơn bội
- Phương pháp tạo thể đơn bội in vivo:
Kể từ khi Bergner phát hiện ra cây đơn bội ở Datura stramonium vào năm
1921, các nhà tạo giống thực vật đã tập trung nghiên cứu và thu được nhiều cây
đơn bội hoặc trong điều kiện in vitro hoặc trong điều kiện in vivo. Trong tự nhiên,
các dạng đơn bội tăng lên do kết quả của sự trinh sản và các cây này hiếm khi
mang các đặc điểm của cây bố. Các kỹ thuật in vivo được ứng dụng để sản xuất
cây đơn bội như sau:
+ Sinh sản đơn tính cái (gynogenesis)
Sản xuất các thể đơn bội riêng rẽ bằng cách phát triển các tế bào noãn bất

thụ (unfertilised egg-cell) trong trường hợp sự thụ phấn xảy ra chậm. Gynogenesis
được tìm thấy khi lai khác loài giữa Solanum tuberosum (2n = 4x) × S. phureja (2n
= 2x) kết quả tạo ra dạng song đơn bội (dihaploid) là khoai tây (2n = 2x).
+ Sinh sản đơn tính đực (androgenesis)
Sản xuất các thể đơn bội riêng rẽ bởi sự phát triển của tế bào noãn mang
nhân của bố. Trong trường hợp này, sự đào thải hoặc bất hoạt của nhân noãn (egg-
nucleus) xuất hiện trước khi thụ tinh.
+ Sự đào thải hệ gen bằng lai xa
Hiện tượng này xảy ra khi lai khác chi và khác loài do sự đào thải chọn lọc
của một trong những hệ gen của bố mẹ trong quá trình phát triển sau khi thụ tinh.
Vì thế, phôi được tạo thành chỉ với một hệ gen và cây phát triển từ phôi như thế có
thể là cây đơn bội. Chẳng hạn: lai khác loài giữa Hordeum vulgare và H. bulbosum
cho ra cây đơn bội H. vulgare.
+ Sự giao phối không hoàn toàn (semigamy)
Quá trình lai mà ở đó nhân của tế bào noãn và nhân sinh sản (generative
nucleus) của hạt phấn nảy mầm phân chia độc lập, cho kết quả tạo ra thể khảm đơn
bội (haploid chimera).
+ Xử lý hóa chất
Một số hóa chất, như chloramphenicol và parafluorophenylalanine có thể
cảm ứng đào thải một bộ nhiễm sắc thể ở các tế bào hoặc mô soma, làm tăng các
thể đơn bội. Xử lý bằng toluene blue, maleic hydrazide, nitrous oxide và colchicine
cũng có thể cho các kết quả tương tự.
+ Shock nhiệt
Xử lý nhiệt độ cao hoặc nhiệt độ thấp có thể có tác dụng trong việc ngăn cản
sinh sản hữu tính (syngamy) và cảm ứng thể đơn bội.
+ Ảnh hưởng của chiếu xạ
Tia X hoặc ánh sáng UV gián tiếp cảm ứng làm đứt gãy nhiễm sắc thể và
đào thải chúng, tạo ra các thể đơn bội.
Nhìn chung, các phương pháp in vivo có hiệu suất sản xuất cây đơn bội thấp.
Các phương pháp in vitro cho hiệu quả cao hơn nhờ kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn

(pollen culture) hoặc nuôi cấy bao phấn (anther culture) ở khoảng 250 loài và loài
lai. Các loài đặc trưng của họ Solanaceae cho kết quả tốt hơn cả, mặc dù ở các họ
Cruciferae, Poaceae, Ranunculaceae và một số họ khác cũng có khả năng cảm ứng
tạo cây đơn bội bằng sinh sản đơn tính bao phấn hoặc từ nuôi cấy hạt phấn phân
lập.
- Các phương pháp phát sinh cây đơn bội invitro
Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của thực vật
được gọi là sinh sản đơn tính đực (androgenesis). Người ta phân biệt 3 phương
thức sinh sản đơn tính đực:
+ Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử
Tiểu bào tử (trong bao phấn) → Phôi → Cây đơn bội (n = 1)
Cấu trúc dạng phôi (embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn. Quá trình này
thường xảy ra trong bao phấn, điển hình là: Datura, Nicotiana, Atroppa.
+ Sinh sản vô tính qua callus
Tiểu bào tử (trong bao phấn) → Callus → Chồi → Cây đơn bội (n = 1)
Cây hoàn chỉnh phát triển từ khối callus, khối mô này thường phát triển ra ngoài
bao phấn, ví dụ: Oryza, Brassica, Lolium, Hordeum.
+ Sinh sản đơn tính hỗn hợp
Giai đoạn phát triển callus xảy ra rất ngắn và khó nhận biết, ví dụ: Datura,
Lycopersicum (chưa chắc chắn).
3)
Một số đặc điểm của thể đơn bội
+ Trong cơ thể thực vật chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào
đơn bội. Nếu chúng phất triển thành cây thì cây đó có mức bội thể đơn bội (n).
+ Ở thể đơn bội thì kiểu hình của cây phản ánh trung thực kiểu gen. vì vậy
thể đơn bội là nguyên liệu lý tưởng cho công tác chọn giống cây trồng.
II) Ý nghĩa của cây đơn bội trong chọn giống, nghiên cứu di truyền
- Khó khăn trong việc tạo dòng thuần và hướng khắc phục
Tự thụ qua nhiều thế hệ

Trong chọn giống thực vật để tạo ra dòng thuần chủng người ta tiến hành tự
thụ phấn bắt buộc qua nhiều thế hệ, việc này tốn rất nhiều thời gian. Vì vậy vấn đề
đặt ra là làm thế nào trong 1 thời gian ngắn, chúng ta có thể tạo ra được dòng thuần
chủng. Năm 1934, Stow đã phát hiện ra sự phát triển khác thường của hạt phấn
thành những cấu trúc giống túi phôi đã xảy ra ở 1 số loài thực vật ở Hyacinthus.
Hiện tượng này đã cho thấy các hạt phấn có khả năng phân chia để hình thành các
tế bào mới hoặc các mô khi được sinh trưởng trong các điều kiện thích hợp và
chúng tiếp tục phát triển thành cây đơn bội.
- Một số ưu điểm của cây đơn bội
Sử dụng thể đơn bội có thể rút ngắn quá trình đồng hợp tử hóa bằng cách
chuyển từ đơn bội sang đơn bội kép. Cây đơn bội biểu hiện tất cả thông tin di
truyền ra kiểu hình, dễ dàng nhận biết các alen ẩn, khả năng kháng các điều kiện
bất lợi có thể nhận biết và chọn lọc.
- Khả năng ứng dụng của cây đơn bội.
+ Nghiên cứu về phôi học thực nghiệm
Chủ yếu trên các đối tượng mà phôi phát triển trực tiếp từ tiểu bào tử trong
nuôi cấy bao phấn thông qua quá trình phát sinh phôi đơn tính, còn gọi là sinh sản
đơn tính đực (androgensis).
+ Nghiên cứu về tế bào học
Cây đơn bội có thể sinh trưởng và phát triển tới giai đoạn ra hoa, nhưng bất
dục. Khi nghiên cứu quá trình phân bào giảm nhiễm đầu tiên của tế bào mẹ hạt
phấn cây đơn bội có thể phát hiện được mối quan hệ tương tác giữa các nhiễm sắc
thể, bởi vì bộ nhiễm sắc thể đơn bội không thể giảm nhiễm bình thường được.
Ví dụ:
Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể cây thuốc lá trồng (Nicotiana tabaccum) nhị
bội người ta thấy có 48 NST, lúc phân chia giảm nhiễm chúng sắp thành 2 dãy, gọi
là dãy S và dãy T. Mỗi dãy gồm 24 NST. Nuôi cấy đơn bội của nó có số lượng
NST n = 24 và theo dõi phân chia giảm nhiễm của tế bào mẹ hạt phấn cũng thấy
các NST xếp thành cặp: 12S + 12T. Điều này chứng tỏ bộ NST đơn bội của cây
thuốc lá có những biểu hiện như một bộ NST lưỡng bội, vì các NST trong dãy S

đều tìm thấy NST tương đồng trong dãy T. Đây là kết quả rất phù hợp với lịch sử
phát sinh chủng loại của cây thuốc lá trồng
Như vậy cây thuốc lá trồng là một dạng tứ bội, nhưng không hoàn chỉnh
(allotetraploid), biểu hiện là cây đơn bội n = 12S + 12T bất thụ do không phải tất
cả NST của bộ S đều có NST tương đồng ở bộ T.
+Nghiên cứu đột biến và di truyền
Trong hệ gen (genome) của thể đơn bội không có quan hệ tính trội mà chỉ có
quan hệ bổ sung giữa các gen, do đó các thể đơn bội là những nguyên liệu lý tưởng
trong chọn dòng đột biến cũng như trong những nghiên cứu về mối tương tác của
các gen.
+ Cải thiện giống cây trồng:
§
Tạo dòng thuần
§
Tạo cây từ hạt phấn của các dòng lai F1
§
Nghiên cứu tạo cây từ hạt phấn của các giống thuần
§
Nghiên cứu đột biến, gây đột biến ở các dạng đơn bội và
chọn lọc
§
Phát triển các dòng vô tính ở các loài cây thân gỗ lâu năm
§
Chuyển các gen ngoại lai mong muốn
§
Thiết lập các dòng tế bào đơn bội và nhị bội của cây hạt
phấn
III) Kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn và bao phấn
1) Nguyên lý
Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực (androgensis), người ta nuôi cấy

các hạt phấn đơn nhân (tiểu bào tử) tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn
đơn nhân trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp để kích thích hạt phấn phát
triển thành cây đơn bội.
2) Các giai đoạn cơ bản trong nuôi cấy hạt phấn và bao phấn tách rời
- Giai đoạn tạo cấu trúc phôi từ các hạt phấn nuôi cấy
- Giai đoạn biệt hóa cơ quan và tái sinh cây đơn bội từ các cấu trúc phôi ( giai
đoạn tái sinh)
- Giai đoạn lưỡng bội hóa bộ NST của các cây đơn bội tạo thành cây đơn bội kép
( doubled hapdoids) đồng hợp tử cùng nguồn gen
3) Các phương thức sinh sản vô tính đực invitro tạo cây đơn bội
- Sinh sản đơn tính trực tiếp (thuốc lá, cà độc dược).
Hạt phấn đơn nhân à phôi 1n àcây 1n
- Sinh sản đơn tính đực gián tiếp (lúa, ngô)
Hạt phấn đơn nhân à mô sẹo 1n à chồi 1n àcây1n
- Sinh sản vô tính đực hỗn hợp: quá trình này diễn ra tương tự như sinh sản vô
tính đực gián tiếp, nhưng sự tạo thành mô sẹo ngắn, khó nhận biết. Ví dụ: cà
chua.
4) Các phương pháp cơ bản
Có 2 phương pháp cơ bản được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
là:
- Phương pháp1: Các bao phấn được nuôi cấy trên môi trường có agar hoặc
môi trường lỏng và sự phát sinh phôi xảy ra trong bao phấn
- Phương pháp 2: Hạt phấn được tách rời khỏi bao phấn hoặc bằng phương
pháp cơ học, hoặc do nứt nẻ tự nhiên của bao phấn và được nuôi trên môi trường
lỏng.
5) Kỹ thuật nuôi cấy
- Chọn bao phấn: Bao phấn thích hợp nhất có chứa hạt phấn bắt đầu từ thể tứ
bào tử đến ngay sau lần nguyên phân thứ nhất. Bao phấn của các hoa đầu
tiên cho kết quả tốt hơn bao phấn của hoa muộn.
- Xử lý nụ hoa: Cần xử lý ở nhiệt độ thích hợp các nụ hoa sau khi cắt khỏi cây

và trước khi tách bao phấn để nuôi cấy, nhằm kích thích sự phân chia của hạt
phấn và từ đó tạo cây đơn bội.
- Chọn môi trường tái sinh cây thích hợp: Tùy theo đối tượng nuôi cấy bao
phấn, hạt phấn mà chúng ta lựa chọn môi trường thích hợp tương ứng.
- Chọn lọc cây đơn bội: có nhiều cách để xác định cây đơn bội như: làm tiêu
bản để đếm số lượng nhiễm sắc thể, đo hàm lượng DNA trong tế bào, so
sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái,
kích thước.
6) Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo cây đơn bội trong nuôi cấy
bao phấn, hạt phấn in vitro
- Kiểu gen:
Đóng vai trò chính quyết định đến sự thành công hay thất bại của thí
nghiệm. Do tác dụng của kiểu gen, việc sử dụng ngày càng nhiều sự đa dạng về di
truyền sẽ càng tốt khi triển khai quy trình sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy hạt
phấn.
- Mật độ bao phấn, hạt phấn:
Phản ứng sinh trưởng trong nuôi cấy đơn bội bị chi phối bởi mật độ bao
phấn, hạt phấn nuôi cấy trên môi trường và thay đổi tùy theo loài thực vật
- Tuổi hạt phấn:
Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn phát
triển thích hợp, bắt đầu từ thể tứ bào tử cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên.
- Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn:
Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố,
mẹ cho bao phấn, hạt phấn. Trạng thái sinh lý lại liên quan đến điều kiện môi
trường mà cây sinh trưởng như: quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ và môi
trường dinh dưỡng khoáng.
Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ
hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo.
Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao,
ngày ngắn sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.

- Tiền xử lý bao phấn và hạt phấn
Hiệu quả nuôi cấy bao phấn, hạt phấn cao hơn khi tiến hành xử lý mẫu trước
khi cấy.
Xử lý nhiệt độ lạnh đã làm tăng khả năng tạo mô sẹo và cây từ bao phấn,
đồng thời cho phép bảo quản mẫu lâu hơn.
Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, trong điều
kiện ngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.
- Dinh dưỡng, hoocmon và các nhân tố khác
Môi trường nuôi cấy được sử dụng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn là:
MS-1962, LS-1965, B5-1968, N6-1976.
Các Auxin ngoại sinh (IAA, NAA, IBA, 2,4 D) và cytokinin (BAP, Kinetin,
Zeatin) cần được đưa vào môi trường để thúc đẩy quá trình phát sinh phôi.
Các nguồn chất hữu cơ không xác định như: dịch chiết nấm men, dịch chiết
khoai tây, cà chua… và các axit amin, glutamin có tác động tích cực với sinh
trưởng trong nuôi cấy bao phấn, hạt phấn.
Than hoạt tính có tác dụng kích thích phát sinh phôi vô tính cũng như thúc
đẩy sự khởi đầu của phôi từ mô bao phấn đơn bội.
Khi sử dụng môi trường đặc cần lựa chọn thạch có độ tinh khiết cao sẽ cho
hiệu quả tạo mô sẹo và cây con cao hơn.
Hàm lượng đường cho vào môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng
nuôi cấy
7) Tình hình nghiên cứu, thành tựu và hiện trạng
Tình hình nghiên cứu:
- 1964 Guka và Maheshwasi lài hai nhà khoa học Ấn Độ lần đầu tiên đã tạo
thành công cây đơn bội qua nuôi cấy bao phấn cây cà độc dược.
- Kĩ thuật đơn bội được ứng dụng rất rộng rãi ở hầu hết các nước có công
nghệ chọn giống trên thế giới.
- Công nghệ đơn bội đã được áp dụng đối với hầu hết các cây trồng quan
trọng và mang lai hiệu quả kinh tế cao. Đối với một số cây như lúa, ngô, đại
mạch, măng tây…thì đây là công nghệ không thể thiếu được trong chọn tạo

giống.
- Ở nước ta từ năm 1975 đến nay đã tạo được nhiều loại cây trồng bằng nuôi
cấy đơn bội như ngô, bắp cải, thuốc lá.
Thành tựu:
- Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216 loài thuộc 78
giống, 31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công (Hu và
Zhang, 1985).
- Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao 85, Khao
1105, VH2. Đặc biệt thông qua chọn dòng tế bào soma thu được các giống
DR1, DR2, DR3 đang mở rộng ra qui mô sản xuất. Kết hợp biến dị tế bào
soma với gây đột biến đã tạo giống lúa KDM39. Trong nghiên cứu lúa lai
đang áp dụng kỹ thuật lai xa, cứu phôi, đột biến tạo dòng TGMS và CMS
mới.
- Trong lĩnh vực nông nghiệp, các kết quả nghiên cứu về công nghệ tế bào
- mô phôi thực vật giúp chúng ta nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng
thuần. Hàng loạt dòng thuần ở lúa (ĐV2, MT4, DT26 ) đã được tạo ra bằng
kĩ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn. Đặc biệt, chúng ta đã
sản xuất được dòng lúa thuần mang gene quý như gen bất dục đực tế bào
chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS). Đối với ngô, đã tạo được 5
dòng ngô thuần và hai tổ hợp ngô lai có triển vọng.
- Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở
tiềm năng to lớn cho cho nuôi cấy bao phấn hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó
tạo dòng thuần, đáng chú ý là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa
gạo, lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô, khoai tây…
Ưu điểm của việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
• Nuôi cấy bao phấn:
- Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao tác dễ dàng.
- Môi trường nuôi cấy đơn giản.
• Nuôi cấy hạt phấn:
- Giống tạo ra có tính đồng hợp tử cao.

- Phát sinh phôi dễ dàng trong quá trình nuôi cấy.
- Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
Nhược điểm của việc tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn
• Nuôi cấy hạt phấn:
- Khó thao tác do hạt phấn có kích thước nhỏ.
- Các giai đoạn phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất
tạo cây đơn bội không cao.
- Hạt phấn là vật liệu quan trọng để gây đột biến và chuyển nạp gen,
tuy nhiên nó ít được sử dụng do tỉ lệ tái sinh cây thấp.
• Nuôi cấy bao phấn:
- Khó sàng lọc cây đơn bội.
- Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng.
- Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn tạo cây đơn bội phức tạp, phụ
thuộc nhiều yếu tố: tuổi hạt phấn, trạng thái sinh lý của bao phấn và
hạt phấn, kiểu gen, kinh nghiệm.
IV) Kỹ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh
1. Khái niệm:
Sự hình thành cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh được gọi là sự sinh sản đơn
tính cái hay trinh nữ. Cây đơn bội từ nuôi cấy noãn chưa thụ tinh được hình thành
do kích thích tế bào trứng hay các tế bào cực, tế bào đối cực, tế bào kèm trong
noãn phát triển và tái sinh tạo thể đơn bội.
Đã có nhiều thành công trong nghiên cứu tạo các cây đơn bội bằng nuôi
cấy bao phấn. Nhưng ở một số loại cây như hành,hoa hướng dương hay củ cải
đường… thì phương pháp này tỏ ra không hiệu quả. Chính vì vậy trong những năm
70 các nhà nghiên cứu đã tiến hành tạo cây đơn bội bằng noãn chưa thụ tinh và đã
giành được một số kết quả đáng kể.
2. Quy trình tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh:
Noãn chưa thụ tinh
↓
Nuôi cấy invitro

↓
Phát sinh thể giao tư cái
↓
Hình thành túi phôi
↓
Tế bào trứng tế bào kèm tế bào cực tế bào đối cực
↓ ↓
Callus thể tiền phôi
↓ ↓
Tái sinh chồi phôi
↓ ↓
Tạo cây hoàn chỉnh cây đơn bội
Xử lý đa bội hóa
↓
Cây đơn bội kép
3. Các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn chưa thụ tinh:
- Kĩ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn phức tạp do việc tách
noãn rất khó và dễ gây tổn thương.
- Nhằm tăng hiệu quả của quá trình này người ta tập trung nghiên cứu các yếu tố
như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi
trường nuôi cấy…
+ Kiểu gen của cây mẹ:
• Là một trong những nhân tố quan trọng nhất đối với sự cảm ứng tạo
cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh.
• Người ta nhận thấy mỗi kiểu gen có phản ứng khác nhau trong sinh
sản đơn tính cái in vitro nên cần phải xác định quy trình tối ưu tiên
cho từng kiểu gen.
+ Giai đoạn phát triển của noãn:
• Giai đoạn phát triển của noãn khi đưa nuôi cấy có ý nghĩa đặc biệt
đối với việc tạo thể đơn bội.

• Túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp và cho hiệu quả cao trong
nuôi cấy noãn.
Tuy nhiên việc xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái rất phức tạp
vì túi phôi nằm trong bầu quả. Do đó khó có thể quan sát trực tiếp, để xác định giai
đoạn phát triển của noãn thường phải sử dụng các phương pháp tế bào học: tách túi
phôi, nhuộm màu lát cắt mỏng.
+ Môi trường nuôi cấy:
• Các môi trường nuôi cấy như MS, MF, B5…thường được sử dụng
trong cấy noãn chưa thụ tinh.
• Dạng môi trường được sử dụng chủ yếu là môi trường đặc.
• Để cảm ứng sự trinh sinh cần thiết phải bổ sung vào môi trường
các chất điều tiết sinh trưởng thực vật.
• Ngoài ra nồng độ đường cũng là một yếu tố cần được quan tâm,
nồng độ phải phù hợp cho từng loại cây, ví dụ đối với lúa nồng độ
đường phù hợp là 3-6%, đối với hành 10%.
• Trong nhiều trương hợp việc bổ sung thêm một số chất phụ gia
như nước dừa có tác dụng tạo callus phát sinh phôi và tái sinh cây.
+ Điều kiện nuôi cấy:
• Quá trình nuôi cấy thường được duy trì ở nhiệt độ ổn định 25-
28
0
C.
• Đối với đa số loài thường ở giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy
tiến hành trong môi trường tối, giai đoạn tái sinh cây yêu cầu ánh
sáng từ 2000-3000 lux.
4. Ưu, nhược điểm của nuôi cấy noãn chưa thụ tinh:
- Ưu điểm:
+ Tỉ lệ tạo cây đơn bội theo phương pháp này có nhiều khả quan như ở hành
và củ cải đường 5-20% ở dâu tằm 3-6%.
+ Cây tái sinh ít bị bạch tạng ngay ở cả họ hòa thảo, trong khi nuôi cấy bằng

bao phấn và hạt phấn có tỉ lệ bạch tạng 60-90%.
+ Ở các loại cây ngũ cốc ở VN thì biện pháp này tương đối đơn giản và dễ
thành công như ở cây ngô.
- Nhược điểm:
+ Kĩ thuật nuôi cấy noãn chưa thụ tinh còn nhiều khó khăn phức tạp do việc
tách noãn rất khó và dễ gây tổn thương.
+ Xác định giai đoạn phát triển của thể giao tử cái rất phức tạp vì túi phôi
nằm trong bầu quả.
+ Phương pháp nuôi cấy noãn chưa thụ tinh có thể là một phương pháp
thay thế khắc phục được một số hạn chế trong nuôi cấy bao phấn, nhưng còn rất ít
nghiên cứu theo hướng này.
V) So sánh : nuôi cấy hạt phấn tách rời, nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy lá
noãn chưa thụ tinh.
- Giống nhau:
• Đều dùng giao tử để tạo tế bào đơn bội.
• Đều nhằm tạo ra những cây đơn bội qua sự cảm ứng phát sinh phôi từ
những phân chia lặp lại của các bào tử đơn bội, các kiểu bào tử, các hạt
phấn non.
• Tạo ra các cây đơn bội thuận lợi cho việc nghiên cứu di truyền.
- Khác nhau:
+ Nuôi cấy hạt phấn tách rời:
• Phương pháp này tạo tế bào đơn bội cần phải tách rời các hạt phấn khỏi
bao phấn khi nuôi cấy: các hạt phấn này thường được nuôi cấy trên môi
trường lỏng hoặc bán lỏng. Môi trường nuôi cấy hạt phấn tách rời cần
giàu dinh dưỡng hơn.
• Các giai đọan phát triển của hạt phấn không đồng đều nên hiệu suất tạo
cây đơn bội không cao.
• Tỉ lệ tái sinh cây thấp.
+ Nuôi cấy bao phấn:
• Đơn giản về mặt kĩ thuật và môi trường nuôi cấy.

• Dễ có nguy cơ tạo cây lưỡng bội vì mô và cây có thể được tạo thành từ
mô soma của thành bao phấn => nên khó sàng lọc cây đơn bội.
• Phương pháp nuôi cấy bao phấn được áp dụng trên nhiều đối tượng thực
vật khác nhau : ngô, lúa, thuốc lá…. Nhưng không được áp dụng nhiều
trên các cây: hành, củ cải đường, hoa hướng dương…
• Khi nuôi cấy bao phấn thường gặp hiện tượng bạch tạng.
+ Nuôi cấy lá noãn chưa thụ tinh:
• Là sự sinh sản đơn tính cái.
• Phương nuôi cấy lá noãn chưa thụ tinh chủ yếu trên các đối tượng: hành,
củ cải đường, ngô, các cây ngũ cốc…
• Tuy nhiên kĩ thuật này còn gặp nhiều khó khăn và phức tạp do việc tách
tế bào trứng rất khó và dễ dàng thương tổn. Do vậy, người ta đang tập
trung nghiên cứu các yếu tố như kiểu gen cây mẹ, giai đoạn phát triển
của túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy.
• Cây tái sinh ít bị bạch tạng.
VI) Hiện trạng:
Hiện tại người ta mới nuôi cấy hạt phấn trưởng thành để tạo cây đơn bội
thành công qua con đường phôi hoá, hoặc tạo thành mô sẹo, từ đó tạo cây đơn bội.
Còn nuôi cấy hạt phấn non chưa đạt được nhiều hiệu quả, hiện tại chỉ có một số kết
quả về nuôi cấy hạt phấn non thành công như nuôi cấy hạt phấn non cây Trillium
electum (Saparov và cs,1955), cây hành Allium cepa (Vasil,1959), ở cây Atropa
belladonna (Bajaj,1974).
Hầu hết các cây ngũ cốc và các cây họ đậu nuôi cấy bao phấn rẩt khó thành
công hoặc tỉ lệ thành cây thấp, tỉ lệ cây bạch tạng cao.
Nhiều gen có khả năng thành cây thấp thường không được ứng dụng trong
nuôi cấy bao phấn nhưng có khi gen lại có giá trị kinh tế cao. Ví dụ cấy bao phấn
giống lúa Japonica dễ thành công hơn hơn giống lúa Indica, tuy nhiên giống Indica
lại có vai trò quan trọng hơn nhiều giống Japonica.
VII) Nuôi cấy noãn và phôi non của cây ngô:
1. Xác định thành phần của môi trường nuôi cấy

- Các nguyên tố đa lượng.
- Các nguyên tố vi lượng.
- Nguồn Cacbon.
- Các vitamin.
- Các chất tự nhiên.
- Các chất điều tiết sinh trưởng.
- Chấtlàm đông cứng môi trường – Agar.
- Độ pH của môi trường.
2. Môi trường nuôi cấy noãn và phôi non của ngô:
Vì ngô là cây thuộc họ hoà thảo nên môi trường thích hợp chủ yếu cho nuôi
cấy mô ở ngô đó là môi trường cơ bản (MS) và môi trường Chu (N6).
Bảng 1:Thành phần môi trường dùng trong nuôi cấy mô của noãn và phôi non của
ngô:
Bảng 1.1: Các nguyên tố đa lượng
Thành phần (mg/l) MS N6
KNO3 1900 2830
KH2PO4 170
MgSO4.7H2O 370 90,35
CaCl2.2H2O 440 125,3
Bảng 1.2: Các nguyên tố vi lượng
Thành phần (mg/l) MS N6
H3PO4 6,2 1,6
MnSO4.4H2O 22,3
FeSO4.H2O 27,8 27,8
NaEDTA.2H2O 37,3 37,3
CoCl2.6H2O 0,025
CuSO4.5H2O 0,025
ZnSO4.7H2O 8,6 1,5
Na2MO4.2H2O 0,25
KI 0,83 0,8

Nicotinic acid 0,5 0,5
Các chất hữu cơ và vitamin
Glyxin 2,0 2,0
Thiamin.HCl 0,4 1,0
Mio-Inositol 100 100
Pyridoxine.HCl 0.5 0.5
Bảng 1.3: Các chất điều hòa sinh trưởng
Thành phần (mg/l) MS N6
Edamin 1000
UYK 2,0
Kinetin 0,2
Agar: 8 g/l
pH = 5.8
3. Các bước tiến hành
- Chọn mẫu và xử lý mẫu:
+ Các giống ngô đem nghiên cứu được bố trí thí nghiệm trồng ngoài đồng
ruộng sau đó thu mẫu và nuôi cấy trong ống nghiệm. Các dòng được bối trí theo
hàng, mỗi giống gieo thành 3 hàng. Mỗi hàng gieo cách nhau 3 ngày tránh hiện
tượng hạt phấn trên các cây chín cùng một lúc.
+ Chọn những noãn to đều khi râu phun được 5 - 7cm, bóc vỏ ngoài của
noãn, cắt đoạn khoảng 2-2,5cm, rửa sạch bằng cồn etanol 70
0
. Sau đó đưa vào
buồng vô trùng, dùng H
2
O
2
10% để diệt trùng trong khoảng thời gian vài phút.
+ Chọn những phôi non của noãn đã thụ tinh được 3 - 4 ngày cắt đoạn có
kích thước 2-3mm, phôi non của noãn đã thụ tinh 14 - 24 ngày cắt đoạn 0,5 - 2mm.

Cũng làm sạch thao tác như trên. Nhằm tạo giống sạch bệnh.
• Môi trường nuôi cấy: Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi
trường khoáng MS và môi trường N6.
• Môi trường tái sinh: Sau khi nuôi cấy các callus hình thành đem
chuyển sang môi trường tái sinh.
• Môi trường ra rễ: Sau khi cây được tái sinh đưa ra môi trường ra
rễ. Đó là môi trường MS bổ sung thêm 1mg/1NAA.
• Điều kiện nuôi cấy:
+ Nhiệt độ 26
0
C trong tối với thời gian 2 – 4 tuần ánh sáng: 2000 - 3000
lux với thời gian chiếu sáng 14/24h.
+ Độ ẩm bình thường
• Trước khi chuyển cây ra vườn ươm chuyển các bình ra nhiệt độ
bình thường bên ngoài, để ở mái hiên nơi có mái che hoặc phủ cót.
Tránh ánh nắng trực tiếp mục đích để cây quen dần với nhiệt độ
ngoài trời trong thời gian 1-2 tuần tuỳ thuộc vào độ cứng của cây.
- Sơ đồ tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô trên một số dòng ngô:
Chọn vật liệu nuôi cấy
↓
Khử trùng
↓
Tạo chồi
↓
Tạo rễ
↓
Cấy vào môi trường thích ứng
↓
Trồng cây trong vườn ươm