Chương 2: KỸ THUẬT PHÒNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT doc

Ch ng 2:ươ
K THU T PHÒNG THÍ NGHI MỸ Ậ Ệ
NUÔI C Y MÔ T BÀO TH C Ấ Ế Ự
V TẬ

Ni c y mơấ (tissue
culture) là m t nhánh c a sinh ộ ủ
h c, trong ó, ọ đ mơ hay t bào ế
c ni c y nhân t o trong đượ ấ ạ
m t mơi tr ng có ki m sốt. ộ ườ ể
Nhân giống in vitro th c ự
v tậ hay vi nhân giống th c v tự ậ
(micropropagation) là phương
thức nuôi cấy tế bào, c quan ơ
th c v t trong ống nghiệm, ự ậ
bình ni c yấ , ở điều kiện vô
trùng, nh m m c ằ ụ ích đ nhân
nhanh gi ngố , mang lại hiệu
quả kinh tế cao.
KHÁI NIỆM

Gồm 05 điểm nổi bật:
-
Nhân nhanh các giống cây: hệ số nhân giống cao.
-
Cây giống sau khi nuôi cấy có sự đồng nhất về mặt
di truyền.
-
Loại sạch bệnh cây, đảm bảo các cây giống khỏe
mạnh, có sức tăng trưởng nhanh.

-
Chủ động nguồn giống cây trồng cho sản xuất.
- Trẻ hóa vật liệu giống.
ƯU ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP
VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

Gồm 03 điểm nổi bật:
- Hạn chế về chủng loại sản phẩm.
- Chi phí sản xuất cao: Vi nhân giống đòi hỏi
nhiều lao động kỹ thuật thành thạo.
- Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình: đặc
biệt là các biến dị di truyền.
NHƯỢC ĐIỂM CỦA PHƯƠNG PHÁP
VI NHÂN GIỐNG THỰC VẬT

Các y u t m b o s thành công trong nuôi c y ế ố đả ả ự ấ
mô th c v t là gì?ự ậ
2.1 B o m i u ki n vô trùngả đả đ ề ệ
2.2 Ch n úng môi tr ng và chu n b ọ đ ườ ẩ ị
môi tr ng úng cáchườ đ
2.3 Ch n mô c y thích h p, x lý mô ọ ấ ợ ử
c y thích h p tr c và sau khi c yấ ợ ướ ấ

2.1 BẢO ĐẢM ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG

Ý NGHĨA CỦA VÔ TRÙNG TRONG VI
NHÂN GIỐNG THỰC VẬT
Môi tr ng nuôi c y mô th c v t có ch a ườ ấ ự ậ ứ
ng, mu i khoáng và vitamin, là môi tr ng thích đườ ố ườ
h p cho các loài n m, vi khu n phát tri n. ợ ấ ẩ ể

T c phân chia t bào c a n m và vi khu n ố độ ế ủ ấ ẩ
l n h n r t nhi u so v i t bào th c v t.ớ ơ ấ ề ớ ế ự ậ N u môi ế
tr ng nuôi c y b nhi m vài bào t n m ho c vi ườ ấ ị ễ ử ấ ặ
khu n thì ẩ sau vài ngày n m t tu nđế ộ ầ , toàn b b ộ ề
m t môi tr ng nuôi c y và m u c y s ph y ặ ườ ấ ẫ ấ ẽ ủ đầ
n m, khu n, ấ ẩ thí nghi m ch c chệ ắ ắn ph i lo i b .ả ạ ỏ

Để đảm bảo điều kiện vô trùng trong
quá trình nuôi cấy, đòi hỏi chúng ta
phải thực hiện các yêu cầu:
- Vô trùng mô c y.ấ
- Vô trùng d ng c th y tinh, môi ụ ụ ủ
tr ng và nút y.ườ đậ
- Trong thao tác nuôi c y c n tránh làm r i ấ ầ ơ
n m, khu n lên b m t môi tr ng.ấ ẩ ề ặ ườ

VÔ TRÙNG MÔ CẤY
Mô c y có th là ấ ể các b ph n khác nhauộ ậ c a ủ
th c v t, tùy theo s ti p xúc v i môi tr ng bên ự ậ ự ế ớ ườ
ngoài mà các b ph n này ộ ậ ch a nhi u hay ít vi khu n, ứ ề ẩ
n m.ấ
Ph ng pháp vô trùng m u c y ph bi n ươ ẫ ấ ổ ế
hi n nayệ là dùng các ch t hóa h c có ho t tính di t ấ ọ ạ ệ
n m, di t khu n.ấ ệ ẩ Hi u l c di t n m, di t khu n ệ ự ệ ấ ệ ẩ
c a các ch t này ph thu c vào th i gian x lý, n ng ủ ấ ụ ộ ờ ử ồ
và kh n ng xâm nh p trên b m t mô c y. độ ả ă ậ ề ặ ấ

Tác nhân vô trùng Nồng độ (%)Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả
Hypochlorite canxi 9 – 10 5 – 30 Rất tốt
Hypochlorite natri 2 5 – 30 Rất tốt

Hydroperoxid (H
2
O
2
) 10 – 12 5 – 15 Tốt
Nước Brom 1 – 2 2 – 10 Rất tốt
HgCl
2
0,1 – 1 2 – 10 Trung bình
Chất kháng sinh 4 – 50 (mg/l) 30 – 60 Khá tốt
Nồng độ và thời gian sử dụng một số chất diệt
nấm, diệt khuẩn có thể dùng để xử lý mô cấy:

Lưu ý:
Trong quá trình x lý ử mô c y ph i ng p hoàn toàn ấ ả ậ
trong dung d ch di t n m, khu n.ị ệ ấ ẩ
V i các b ph n có bám nhi u cát, b i tr c khi x ớ ộ ậ ề ụ ướ ử
lý c n r a s ch b ng xà phòng và n c máy.ầ ử ạ ằ ướ
Sau khi x lý xong, mô c y c r a s ch nhi u ử ấ đượ ử ạ ề
l n b ng n c c t vô trùng và lo i b nh ng ph n ầ ằ ướ ấ ạ ỏ ữ ầ
b ho i t tr c khi t mô c y lên môi tr ng.ị ạ ử ướ đặ ấ ườ

Quy trình khử trùng mẫu thực sinh:
Mẫu thực sinh
Rửa kĩ bằng xà phòng và nước máy
Cho vào bình tam giác
Ngâm trong cồn 70
0
C (khoảng 30 giây)
Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần

Tiếp tục ngâm trong dung dịch diệt khuẩn (khoảng 15 - 20 phút) với 05 giọt Tween 80
Rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần
Cắt bỏ những phần mô bị tác nhân vô trùng làm hoại tử (trắng)
Đặt lên môi trường nuôi cấy

VÔ TRÙNG DỤNG CỤ THỦY TINH,
MÔI TRƯỜNG VÀ NÚT ĐẬY
D ng c th y tinh, môi ụ ụ ủ
tr ng và nút y c a chai l ườ đậ ủ ọ
hay d ng c th y tinh c ụ ụ ủ đượ
vô trùng b ng cách ằ h p kh trùng ấ ử
nhi t 121ở ệ độ
0
C, áp su t 1atm ấ
trong thời gian 15 – 20 phút.

o
C
o
F Tác động đến vi sinh vật
121 250
Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (15 – 20 phút)
116 240 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (30 – 40 phút)
110 230 Nhiệt hơi nước tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật và bào tử (60 – 80 phút)
100 212
Nhiệt độ sôi của nước có khả năng tiêu diệt tế bào dinh dưỡng nhưng
không tiêu diệt được bào tử
82 – 93 179 – 200 Tiêu diệt hoàn toàn tế bào đang phát triển vi khuẩn, nấm men, nấm mốc
62 – 82 151 – 180 Các vi sinh vật ưa nhiệt vẫn phát triển được
60 – 77 140 – 171

Pasteur hóa, tiêu diệt phần lớn vi sinh vật gây bệnh trong sữa, nước quả,
trừ bào tử của chúng
16 – 38 61 – 100 Các loài nấm men, nấm sợi, vi khuẩn phát triển mạnh
10 – 16 50 – 61 Các loài ưa lạnh phát triển mạnh
0 32
Các loài vi sinh vật ngừng phát triển
– 18 0 Vi khuẩn ở trạng thái chết
– 251 – 420 Rất nhiều loài vi sinh vật không bò chết trong hydrogen lỏng

Buồng cấy: là buồng có diện tích nh , có hai ỏ
lớp cửa. Buồng cấy cần lát gạch tráng men, tường sơn
có thể lau rửa được. Trước m i l n sử dụng, buồng ỗ ầ
cấy cần được xử lý vơ trùng s b .ơ ộ
Các dụng cụ mang vào buồng cấy đều c n phải ầ
được khử trùng: áo chồng, mũ, khẩu trang, dao kéo,
kẹp, giấy bọc, bông, ống nghiệm, v.v
Tủ cấy: là loại tủ có thiết bò thổi không khí vô
trùng vào vị trí thao tác cấy.
KỸ THUẬT CẤY VƠ TRÙNG

KỸ THUẬT CẤY VÔ TRÙNG
•
Vô trùng d ng c trong nuôi c yụ ụ ấ
•
R a tay b ng xà phòng và n c tr c khi c yữ ằ ướ ướ ấ
•
Lau c n m t bàn t c y vô trùngồ ặ ủ ấ
•
Dùng ng n l a èn c n vô trùng pince, dao c y, ọ ử đ ồ để ấ
kéo,

•
Tránh qu tay ngang qua các d ng c vô trùng trong ơ ụ ụ
t c y.ủ ấ
•
yĐậ các d ng c và môi tr ng vô trùng sau m i ụ ụ ườ ỗ
thao tác
•
H n ch nói chuy n trong phòng c y.ạ ế ệ ấ


2.2 CHỌN ĐÚNG MÔI TRƯỜNG VÀ
CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG ĐÚNG CÁCH

Thành ph n c a môi tr ng nuôi c y thay i tùy ầ ủ ườ ấ đổ
theo loài th c v t, lo i t bào, mô và c quan nuôi c yự ậ ạ ế ơ ấ .
i v i Đố ớ cùng m t lo i mô, c quanộ ạ ơ nh ng ư m c ụ
ích nuôi c y không gi ng nhauđ ấ ố , môi tr ng s ườ ử
d ng c ng khác nhau. ụ ũ
Môi tr ng nuôi c y còn thay i theo ườ ấ đổ giai o n đ ạ
sinh tr ng và phát tri nưở ể c a m u c y. ủ ẫ ấ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có
hàng trăm loại môi trường khác nhau. Tuy nhiên
có thể chia chúng thành 3 nhóm:
- Môi trường nghèo dinh dưỡng: điển
hình là môi trường Knop, môi trường Knudson C;
- Môi trường trung bình: điển hình là môi
trường môi trường White; môi trườnng B5 của
Gamborg;

- Môi trường giàu dinh dưỡng: điển hình
là môi trường Murashige – Skoog (môi trường
MS).
PHÂN LOẠI MƠI TRƯỜNG NI CẤY

Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy:
•
Khoáng a l ng và vi l ng.đ ượ ượ
•
Ngu n cacbon.ồ
•
Các vitamin.
•
Ch t kích thích sinh tr ng.ấ ưở
•
Các ch t b sung, các aminoấ ổ acid và các ch t làm ấ
thay i tr ng thái môi tr ng,…đổ ạ ườ
MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

KHỐNG ĐA LƯỢNG
Nguồn nitơ: g m ồ các d ng: amon, nitrat ạ và
amino acid (canxi nitrat, kali nitrat, natri nitrat hay
amon nitrat (NH
4
NO
3
), amon sulphat).
Nguồn phospho: thường dùng nhất là NaH
2
PO

4
.
7H
2
O và KH
2
PO
4
. Nồng độ phospho trong môi
trường biến thiên từ 0,15 đến 4,00mM, thường
dùng khoảng 1,00mM.
Nguồn kali: kali nitrat, kali chlorua, kali
phosphat. Nồng độ K
+
trong môi trường biến thiên
từ 2 đến 25 mM, trung bình khoảng 10mM.

KHỐNG ĐA LƯỢNG
Nguồn canxi: muối canxi nitrat, canxi
chlorua. Nồng độ Ca2
+
trong môi trường t 1,0 đến ừ
3,5mM, trung bình là 2,0mM.
Nguồn magiê: magiê sunphat, với nồng độ
trong môi trường khoảng 0,5 – 3,0mM.
Nguồn sắt: Những môi trường cổ điển dùng
sắt ở dạng chlorua sắt FeCl
2
sulphat sắt, citrat sắt
Fe(C

4
H
4
O
6
). Hiện nay hầu hết các phòng thí
nghiệm đều dùng sắt ở dạng chelat kết hợp với
Na
2
-ethylen diamintetraacetat (EDTA).

KHỐNG VI LƯỢNG
Tên vi lượng Dạng sử dụng Nồng độ (µm)
Mangan (Mn) MnSO
4
.4H
2
O 15 – 100
Bo (B) H
3
BO
3
6 – 100
Kẽm (Zn) ZnSO
4
.7H
2
O 15 – 30
Đồng (Cu) CuSO
4

.5H
2
O 0,04 – 0,08
Molypden (Mo) (NH
4
)
6
Mo
7
O
24
.4H
2
O 0,007 – 1,0
NaMoO
4
.2H
2
O
Coban (Co) CoCl
2
.6H
2
O 0,1 – 0,4
Iốt (I) KI 2,5 – 20,0

Hai dạng đường thường sử dụng nhất là
saccharose và glucose.
Tùy theo mục đích nuôi cấy, lo i m u c yạ ẫ ấ và
giai o n sinh tr ng c a m u c yđ ạ ưở ủ ẫ ấ , nồng độ

saccharose biến đổi từ 1-6% (w/v), thông dụng
nhất là 2%, tương ứng với 58,4mM.
NGUỒN CACBON – ĐƯỜNG