Nghiên cứu tác nhân gây bệnh vi khuẩn trên cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss) ở giai đoạn cá giống nuôi tại Thác Bạc-Lào Cai pps

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
NGÀNH: BỆNH HỌC THUỶ SẢN



ĐỀ CƯƠNG THỰC TẬP TỐT NGHIỆP
Tên Đề tài:
Nghiên cứu tác nhân gây bệnh vi khuẩn trên cá Hồi vân
(Oncorhynchus mykiss) ở giai đoạn cá giống nuôi tại Thác
Bạc-Lào Cai




Người thực hiện : Trần Thị Ngân
Lớp : 47BH-ĐHNT
Người hướng dẫn: ThS. Trương Thị Mỹ Hạnh

Bắc Ninh, tháng 2/2009
I. Đặt vấn đề:
Đa dạng hóa đối tượng nuôi trong nuôi trồng thuỷ sản nhất là
loài có giá trị kinh tế cao là chủ trương của ngành thuỷ sản.
Bên cạnh nâng cao chất lượng di truyền các loại cá truyền
thống, gia hoá các loài bản địa có giá trị kinh tế, phát triển
công nghệ nuôi thì việc nhập nội một số đối tượng thuỷ sản
nuôi có giá trị kinh tế cũng được ngành thuỷ sản ưu tiên trong
những năm gần đây. Đối với nuôi trồng thuỷ sản nước ngọt,
Cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss) là một trong những đối
tượng nuôi có giá trị kinh tế được nuôi ở nhiều nước xứ lạnh
trên thế giới. Công nghệ sản xuất giống nhân tạo và nuôi
thương phẩm cá hồi vân đã được nghiên cứu hoàn thiện và áp
dụng ở Phần Lan, Đan Mạch, NaUy, Mỹ và nhiều nước ôn đới
khác từ nhiều thập kỷ qua.Trong những năm gần đây nhiều
nước ở Châu Á như Ấn Độ,Nêpan, Đài Loan, Trung quốc
…đã phát triển nghề nuôi cá hồi vân.Sản phẩm chế biến từ cá
hồi vân như cá hun khói rất được ưa chuộng trên thế giới và
được coi la mặt hàng thực phẩm cao cấp.(Nguyễn Công
Dân,2005 )
Ở Việt Nam, các tỉnh miền núi phía Bắc và một số tỉnh Tây
Nguyên có tiềm năng mặt nước để phát triển nghề nuôi cá Hồi
vân.Theo báo cáo tiến độ của dự án “nhập công nghệ sản xuất
giống nhân tạo cá hồi vân” chất lượng nước ở Thác Bạc –
SaPa (nhiệt độ, oxy hoà tan, PH,…) hoàn toàn phù hợp cho
ương nuôi cá hồi vân. Qua đó cho thấy việc áp dụng nguồn
nước tự nhiên này để phát triển các đối tượng cá nước lạnh có
giá trị là việc làm cần thiết và mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Để phát triển tốt nghề nuôi cá Hồi vân bên cạnh sự quản lý tốt

kỹ thuật cần quản lý tốt môi trường và phòng ngừa dịch bệnh.
Trong công nghệ sản xuất giống cá hồi vân, giai đoạn ưong cá
bột,cá hương,và cá giống là rất quan trọng quyết định tới năng
suất và sản lượng giống. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới
giai đoạn ương nuôi trong đó dịch bệnh là một yếu tố rất quan
trọng. Những nghiên cứu sâu hơn về bệnh (ký sinh trùng, nấm,
vi khuẩn…) trên cá hồi vân tại Việt Nam là rất cần thiết.Vì
vậy cần thiết phải tiến hành đề tài :
“Nghiên cứu tác nhân gây bệnh vi khuẩn trên cá Hồi vân
(Oncorhynchus mykiss) ở giai đoạn cá giống nuôi tại Thác
Bạc-Lào Cai ”.

Mục tiêu nghiên cứu:
- Xác định tác nhân gây bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá Hồi
vân ở giai đoạn cá giống nuôi tại Thác Bạc - Lào Cai
Nội dung nghiên cứu:
- Thu mẫu, nuôi cấy, phân lập vi khuẩn trên cá Hồi vân giống
- Gây nhiễm nhân tạo các loài vi khuẩn đã phân lập được lên
cá khỏe.
-Thử kháng sinh đồ, xác định tính diệt khuẩn của thuốc với vi
khuẩn thu được trên cá giống Hồi vân.
II. Phương pháp nghiên cứu:
II.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm:
- Trung tâm Nghiên cứu Quan trắc cảnh báo môi trường và
phòng ngừa dịch bệnh thuỷ sản khu vực miền Bắc (CEDMA) -
Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản 1 - Đình Bảng- Từ Sơn-
Bắc Ninh.
- Trung tâm nghiên cứu cá nước lạnh tại Thác Bạc - Lào Cai
Thời gian:

Từ 9/ 2 - 30/5/2009.
II.2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu:
Vật liệu nghiên cứu chính:
- Dụng cụ giải phẫu: Dao, kéo, đèn cồn…
- Hoá chất: Cồn, thuốc thử, thuốc nhuộm…
- Môi trường nuôi cấy cơ bản, môi trường chọn lọc RS
- Que cấy tròn
- Các loại kháng sinh
- Bộ thuôc kiểm tra API 20E
- Bể kính
II.3. Phương pháp nghiên cứu:
Theo phương pháp của Millar và Frerich (1993)
Tóm tắt các bước nghiên cứu theo sơ đồ sau::

Mẫu cá bệnh

1

Thu mẫu bệnh phẩm (gan,thận, lách…)

Chọn khuẩn lạc

Nuôi cấy tăng sinh
Nhuộm gram Thử phản
ứng sinh hoá

Định danh vi khuẩn
Cảm nhiễm vào cá khỏe Thử kháng sinh đồ

Kết luận tác nhân gây bệnh
Thu mẫu cá
-Dự kiến số mẫu : 45 (mẫu được thu trong 3 đợt )
-Mẫu thu là những cá thể có dấu hiệu bị bệnh. Mẫu được thu
tại hiện trường.
Thu mẫu bệnh phẩm:
- Quan sát dấu hiệu bên ngoài và ghi chép các hiện tượng bất
bình thường trên mẫu cá thu.
- Tất cả các thao tác trong quá trình làm đều được vô trùng.
- Giải phẫu mẫu bằng các dụng cụ vô trùng để lộ các nội quan
.Quan sát, ghi chép các biến đổi khác thường của các cơ quan
như gan, thận, lách
- Dùng bông cồn sát trùng tại diểm cần thu mẫu như gan, thận.
Dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm, vạch lên môi trường nuôi
cấy (TSA, RS) một số đường ziczac đựơc vùng 1.Hơ nóng que
cấy để nguội, từ đường số 1 vạch một số đường liên tiếp được
vùng 2.Tiếp tục như vậy được vùng 3.
- Nuôi cấy mẫu vi khuẩn thu được trong nhiệt độ 15-20
0
C
trong 24h.
Chọn khuẩn lạc
- Sau 24 giờ kiểm tra hình thái khuẩn lạc, bề mặt, rìa , màu
sắc khuẩn lạc
- Chọn khuẩn lạc, nuôi cấy tăng sinh trên môi trường TSA ở
nhiệt độ 15-20
0
C trong 24 giờ

Nhuộm gram:
Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ vi khuẩn nuôi tăng
sinh. Dùng que cấy phết, dàn 1 lớp mỏng trên tấm lam sạch đế
khô tự nhiên rồi hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn. Tiến hành
nhuộm gram theo trình tự:
+ Dung dịch Cystal : 30giây – 60giây, rửa nước nhẹ, vẩy
khô.
+ Dung dịch lugol : 30giây – 60giây, rửa nước nhẹ, vẩy
khô.
+ Cồn Acetone : 30giây – 60giây, rửa nước nhẹ, vẩy
khô.
+ Safranin : 30giây – 60giây, rửa nước nhẹ, để khô.
+ Quan sát kính hiển vi ở vật kính dầu.
Thử phản ứng sinh hoá.


Chuẩn bị kit





OF
-
F

OF
-
O

ONPG

ADH

LDC

OCD

CIT

H
2
S

URE

TDA

IND

VP

GEL

GLU

MAN

INO

SOR

RHA

SAC

MEL

AMY

ARA


Qui trình th
ử kít API 20E

1

2

3

4

- Chuẩn bị hộp ủ và đổ 5ml nước cất (hoặc nước khử khoáng)
vào chỗ lõm để tạo hơi ẩm

Hình: Hộp ủ của kít API20E
 Chuẩn bị mẫu
- Kít thử API 20E không dùng trực tiếp các mẫu bệnh phẩm
- Thu mẫu bệnh phẩm, cấy lên môi trường cơ bản và môi trường
chọn lọc. Sau đó tiến hành chọn khuẩn lạc, cấy chuyển vào môi
trường tăng sinh ở ống thạch nghiêng. Nuôi cấy sau 24 - 48 giờ,
lấy vi khuẩn thuần trên môi trường tăng sinh để pha loãng vi
khuẩn thành dịch huyền phù.
 Thử phản ứng sinh hoá
- Dùng một pipet lấy dịch huyền phù vi khuẩn cho đầy vào các
ống
- Đổ 1 lớp dầu vào các ống ADH, LDC, ODC, H
2
S, URE để
tạo thành yếm khí.
- Thử thêm ngoài trên 2 ống O/F
 Ủ các kit

- Ủ các mẫu phản ứng đó ở nhiệt độ 15-20
0
C thời gian 24 -

48h.
 Đọc kết quả
- Đọc kết quả theo bảng đọc và dùng các thuốc thử hiển thị
kết quả:
+ Thử TDA: cho 1 giọt thuốc thử TDA chuyển màu nâu đỏ là
dương tính.
+ Thử IND: cho 1 giọt thuốc thử JAMES phát triển màu hồng
trong ống thử là dương tính.
+ Thử VP: cho 1 giọt thuốc thử VP 1 và 1 giọt thuốc thử VP 2,
đợi ít nhất 10 phút chuyển màu hồng hoặc đỏ là dương tính.
Nếu chuyển màu hồng nhẹ sau 10 phút là âm tính.
+ Thử NO
2
: cho 1 giọt NIT 1 và 1 giọt NIT 2 vào ống GLU.
Đợi sau 2 - 5 phút chuyển màu đỏ là dương tính.
+ Đối với môi trường OF: Dùng que cấy đã được hơ nóng và
để nguội, lấy vi khuẩn và chọc thẳng vào ống nghiệm chứa
môi trường OF, nuôi trong tủ ấm 24 giờ và đọc kết quả.
 Phân loại
Dựa vào cẩm nang phân loại vi khuẩn của Buller (2005) và
Frerichs (1984)
Cảm nhiễm vi khuẩn lên cá khỏe
- Cá được kiểm tra vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng có kết quả
âm tính trước khi tiến hành thí nghiệm
- Mỗi bể thí nghiệm là 10 con, cá khoẻ mạnh, kích cỡ đồng
đều, cá được nuôi thuần trước khi làm thí nghiệm 1 tuần.
- Mỗi loài vi khuẩn được tiến hành tiêm lặp lại 3 bể.
- Tiêm trực tiếp vào xoang bụng cá, với lượng 0,1ml hỗn
dịch vi khuẩn/cá thể cá, mật độ vi khuẩn 10
6

– 10
7
cfu/ml.
- Lô đối chứng được tiêm nước muối sinh lý 0,85%.
- Sau khi cảm nhiễm vi khuẩn, các lô thí nghiệm cũng như lô
đối chứng được theo dõi, ghi chép các biểu hiện bất thường.
Thử kháng sinh đồ:
- Xác định số lượng vi khuẩn để tiến hành thử kháng sinh đồ:
theo phương pháp đếm trực tiếp (Kock,1987)
- Trang đều dịch huyền phù của vi khuẩn trên bề mặt môi
trường đựng trong đĩa hộp lồng.
- Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên bề mặt môi trường sao
cho không quá 6 đĩa/ hộp lồng.
- Đặt vào tủ ấm 15-20
0
C trong 24h.
- Đo vòng kháng khuẩn của các loại kháng sinh.
II.4. Phân tích số liệu:
Số liệu được phân tích trên phần mềm Excel
III. Dự kiến kết quả đạt được:
 Xác định được tác nhân gây bệnh vi khuẩn trên cá giống
Hồi vân thu được tại Thác Bạc-Lào Cai.
 Với loài vi khuẩn thu được thì lựa chọn được 1 đến 2
loại thuốc có hiệu quả diệt khuẩn

IV. Kế hoạch thực hiện:

Tháng Nội dung
1 2 3 4 5 6
Viết đề cương

Thu mẫu, xử lý mẫu
Phân loại, định danh vi
khuẩn

Cảm nhiễm vào cá
khoẻ

Thu số liệu, xử lý số
liệu

Viết báo cáo
Bảo vệ báo cáo