NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT pps

NUÔI CẤY MÔ – T
Ế BÀO THỰC VẬT BẰNG
TẾ BÀO TRẦN VÀ KĨ THUẬT
KHÁI NIỆM
Nuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho
phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật
hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trư
ờng
nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế
bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống
nghiệm.
CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CÔNG NGHỆ NUÔI
CẤY MÔ- TẾ BÀO
TÍNH TOÀN NĂNG:
Là khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây
hòa chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp,
do trong tế bào có chứa bộ AND(NST) hoàn
chỉnh, chứa toàn bộ thông tin di truyền cho 1
chu kì sống hoàn chỉnh.
AND mARN Protêin tính trạng
Tùy từng tế bào, từng loại mô, từng thời kì
sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp
hoạt động; các gen không cùng hoạt động nh
ư
nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể
(do cơ chế điều hòa hoạt động của gen).
SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HÓA, PHẢN PHÂN
HÓA CỦA TẾ BÀO:
Phân hóa: 1 t
ế bào 1khối tế bào(phân hóa) mô
cơ quan hệ cơ quan.

Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa
thành các mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn
có thể quay về trạng thái chức năng phôi sinh
ban đầu ki gặp điều kiện thuận lợi.
Các đặc tính trên được xác định dựa trên cơ
sở là đặc điểm di truyền nhưng sự thay đổi
môi trường cũng có ảnh hưởng trực tiếp đến
các đặc tính đó.
CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BỎ THÀNH CÔNG
TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ- TẾ
BÀO THỰC VẬT:
Đảm bảo đi
ều kiện vô trùng, phòng thí nghiệm
phải chuyên hóa cao.
Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trư
ờng
đúng cách.
Chọn mô cấy, xử lí mô cấy thích hợp trước và
sau khi cấy.


CÁC BƯỚC TRONG KĨ THẬY NUÔI CẤY
MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT
Tạo vật liệu khởi đầu: thường chọn chồi là bộ
phận nuôi cấy thích hợp nhất khử trùng cấy
trong môi trường khởi động để tái sinh
Giai đoạn nhân nhanh: vật liệu khởi đầu được
chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ
sung Xitokinin để tái sinh 1 thành nhiều chồi.
Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: tách riêng các

chồi cho vào môi trường tạo rể (bố sung
Auxin) mỗi chồi ra rể thành 1 cây hoàn chỉnh.
Giai đoạn ra cây: cây trong ống nghiệm đ
ủ tiêu
chuẩn (chiều cao, số lá, số rể) sẽ được
chuyển sang môi trường tự nhiên.
CÁC HÌNH THỨC NUÔI CẤY MÔ
Nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô bằng tế bào trần
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT
Nuôi cấy mô của cơ quan tách rời:
VD: củ cà rốt cắt lát tách mảnh mạch rây xử
lí+ nuôi cấy mô phôi phôi nảy mầm cây non
trong ống nghiệm cây trưởng thành

Nuôi cấy từ mô hay cơ quan:
VD: từ 1 mô lá tách tế bào nuôi cấy trên đĩa
Pêtri điều kiện thuận lợi sẽ hình thành những
cây non trồng chậu phát triển cây trưởng
thành.
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng:
Từ 1 mô phân sinh của đỉnh sinh trưởng của
rễ hoặc thân nuôi cấy trong môi trường dinh
dưỡng sẽ tạo nên cây con
Nuôi cấy mô sẹo từ hạt phấn( Auxin rất quan
trọng):
Nuôi cấy bao phấn có hạt phấn chín môi
trường thuận lợi bao phấn chín sẽ phân hóa
bằng cách: nhân sinh sản sẽ tiêu biến nhân
sinh dưỡng sẽ nguyên phân tạo mô sẹo nuôi

dưỡng cây đơn bội(n) xử lí cônxixin cây
trưởng thành(đơn bội kép).
NUÔI CẤY MÔ BẰNG TẾ BÀO TRẦN
Khái niệm tế bào trần:
Là tế bào thực vật bị loại bỏ vách bởi 1 xử lí
enzim. Đó là tế bào tự do, cô lập, không định
hướng( vì không còn chịu sự tương quan
trong hệ thống thực vật).
SỰ CÔ LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN
Sự cô lập:
Trước hết phải xử lí vật liệu khởi đầu( lá, mô
sẹo, dịch treo tế bào…) với enzim phân hủy
vách( Xenlulaza, HemiXenlulaza,
Pectolyaza…).

Ví dụ: phương pháp tạo tế bào trần từ lá:
Lá làm sạch lá bằng Clorox 10% rửa lại lá 3
lần bằng nước cất tiệt trùng tách lớp biểu bì
dưới của lá+ gây co nguyên sinh 1h bằng
Mannitol 10% enzim thu được tế bào trần.
Sức trương tế bào bình thường thì được cân
bằng với sức ép cơ học của vách vách mất,
để tế bào không bị vỡ thì cho vào những chất
gây co nguyên sinh (CaCl2,KCl,Mannitol…)
hòa tan trong Enzim khi xử lí
SỰ NUÔI CẤY
Thành phần của môi trư
ờng nuôi cấy lỏng hay
đặc tùy thuộc vào vaät liệu thực vật.Môi
trường này có thêm Auxin và Xitokinin đ

ể giúp
sự tái tạo vách và các lần phân cia đầu tiên
Đảm bảo đủ các yếu tố dinh dư
ỡng: axit amin,
polyamin, Hydrolysat Cazein, nư
ớc dừa, mạch
nha…
Đảm bảo điều kiện nhiệt độ, PH, ánh sáng,áp
suát thẩm thấu….
Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường
phải có áp suất thẩm thấu cao, Auxin, Xitikinin
thích hợp, ánh sáng yếu.
Sau đó c
ần giảm áp suất thẩm thấu bắng cách
pha loãng môi trường để giúp cho sự tăng
trưởng tế bào.
Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển
chúng vào trong môi trường rắn chứa Auxin ở
nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn.
Sau cùng kích thích ra rễ cần loại Xitokinin,
tăng nồng độ Auxin.

Thông thường, tế bào trần cần 1-2 ngày cho
sự hình thành vách, 2-7 ngày cho các lần
nhân đôi đầu tiên, 3-4 tuần cho sự tăng
trưởng mô sẹo, sau đó 1-2 tháng để có phôi
hình cầu, 1tháng nữa để có cây nảy mầm.
ÍCH LỢI CỦA TẾ BÀO TRẦN
Tế bào trần có khả năng tái tạo vách và cho
phôi thể hệ.

Nuôi cấy tế bào trần sẽ mở ra 1 mô hình hấp
dẫn đ
ể theo dõi quá trình sinh phôi thể hệ từ 1
tế bào cô lập. Đặc biệt biết được sự sắp xếp
các sợi Xenluloz để xác định hư
ớng kéo dài tế
bào, vị trí và hướng của mặt phẳng phân chia.

Thuận lợi cho sự nghiên cứu về sinh lí tế bào:
tính thấm của màng, vận chuyển các chất hòa
tan, ion, cơ chế hoạt động của hoocmon thực
vật…

Tế bào trần có thể chịu các xử lí gây đột biến
và được dùng để tạo ra các dòng tế bào có
nguồn gốc đơn bào.
Tế bào trần thiết yếu cho sự lai thể hệ( dung
hợp tế bào trần) và áp dụng các kĩ thuật
chuyển gen( bơm AND, hóa thẩm, điện
thẩm…)
MỞ RỘNG NUÔI CẤY MÔ BẰNG KĨ THUẬT
DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN VÀ KĨ THUẬT
CHUYỂN GEN
SỰ LAI THỂ HỆ BẰNG KĨ THUẬT DUNG
HỢP TẾ BÀO TRẦN
Khái niệm:
Dung hợp là hiện tượng cắt đứt màng sinh
chất nơi tiếp xúc giữa 2 tế bào trần khác loài
do tác động của các nhân tố bên ngoài. Sau
đó là sự tái tổ chức các màng ban đ

ầu thành 1
và bao lấy tế bào chất và 2 nhân cha mẹ.
CÁC HÌNH THỨC DUNG HỢP
Tự dung hợp:
Vì màng sinh chất của tế bào(-) do nhóm P và
Protein nên các tế bào trần đẩy nhau nên
không tự dung hợp. Do đó ph
ải làm các rế bào
trần tiếp xúc nhau nhờ PEG hay sốc điện.
Hóa dung hợp:
S
ự hóa dung hợp có thể thực hiện với NaNO3
0,25M, PVA 15 %…nhưng tần số dung hợp
thấp nên ít được sử dụng.
Virut Senday đã giảm hoạt tính là chất thư
ờng
dùng hiện nay bằng cách cho giọt hỗn hợp 2
lo
ại tế bào trần tiếp xúc từ từ với các giọt PEG
25- 50%
Điện dung hợp (tốtnhất):
Khi đặt hỗn hợp 2 loại tế bào trần trong 1 điện
trường, các tế bào trần sẽ di chuyển, tiếp xúc
nhau và xếp thành 1 chuỗi dài dưới lực điện
trường
Sau đó dùng xung điện ngắn đẻ tạo vết đứt ở
màng, sự dung hợp sẽ xảy ra tại nơi tiếp xúc.
NHỮNG BIẾN ĐỔI CỦA TẾ BÀO
Phần lớn tế bào lai có bộ NST không bền,
nhất là từ cha mẹ xa nhau, 1 vài NST bị hủy

bỏ sau 1 vài lần phân bào. Tính bền chỉ thấy
được sau nhiều lần nhân đôi.
Dung hợp tế bào trần có thể theo 2 kiểu:
Dung hợp nhân 1 phần hay toàn phần: hình
thành tế bào lai.
1 trong 2 nhân cha mẹ được giữ: tế bào chất
lai
Cả 2 đều mang gen trong tế bào chất.
ÍCH LỢI VÀ TRỞ NGẠI CỦA NUÔI CẤY TẾ
BÀO TRẦN
Ích lợi: giúp loại trừ tính bất thụ hửu tính, tạo
cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính
có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện
ph
ức tạp; Không cần hiểu biết chính xác về sự
liên h
ệ giữa các gen, ít tốn kém, nhanh và trực
tiếp.
Trở ngại: Quá trình cô lập nuôi cấy phải hoàn
thiện.
Chưa có phương pháp hiệu quả để tuyển
chọn các sản phẩm phù hợp.
SỰ CHUYỂN GEN TRONG KĨ THUẬT NI
CẤY MƠ
CÁC KHÁI NIỆM VỀ KĨ THUẬT DI TRUYỀN
Lai phân tử:
Là sự dung hợp hai phân tử ADN có nguồn
gốc khác nhau hình thành một phân tử ADN
lai( ADN tái tổ hợp) hoặc hình thành một phân
tử ADN lai gồm hai mạch: một mạch là chuỗi

PolyNu, mạch đối xứng là chuỗi PolyRinu
Công nghệ di truyền (ứng dụng của kó
thuật di truyền) :
Là quy trình sử dụng kó thuật di truyền
để sản xuất sản phẩm sinh học trên
quy mô công ngiệp để đáp ứng nhu
cầu cho con người. Là quá trình có tính
toán đến sản phẩm, giá thành, kinh
tế.
Kĩ thuật di truyền:
Là kĩ thuật thao tác trên vật liệu di truyền dựa
trên những hiểu biết về cấu trúc của
AxitNucleic và di truyền vi sinh vật.
Sự truyền Gen:
Là sự biến đổi bộ gen tế bào bởi sự xen vào
đó 1 đoạn ADN ngoại lai sinh.
ADN tái tổ hợp:
Là phân tử ADN lai đạt được do sự kết hợp
giữa 2 trình tự ADN của 2 lồi khác nhau,
hoặc cũng có thể được hình thành từ 1 mạch
ARN và 1 mạch AND.
Các Enzym công cụ:
Enzym cắt(restriction Enzym): có khả năng
nhận biết và cắt ADNsợi kép ở bhững vị trí rất
chính xác.
Ligaza: nối liền 2 đoạn ADN bắng cách tạo
các mối liên kết P dieste liên kết các Nu.
Reverse transcrip tase: cho phép sao chép
ngược( tức sự tổng hợp cADN từ mARN.
Véctơ truyền: Phân tử ADN nhỏ được dùng đ

ể
ghép đoạn ADN cần nghiên cứu gọi là véctơ
truyền.
Thường dùng là Plasmid vi khuẩn hay ADN
virut.

Sự tạo dòng gen: Là quá trình cô lập và thu
nh
ận nhiều bản sao giống nhau của 1 gen hay
1 đoạn gen dựa trên khả năng tự nhân đôi c
ủa
ADN. Đây là cơ sở cho sự tăng bội đoạn ADN
cần nghiên cứu.
Sự sàng lọc và dò phân tử: Sự sàng l
ọc là quá
trình tuyển chọn các Vectơ chứa đoạn ADN
cần nghiên cứu. Sự tuyển chọn thực hiện nhờ
lai phân tử kết hợp với 1 dò phân tử.
Dò phân tử: Là các đoạn axit Nuclêôtit( ADN,
ARN) sợi đơn: 20 đến vài trăm Nu; Người ta
dùng để đánh dấu đoạn axit Nuclêôtit cần
nghiên cứu trong 1 phản ứng gọi là’’ lai phân
tử’’ nhờ được đánh dấu phóng xạ và có tính
bổ sung và đối song với 1 vùng củ đoạn A.Nu
cần nhận biết.
SỰ CHUYỂN GEN GIÁN TIẾP BỞI
AGROBACTERIUM
SỰ CHUYỂN GEN TRỰC TIẾP(BIẾN NẠP)
Các phương pháp chuyển gen trực tiếp: hoá
thẩm, điện thẩm, súng bắn ADN:

Hoá thẩm: dùng PEG và dùng tế bào trần.(tần
số chuyển gen thấp)
Điện thẩm: dùng xung điện cao áp và tế bào
trần.
Cơ sở củ điện thẩm là khi tế bào chịu sự tác
động của xung điện cao áp, các lổ nhỏ tạm
thời được tạo thành trên màng trở nên thấm,
ADN vào tế bào được theo khuynh hướng
nồng độ. Tuy nhiên số lổ được tạo thành tăng
theo điện thế cho tới 1 giá trị tới hạn( quá
điểm này màng sẽ bị tổn thương không hoàn
nghịch).

Sự thành lập các lỗ nhỏ có thể do:
Điện trường làm thay đổi cân bằng điện tích
lớp P lipit màng
Tính lỏng tạo nên những chổ yếu tạm thời dễ
bị đứt dưới ảnh hưởng của điện trường.
KĨ THUẬT BẮN ADN
Các Plasmid có mang các gen lạ được cố
đinh
trên các hạt kim loại( vàng hay tungsten) có
đường kính 0.000006m nhờ lực hút tĩnh điện.
Các hạt kim loại- Plasmid này được bắn với
vận tốc lớn để xuyên qua vách, màng và xen
vào bộ gen nhân tế bào đích.
Màng tế bào có 1 tính dẻo hồn hảo nên dễ
dàng sửa chữa sau khi bị tổn thương.
Các phân tử ADN tách khỏi hạt kim loại sau
khi vào nhân tế bào gia nhập vào ADN NST

của tế bào.
Ưu điểm: Nhanh, dễ thực hiện, ít cơng đoạn,
hiệu quả kinh tế cao khơng chun biệt cho
lồi
Khơng đòi hỏi cơ lập và ni cấy tế bào trần.
Dễ phát hiện các tế bào có mang gen được
chuyển.
Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền.
Tần số chuyển gen thấp.

Cả phương pháp gián ti
ếp và trực tiếp: sau khi
tế bào thực vật đã mang gen đặc tính, chúng
sẽ ngun phân nhiều lần tạo ra1 khối tế bào
phân hố tạo mơ cơ quan cây trưởng thành.
Thành tựu – ứng dụng của kó thuật
nuôi cấy mô bằng tế bào trần và kó
thuật chuyển gen
Bằng phương pháp dung hợp tế bào
trần và áp dụng kó thuật chuyển gen
các nhà khoa học đã vượt qua mọi rào
cản sinh học trong tự nhiên để tạo các
tế bào lai và các giống thực vật mang
các gen mong muốn. Góp phần quan
trọng trong việc cải tiến giống cây
trồng, tăng năng suất.
Tăng tính chống chịu với các điều kiện khí
hậu, thổ nhưỡng bất lợi
Tăng khả năng kháng thuốc diệt cỏ
Tăng khả năng chống chịu với các côn trùng

và bọ cánh cứng (bằng cách chuyển gen mã
hoá tổng hợp thuốc trừ sâu trong cây thực vật)

Tăng khả năng phòng trừ bệnh cây
Tăng năng suất cây trồng
Tạo thức ăn chứa kháng thể đặc hiệu cho gia
súc
Tuy nhiên cũng có một số hạn chế
Ảnh hưởng sức khoẻ cộng đồng
Ảnh hưởng môi trường sinh thái
Ảnh hưởng kinh tế chính trị xã hội