ứng dụng kỹ thuật pcr genotyping (orf75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN




DIỆP THỊ DIỆU





ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR GENOTYPING (ORF75)
TRONG NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG
TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN




2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy – Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học

Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa - Bộ môn Sinh học và
Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản – trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp
đỡ, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để em có cơ hội
học tập và nắm bắt thêm các phương pháp nghiên cứu khoa học.
Chân thành cảm ơn các anh, chị ở bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản đã nhiệt tình
hỗ trợ, giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Xin cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản khóa 31 đã động viên, giúp đỡ, và trao
đổi kiến thức trong suốt thời gian học tập, làm luận văn tốt nghiệp tại Khoa Thủy
Sản
Xin chân thành cảm ơn và chúc Quý thầy cô và các anh, chị, bạn bè lời chúc sức
khỏe và thành đạt.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT

Bệnh do tác nhân là virus gây ra trên tôm đang là một vấn đề nan giải cho nuôi
trồng thủy sản Việt Nam và thế giới. Trong đó, bệnh đốm trắng do White spot
syndrome virus gây ra là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi.
Các nghiên cứu về đặc điểm dịch tể của WSSV được thực hiện nhằm đề ra những
biện pháp phòng ngừa hiệu qủa nhất để hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do
WSSV gây ra. Và kỹ thuật PCR là một trong những công cụ quan trọng trong
nghiên cứu dịch tể học của WSSV. Do vậy đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR-
genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác nhân gây bệnh đốm trắng (White spot
syndrome virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện.
Qui trình PCR genotyping (ORF75) thực hiện với kết quả được ghi nhận: (i) thành
phần hóa chất tham gia phản ứng là: PCR buffer nồng độ là 1X, nồng độ MgCl
2
là

1,5 mM, nồng độ dNTPs là 200µM, nồng độ mồi xuôi và mồi ngược là 20 pmol,
nồng độ taq ADN polymerase là 2 U, nồng độ ADN chiết tách 1 µl. Tổng thể tích
cho mỗi phản ứng là 25 µl, (ii) điều kiện phản ứng được thực hiện theo chu kỳ
nhiệt là: máy được làm nóng đến 85
o
C. Sau đó đến giai đoạn 94
o
C trong 3 phút,
94
o
C trong 30 giây, 49
o
C trong 30 giây, 72
o
C trong 60 giây lặp lại 30 chu kỳ và
cuối cùng là 72
o
C trong 7 phút. Tổng thời gian khuếch đại khoảng 1giờ 20 phút.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG v
DANH SÁCH HÌNH vi
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới 3
2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3
2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới 3
2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta 4
2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 4
2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam 6
2.3. Sơ lược về bệnh đốm trắng 8
2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV 9
2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý 10
2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm 10
2.3.4 Phương thức lây nhiễm 11
2.3.5 . Một số phương pháp phát hiện WSSV 12
2.3.6 Một số kết quả nghiên cứu dịch tể về bệnh đốm trắng 12
2.4. Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 14
2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 14
2.4. 2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 15
2.4.3 Ứng dụng của PCR 16
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 18
3.1.1 Địa điểm 18
3.1.2 Thời gian thực hiện 18
3.2 Vật liệu nghiên cứu 18
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm 18
3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm 18
3.3 Phương pháp nghiên cứu 19
3.3.1 Qui trình phát hiện WSSV 19
3.3.2 Qui trình PCR genotyping (ORF75) 20
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 22

4.1. Ứng dụng qui trình PCR genotyping (ORF75) 22
4.2 Chu kỳ nhiệt 23
4.2.1 Chu kỳ phản ứng 23
4.2.2 Nhiệt độ gắn mồi 24
4.3 Hàm lượng ADN khuôn 25
4.4. Nồng độ mồi 25
4.5 Nồng độ MgCl
2
26
4.6. Nồng độ taq ADN polymerase 27
4.7 Điều kiện phản ứng 28
4.8 Ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping sau khi đã tối ưu 29
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề xuất 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHỤ LỤC 38

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 : Quá trình bộc phát bệnh đốm trắng ở châu Á và châu Mỹ (Escobedo-
Bonilla C. M. et al.,2008) 9
Bảng 4.1 Cường độ nhiễm WSSV của các mẫu tôm dùng trong nghiên cứu 21
Bảng 4.2 : Thành phần hóa chất được sử dụng để ứng dụng 30
Phụ lục 1: Thành phần hóa chât của phản ứng PCR genotyping (ORF75) trước
khi tối ưu 38
Phụ lục 2: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu
nồng độ taq 38

Phụ lục 3: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu
nồng độ mồi 20 pmol 39
Phụ lục 4: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu
nồng độ mồi 40 pmol 39
Phụ lục 5: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu
nồng độ mồi 60 pmol 40
Phụ lục 6: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu
nồng độ MgCl
2
: ( nồng độ MgCl
2
được thực hiện từ 0.5- 5 mM) 40
Phụ lục 7: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR genotyping (ORF75) tối ưu
chu kỳ nhiệt 41







PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vi
DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Diện tích nuôi nước lợ qua các năm 5
Hình 2.2 Sơ đồ của phản ứng PCR 16
Hình 4.1: Kết quả 3 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF75 22
Hình 4.2: Kết quả 10 mẫu chạy với qui trình PCR genotyping (ORF 75) 23
Hình 4.3: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nhiệt độ gắn mồi

khác nhau 24
Hình 4.4: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ mồi 28
Hình 4.5: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ MgCl
2
27
Hình 4.6: Kết quả qui trình PCR genotyping (ORF75) với các nồng độ taq ADN
polymerase 28
Hình 4.7: kết quả ba mẫu có cường độ nhiễm khác nhau 29
Hình 4.8: Kết quả ứng dụng 8 mẫu nhiễm WSSV thu ở Cà Mau 31



PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU

Việt Nam là một nước có điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho việc phát triển thủy
sản. Ngành thuỷ sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia.
Trong những năm gần đây phong trào nuôi tôm ở Việt Nam đã đạt những thành
tựu khả quan. Tuy nhiên, song song với việc tăng diện tích nuôi, tăng sản lượng,
tăng mức độ thâm canh thì bệnh dịch thủy sản là một mối nguy lớn đối với nghề
nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là bệnh do virus gây ra đã làm sản lượng tôm giảm
một cách đáng kể.
Với khả năng lan truyền bệnh và gây chết tôm hàng loạt, bệnh virus đã gây thiệt
hại lớn và ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của nhiều quốc gia có nghề nuôi
tôm phát triển. Đặc biệt là bệnh đốm trắng (White spot disease-WSD), bệnh đầu
vàng (Yellow head disease - YHD), bệnh đỏ đuôi (do Taura syndrome virus-
TSV)…. Vì hiện nay bệnh virus trên tôm chưa có thuốc đặc trị, nên công tác
phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là điều rất cần thiết. Các phương pháp chẩn

đoán truyền thống như mô bệnh học hay dựa trên dấu hiệu bệnh lý bên ngoài
không giúp phát hiện sớm và chính xác tác nhân gây bệnh. Vì vậy, việc ứng dụng
công nghệ sinh học vào trong chẩn đoán bệnh là một bước phát triển giúp người
nuôi tôm có những giải pháp kịp thời nhằm làm giảm thiệt hại do virus gây ra. Kỹ
thuật PCR là một trong những kỹ thuật chẩn đoán bệnh khá nhạy. Kỹ thuật này
không những giúp phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm mà còn được dùng như là 1
công cụ để nghiên cứu dịch tể học của bệnh và tác nhân gây bệnh. Qua đó, các
phương pháp phòng và trị bệnh được xây dựng để giúp ngươi nuôi hạn chế thiệt
hại đến mức thấp nhất do dịch bệnh gây ra và nâng cao năng suất nuôi. Do vậy,
đề tài “ứng dụng kỹ thuật PCR genotyping (ORF75) trong nghiên cứu tác
nhân gây bệnh đốm trắng trên tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện.
Mục tiêu đề tài
Chuẩn hóa qui trình PCR- genotyping (ORF 75) để góp phần vào việc nghiên cứu
dịch tể học của tác nhân gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên tôm sú nuôi ở Đồng
Bằng Sông Cửu Long.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
Nội dung thực hiện
Xác định chu kỳ nhiệt, thành phần và nồng độ hóa chất thích hợp cho phản ứng
PCR- genotyping (ORF75).
Xác định khả năng ứng dụng của qui trình PCR- genotyping (ORF75) sau khi đã
tối ưu để phân tích một số mẫu tôm bị nhiễm WSSV.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới
2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
Hiện nay, nghề nuôi tôm biển đã và đang giữ vai trò quan trọng trong nền kinh tế
của nhiều nước trên thế giới. Từ những năm 1980 với sự phát triển mạnh mẽ của
nghề nuôi tôm biển cả về qui mô và mức độ thâm canh đã làm cho sản lượng tôm
tăng vọt. Trong giai đoạn 2000-2003, sản lượng nuôi trồng thủy sản của châu Á
hiện chiếm tới 90% về sản lượng và 80% về giá trị nuôi trồng thủy sản của thế
giới.
Theo thống kê của FAO (2004), hàng năm tỉ lệ tăng trung bình của nuôi trồng
thủy sản tính từ năm 1970 đến năm 2002 là 8,9 %. Sản lượng nuôi trồng thủy sản

thế giới năm 2002 đạt 51,4 triệu tấn. Trong đó sản lượng tôm đạt khoảng 1,29
triệu tấn (trích dẫn bởi Phạm Minh Đức, 2004). Các loài tôm được nuôi nhiều
nhất là tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ Trung Quốc (Penaeus chinensis) và
tôm chân trắng (Penaeus vannamei). Riêng 3 loài tôm này chiếm trên 86% sản
lượng tôm nuôi của thế giới. Tôm sú hiện nay được nuôi ở khắp nơi trên thế giới,
đặc biệt là ở khu vực Châu Á Thái Bình Dương (chiếm 72%) và Mỹ La Tinh
(chiếm 28%). Năm 2003, hai loài tôm sú và tôm thẻ chân trắng chiếm tới 77%
tổng sản lượng tôm nuôi (thông tin chuyên đề Bộ Thủy Sản, sô 4/2003)
2.1.2 Tình hình dịch bệnh ở trên thế giới
Do việc gia tăng hoạt động nuôi trồng thủy sản đã dẫn tới sự bùng nổ dịch bệnh,
bệnh do vi khuẩn và virus trên tôm, gây tổn thất lớn về kinh tế trong ngành thủy
sản. Bệnh trên tôm, nhất là bệnh do virus luôn là nỗi lo của người nuôi trồng và là
mối quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học. Mặc dù virus gây bệnh trên tôm thì
không có ảnh hưởng gì đến sức khỏe con người nhưng nó gây tổn thất lớn cho
người nuôi tôm.
Trong những năm 1980 Đài Loan dẫn đầu thế giới về sản lượng tôm. Nhưng đến
1988 dịch bệnh xảy ra đã làm sụp đổ nghề nuôi tôm của nước này. Còn Indonesia
là một nước có nghề nuôi tôm xuất hiện lâu đời nhất ở Châu Á và là một trong
những nước dẫn đầu về sản lượng tôm nuôi trong vùng. Tốc độ phát triển của
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
nghề nuôi tôm tương đối vững chắc. Nhưng vào năm 1992 dịch bệnh xuất hiện và
đã gây thiệt hại khoảng 80% cho các trang trại nuôi tôm thâm canh ở nước này.
Cũng như Đài Loan, Trung Quốc là một trong những nước dẫn đầu thế giới về
sản lượng tôm nhưng vào năm 1993 bệnh dịch đã làm cho những người nuôi tôm
tại Trung Quốc thiệt hại 400 triệu USD; năm 1994 Ấn Ðộ thiệt hại 17,6 triệu
USD, năm 1997 nghề nuôi tôm ở Thái Lan thiệt hại 600 triệu USD; năm 1999
bệnh tôm đã làm Ecuađor thiệt hại 280 triệu USD.
Theo số liệu thống kê của bộ thủy sản cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới
giảm từ 676.262 tấn (2001) còn 593.011 tấn (2002) (thông tin chuyên đề Bộ Thủy

Sản số 4/2005).
Ở khu vực Đông Nam Á - bệnh đốm trắng được xem là nguy hiểm nhất đối với
tôm nuôi. Mọi nghiên cứu đều tập trung ngăn ngừa sự lây nhiễm và bùng nổ bệnh
đốm trắng ở các ao nuôi. Virus đốm trắng có thể nhiễm vào tôm nuôi từ giai đoạn
ấu trùng. Vì vậy, các biện pháp chọn lựa con giống tốt không mang mầm bệnh là
một trong những biện pháp góp phần làm hạn chế dịch bệnh (Nguyễn Văn Hảo,
2004).
2.2 Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh ở nước ta
2.2.1 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Việt Nam là một nước có nhiều tiềm năng để phát triển nuôi trồng thuỷ sản ở
khắp mọi miền đất nước cả về nuôi biển, nuôi nước lợ và nuôi nước ngọt. Theo
điều tra sơ bộ của tổng cục thống kê năm 2007 tổng diện tích mặt nước nuôi trồng
thủy sản cả nước là 1008 nghìn ha trong đó diện tích nuôi tôm chiếm 625,6 nghìn
ha. Tôm luôn là đối tượng nuôi chủ lực của Việt Nam do giá trị xuất khẩu của
chúng cao. Diện tích nuôi tôm ngày càng tăng qua các năm, diện tích tôm nuôi
trong năm 2007 tăng gấp 2 lần so với măn 2000. Sự gia tăng diện tích nuôi được
biểu hiện qua hình 2.1 (số liệu của tổng cục thống kê, 2007)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5

0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
700.0
20002001200220032004200520062007
Năm

nghìn ha

Hình 2.1: Diện tích nuôi nước lợ qua các năm
Trong năm 2007, diện tích nuôi tôm nước lợ chiếm 62% tổng diện tích mặt nước
nuôi trồng thủy sản của cả nước, với sản lượng là 386,6 nghìn tấn, chiếm 19%
tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản cả nước. Theo số liệu của tổng cục thống kê
cho thấy ở diện tích và sản lượng tôm nuôi chủ yếu tập trung ở đồng bằng sông
Cửu Long (ĐBSCL). Trong năm 2007 diện tích nuôi tôm của ĐBSCL chiếm 71%
tổng diện tích nuôi tôm của cả nước, với sản lượng là 315.435 tấn, chiếm 82%
tổng sản lượng tôm nuôi của cả nước. Các tỉnh có diện tích nuôi tôm nhiều nhất là
các tỉnh thuộc ĐBSCL, gồm Cà Mau (279,2 nghìn ha), Bạc Liêu (123,8 nghìn
ha), Kiên Giang (103,5 nghìn ha), Sóc Trăng (64,3 nghìn ha), Trà Vinh (48,3
nghìn ha). Song song với việc mở rộng diện tích, sản lượng tôm nuôi cũng tăng
mạnh từ 32,7 nghìn tấn (1990) lên đến 386,6 nghìn tấn (2007). Năm 2003 sản
lượng tôm của Việt Nam đứng hàng thứ 3 trên thế giới. Các loài tôm nuôi chính ở
Việt Nam gồm tôm sú (Penaeus monodon), tôm he mùa (Penaeus merguiensis),
tôm nương (Penaeus orientalis), tôm đất/rảo (Metapenaeus ensis), trong đó tôm
sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất (thông tin chuyên đề Bộ
Thủy Sản số 2/2005).
Theo thông tin do Bộ Thủy sản (2008) đưa ra tại hội nghị tổng kết công tác nuôi
trồng thủy sản giai đoạn 2001 – 2005 là: so với năm 1999, sản lượng nuôi trồng
thủy sản năm 2005 đã tăng gấp 3 lần (đạt 1,437 triệu tấn); diện tích nuôi trồng
tăng 0,83 lần (đạt 959.945 ha); sản lượng tôm sú giống sản xuất trong nước tăng
gấp 4 lần (đạt 28,8 tỉ con P15)…Với tổng số vốn đầu tư 13.822 tỉ đồng (ngân
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
sách trung ương) giai đoạn 2000 - 2005, nhiều dự án nuôi trồng đã được triển
khai mạnh mẽ và có hiệu quả cao tại các địa phương (Quảng Ninh, Thái Bình,
Thanh Hoá, Quảng Bình, Trà Vinh…).
2.2.2 Tình hình dịch bệnh ở Việt Nam

Trong những năm qua từ 1990- 2007, sản lượng tôm nuôi của nước ta tăng một
cách đáng kể. Tuy nhiên do sự phát triển quá ồ ạt của nghề nuôi tôm ven biển còn
dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, gây thiệt hại không nhỏ cho người
dân cũng như các ngành kinh tế liên quan. Vào giữa năm 1994, bệnh tôm xảy ra
rộng khắp các tỉnh phía Nam đã gây thiệt hại lớn về kinh tế và ảnh hưởng sâu
rộng về xã hội ở những nơi có bệnh (
Object=101262&news_ID=261151456).
Theo ước tính của Bộ Thuỷ sản (1996), dịch bệnh tôm ở các tỉnh ĐBSCL trong
các năm 1994-1995 đã ảnh hưởng tới 85.000 ha và gây thiệt hại 294 tỉ đồng. Và
trong các năm 2001, 2002 dịch bệnh tôm tiếp tục đe doạ và gây ảnh hưởng lớn ở
khu vực ĐBSCL. Theo báo cáo kết quả nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành:
cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm
nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên
Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị
chết trong cả nước. Nguy hiểm nhất là bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh
MBV, bệnh do ký sinh trùng, do dinh dưỡng và gần đây xuất hiện thêm bệnh
phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Bệnh thường lan truyền từ mẹ sang con, lây lan
từ nơi này sang nơi khác, lây nhiễm từ nguồn tôm giống chưa sạch bệnh (thông
tin chuyên đề Bộ Thủy Sản 2/2005).
Bệnh do virus gây ra trên tôm đang là một thảm họa cho nền sản xuất nuôi trồng
thủy sản cho Việt Nam và thế giới. Hiện tại các loại virus gây bệnh trên tôm sú
đang phổ biến tại Việt Nam là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV – White
spot syndrome virus), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô
(Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus -IHHNV), virus gây
còi (Monodon baculovirus- MBV), virus gây đầu vàng (Yellow head virus -
YHV ), …Trong đó, WSSV gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản
lượng tôm của khu vực (Nguyễn Văn Hảo, 2003). Các tỉnh ở Bắc Trung Bộ
(2004) như Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị bệnh; Nghệ An có 9,1-
47,8% diện tích nuôi tôm bị bệnh đốm trắng; 25,6 - 30,4% bị bệnh MBV; 25-
54,5% bị bệnh đầu vàng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
bị bệnh đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi bị chết. Trong năm 2004 các tỉnh
miền Trung và Nam Trung Bộ thì Ninh Thuận là tỉnh có có tỉ lệ diện tích nuôi
tôm bị bệnh cao nhất (52,4%). Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực
này tuy có giảm nhưng bệnh phân trắng, teo gan lại xảy ra hầu hết ở các vùng
nuôi trọng điểm như Ninh Hải, Phan Rang, Ninh Phước có những nơi lên tới 90-
95% tôm bị nhiễm bệnh, đặc biệt là ở những vùng nuôi trên cát. (Quang, 2007).
Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu NTTS II trong năm 2004 tại các
tỉnh Nam Bộ - khu vực nuôi tôm lớn nhất của cả nước, tỉ lệ nhiễm bệnh virus đốm
trắng ở đầm nuôi quảng canh cải tiến là 56%, còn bệnh MBV là 50%. Bệnh virus
đốm trắng gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của
khu vực. Theo ước tính của Bộ Thủy sản, thất thoát do bệnh virus gây ra cho tôm
sú vào khoảng 30% – 50% sản lượng thu hoạch (Hà Anh, 2007).
Do tác động của dịch bệnh đến năng suất nuôi, Bộ Thủy sản đã có những nỗ lực
lớn và phối hợp với chính quyền địa phương và các trường đại học, các viện
nghiên cứu trong và ngoài ngành thủy sản để phòng ngừa và dập tắt dịch bệnh.
Bên cạnh đó, để góp phần giảm thiểu sự lan truyền dịch bệnh thông qua việc xuất
nhập động vật thủy sản tài liệu “hướng dẫn kỹ thuật về quản lý thú y thủy sản đối
với việc vận chuyển có trách nhiệm các động vật thủy sinh của khu vực châu Á”
đã được xây dựng, nhằm làm giảm thiểu nguy cơ lan truyền mầm bệnh và lây lan
bệnh giữa các nước trong cùng khu vực.
Riêng bệnh đốm trắng, để phòng bệnh hiệu qủa cần phải áp dụng các phương
pháp sau: (i) Tránh vận chuyển tôm từ nơi có bệnh đến nơi chưa phát bệnh để hạn
chế lây lan bệnh sang vùng lân cận, (ii) Quản lý chế độ cho ăn tốt, (iii) Nước
trong ao tôm bệnh trước khi thải ra ngoài phải xử lý bằng vôi nung hoặc chlorine,
(iv) Tôm chết phải vớt ra khỏi ao tốt nhất là nên chôn trong vôi nung hoặc đốt, (v)
Nếu tôm quá nhỏ không đáng thu hoạch thì cần xử lí nước ao trước khi tháo bỏ.
(Bùi Quang Tề , 2006)
Bên cạnh đó cần: kiểm tra giống đầu vào đảm bảo là giống không nhiễm bệnh,

không nuôi mật độ quá dày, chọn mùa vụ nuôi thích hợp, không thả tôm nuôi khi
nhiệt độ thấp, thời tiết có nhiều biến động, ao nuôi phải được rào lưới xung quanh
để ngăn chặn cua còng mang mầm bệnh vào ao, phải có ao lắng xử lý nước trước
khi cấp vào ao nuôi, sử dụng hoàn toàn bằng thức ăn công nghiệp, tốt nhất không
nên sử dụng thức ăn tươi sống vì mầm bệnh dễ lây lan, tránh gây sốc cho tôm
(Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
2.3. Sơ lược về bệnh đốm trắng
Trong những năm 90 sản lượng nuôi tôm trên thế giới tăng chậm. Nguyên nhân
chủ yếu dẫn đến sự suy giảm này là do virus gây ra (Lotz, 1997). Những tác nhân
gây bệnh như vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng có thể dùng kháng sinh hoặc vacxin
để trị, còn tác nhân gây bệnh là virus thì không thể dùng cách như vậy để trị
(Teunissen et al., 1998). Bệnh đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm nhất
đối với tôm nuôi hiện nay (Rosenberry, 2004 ).
Năm 1992, WSSV lần đầu tiên xuất hiện ở Đài Loan và gây thiệt hại lớn cho tôm
nuôi ở miền Bắc Đài Loan. Và bệnh đốm trắng nhanh chóng lây lan sang nhiều
nước ở Đông Nam Á. Cuối năm 1993 virus này được tìm thấy ở Nhật Bản và
trong những năm gây đây virus này nó đã xuất hiện và gây thiệt hại lớn cho nghề
nuôi tôm ở nhiều nước trên thế giới. Lúc đầu bệnh đốm trắng chỉ xuất hiện ở châu
Á nhưng cho đến tháng 11-1995 người ta đã phát hiện ra bệnh đốm trắng ở Mỹ
(Texas và South-Carolina) và nó đã gây chết hàng loạt tôm nuôi ở đây. Đầu năm
1999 nó đã được tìm thấy ở Nam Mỹ, và nó đã gây ra thiệt hại lớn cho các trang
trại nuôi tôm ở Nam Mỹ. Cuối năm 1999 bệnh đốm trắng xuất hiện ở Ecuador
(van Hulten ,2001). Đến năm 2002, bệnh đốm trắng được báo cáo là phát hiện
trên các loài giáp xác ngoài tự nhiên ở châu Âu (Pháp) và vùng Trung Đông
(Iran) (Rosebery, 2002 trích dẫn bởi Marks et al., 2005). WSSV xuất hiện ở nhiều
vùng khác nhau và với nhiều tên gọi khác nhau như hypodermal and
haematopoietic necrosis baculovirus (HHNBV) (Durand , 1997), third Penaeus
monodon non-occluded baculovirus (PmNOB III) (Wang , 1995), rod-

shapednuclear virus of penaeus japonicus (RV-PJ) (Inouye et al, 1996), penaeid
rod-shaped ADN virus (Venegas et al, 2000), systemic ectodermal and
mesodermal baculovirus (SEMBV) (Wongteerasupaya et al 1995) hoặc white
spot baculovirus (WSBV) (Lightner, 1996). Cho đến năm 2002 Hội nghị quốc tế
phân loại virus lần thứ 12 (International committee on Taxonomy of viruses -
ICTV) tại Paris mới thống nhất, virus gây Hội chứng đốm trắng thuộc giống
Whispovirus – họ Nimaviridae, với tên gọi chung là White spot syndrome virus
(trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2004).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
Bảng 2.1 : Quá trình bộc phát bệnh đốm trắng ở châu Á và châu Mỹ (Escobedo-
Bonilla C. M. et al., 2008)

Thời gian
bệnh được
phát hiện
Quốc gia Tài liệu tham khảo
1992 Đài Loan Chou et al. 1995
1993
Trung Quốc, Nhật Bản,
Hàn Quốc
Zhan 1998; Inouye et al. 1994;
Park et al. 1998
1994 Thái Lan, Ấn Độ, Bangladesh
Lo et al. 1996a; Karunasagar
1997; Mazid & Banu 2002
1995 Mỹ
Lightner, 1996; Wang et al.
1999a
1996 Indonesia, Malaysia, Sri Lanka

Durand et al. 1996;
Kasornchandra et al. 1998;
Rajan et al. 2000
1997 Việt Nam Bondad-Reantaso 2001
1998 Pe-ru Rosenberry 2001
1999
Philippin, Ecuador, Colombia,
Panama´ ,Honduras, Nicaragua,
Guatemala, Belice
Magbanua , 2 000; Bondad-
Reantaso et al. 2001; Hossain et
al. 2001; Wu et al. 2001
1999 -
2000
Mehico Bondad-Reantaso et al, 2001
2002 Pháp, Iran Dieu et al. 2004; Marks 2005
2005 Brazil APHIS-USDA 2005
2.3.1 Đặc điểm cấu tạo của WSSV
WSSV có dạng hình trứng, có đuôi, acid nhân là ADN 2 mạch, không có thể ẩn,
chỉ có thể vùi trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày và tế bào biểu bì
dưới vỏ, cơ quan lympho (trích dẫn bởi Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Trong hệ gen
của WSSV có A và T chiếm 59% (Escobedo-Bonilla et al., 2008), WSSV có kích
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
thước khá lớn đường kính khoảng 65-70 nm và dài 300 -350 nm (van Hulten el
al.; 2001).
WSSV là một trong những virus có hệ gen lớn nhất được phát hiện (khoảng
300kb). Kích cỡ hệ gen của WSSV khác nhau tùy theo từng vùng khác nhau,
virus được phân lập ở Thái Lan (WSSV- TH) là 292.967 bp (van Hulten et al.,
2001). Còn hệ gen của WSSV được phân lập từ Đài Loan (WSSV-TW) kích

thước là 307.287 bp, hệ gen của WSSV được phân lập từ Trung Quốc (WSSV-
CN) là 305.107 bp (Marks et al, 2005).
Virus có ít nhất 5 lớp protein VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 với trọng lượng
phân tử tương ứng là 28, 26, 24, 19, 15 kDa (Escobedo-Bonilla , 2008). VP28 và
VP19 cấu tạo nên màng bao, VP26, VP24, VP15 cấu tạo nên nucleocapsid (van
Hulten et al., 2000 trích dẫn bởi Marks et al., 2005).
Hệ gen của WSSV có chứa khoảng 531 đến 684 ORF (open reading frames),
trong đó có từ 181- 184 ORF có chức năng mã hóa protein có kích thước từ 51
đến 6077 acid amin. Trong đó vùng ORF75, ORF94 và ORF125 có thể được sử
dụng để nghiên cứu về dịch tể học của WSSV bằng phương pháp PCR
(Escobedo-Bonilla , 2008).
WSSV có thể tồn tại trong môi trường nước ít nhất là 30 ngày ở 30
0
C (điều kiện
phòng thí nghiệm) (Momoyama et al., 1998) và có thể tồn tại ít nhất 3-4 ngày
trong môi trường nước ở 25
0
C (Chang et al., 1998).
2.3.2 Dấu hiệu bệnh lý
Tôm bị bệnh đốm trắng thường xuất hiện các dấu hiệu bệnh lý như sau: trên vỏ
tôm có nhiều đốm trắng có đường kính từ 0,5 -2,0 mm (Lightner, 1996). Những
đốm trắng thường xuất hiện ở phần đầu ngực và ở phần đuôi (đốt bụng thứ 5 và
6). Các đốm trắng thường có kích thước đều nhau tròn và có tâm trong. Ngoài ra,
khi tôm bị bệnh còn có các dấu hiệu khác như: khi tôm bị bệnh đốm trắng ở giai
đoạn đầu tôm thường tập trung ở gần bờ ao, cơ thể và phụ bộ có màu hơi đỏ, tôm
giảm ăn, virus đốm trắng gây ảnh hưởng đến dạ dày, mang, lớp biểu bì dưới vỏ,
gan tụy. Ở giai đoạn sau nó ảnh hưởng đến tế bào lympho, tuyến râu, cơ, ruột
giữa, ở giai đoạn sau khi tôm bị bệnh nặng các cơ quan như dạ dày, mang, lớp tế
bào biểu mô dưới vỏ, cơ quan lympho, gan tụy, tuyến râu sẽ bị hoại tử (Chang ,
1996). Tỉ lệ chết tích lủy là 100% sau khi bệnh bộc phát khoảng 3-10 ngày

(Lightner, 1996).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11


2.3.3 Loài và giai đoạn cảm nhiễm
Virus này gây bệnh trên nhiều đối tượng tôm nuôi như F. setiferus and L.
vannamei (ở Mỹ), F. Chinensis và M. japonicus (Trung Quốc), P. monodon
(Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Đài Loan), M. japonicus (Nhật Bản). Ngoài ra,
WSSV còn có thể ký sinh trên các loài giáp xác khác ở vùng nước ngọt, nước lợ,
vùng nước mặn như cua biển và tôm hùm. Tuy nhiên WSSV không gây chết cho
những loài này mà những loài này chỉ là vật mang mầm bệnh (Lo et al., 1996).
WSSV không những gây bệnh cho các loài tôm nuôi mà còn gây bệnh cho các
loài tôm ngoài tự nhiên. Vì vậy cần phải có nhiều biện pháp để phòng bệnh hợp lý.
Virus này gây bệnh trên tất cả các giai đoạn tôm nuôi từ giai đoạn trứng cho đến
giai đoạn bố mẹ. Tuy nhiên bệnh thường gặp nhất là ở giai đoạn hậu ấu trùng, tiền
trưởng thành và trưởng thành. Và tỉ lệ chết cao nhất là khi tôm nuôi 1-2 tháng.
Bệnh thường xuất hiện khi tôm bị sốc (chẳng hạn như khi nồng độ muối thay đổi
đột ngột hoặc nhiệt độ nước xuống thấp dưới 30
0
C thì bệnh sẽ bệnh bộc phát
nhanh chóng) (Jiravanichpaisal , 2004)
2.3.4 Phương thức lây nhiễm
WSSV có thể lây theo chiều dọc và chiều ngang. Lây nhiễm theo chiều ngang chủ
yếu là do ăn thịt lẫn nhau (tôm khỏe ăn thịt tôm bệnh, hoặc ăn các thức ăn bị
nhiễm WSSV), hoặc lây nhiễm theo nguồn nước (Chou et al., 1998).
Theo Bùi Quang Tề (2006) bệnh đốm trắng lây truyền theo phương ngang là chủ
yếu. Virus này chủ yếu lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh
đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay bên trong ao nuôi tôm. Những
con tôm khỏe ăn những con tôm bị bệnh đốm trắng chết bị làm cho bệnh lây lan

càng nhanh hơn. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bệnh đốm trắng từ ao
khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẫu thừa vào ao nuôi. Theo ông bệnh
đốm trắng không có khả năng lây truyền qua theo phương thẳng đứng vì trứng bị
bệnh đốm trắng thì không thể thành thục được. Nhưng trong quá trình đẻ trứng
tôm bố mẹ thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng, do đó ấu trùng tôm
dể dàng bị nhiễm virus ngay từ giai đoạn sớm. Theo Lo (1997) thì WSSV ngoài
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
lây truyền theo phương ngang thì nó cũng có lây từ mẹ sang con nhưng những
virion của WSSV có hiện diện bên trong trứng hay không thì chưa xác định được.
2.3.5 . Một số phương pháp phát hiện WSSV
Chẩn đoán là việc xác định căn nguyên của bệnh thông qua các triệu chứng của
bệnh (bệnh lý học lâm sàng). Kỹ thuật được sử dụng để chẩn đoán bệnh rất đa
dạng và phong phú, từ quan sát đơn giản cho đến các thiết bị hiện đại dựa trên cơ
sở kỹ thuật sinh học phân tử. Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh do
WSSV gây ra như:
– Dự chẩn: dựa vào dấu hiệu bên ngoài, làm tiêu bản ướt (wet-mounts).
– Kiểm tra khẳng định: kính hiển vi điện tử (TEM), lai tại chổ (In situ
hybridisation –ISH), PCR (Polymerase chain reaction), hóa mô miễn dịch
Trong đó, phương pháp chẩn đoán dựa vào dấu hiệu bệnh lý bên ngoài, TEM, hóa
mô miễn dịch, lai tại chổ ít được sử dụng trong chẩn đoán bệnh đốm trắng cho
tôm ở giai đoạn ấu trùng (larvae), hậu ấu trùng do những phương pháp này có hạn
chế về mặt chi phí và độ chính xác.
2.3.6 Một số kết quả nghiên cứu dịch tể về bệnh đốm trắng
WSSV là một trong những virus gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm biển trên thế
giới. Vì vậy, WSSV đã làm cho không ít nhà khoa học tham gia vào nghiên cứu
dịch tể học phân tử của virus gây bệnh WSSV. Và đã đạt được nhiều thành tựu
quan trọng. Hiện nay, trình tự bộ gen của WSSV đã được giải mã và cho thấy
WSSV là một trong những virus với acid nhân là ADN có kích thước lớn. So
sánh trình tự cả bộ gen của 3 dòng WSSV phân lập trên tôm từ Thái Lan, Đài

Loan và Trung Quốc cho thấy sự tương đồng của 3 dòng WSSV là 99,32% và xác
định được một số vùng có trình tự lặp lại thuộc ORF75, ORF94 và ORF125. Đây
là một trong những ORFs được sử dụng để phân tích sự khác nhau và các dòng
đặc trưng của WSSV (Pradeep et al., 2007).
ORF75 ở tất cả những WSSV được phân lập thì vùng ORF75 có 2 loại trình tự
lặp lại (repeat units- RUs), với kích cỡ là 102bp và 45bp. Trong đó, 45 nucleotide
đầu tiên của trình tự lặp lại 102 bp giống với trình tự lặp lại 45bp. Đối với ORF94
vùng lặp lại có kích thước là 54 bp, vùng lặp lại thuộc ORF125 có kích thước là
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
69 bp (Bui Thi Minh Dieu , 2004). ORF75 và ORF94 đều mã hóa cho đoạn
protein chỉ hiện diện trong virion của WSSV, vùng lặp lại của 2 ORFs này mã
hóa cho đọan protein có trình tự như sau: đầu tiên là arginine hoặc lysine, tiếp
theo là 2 alanine, đến 2 hoặc 3 proline sau đó là một dãy các acid amimo acid
(aspartate, glutamate) (Bui Thi Minh Dieu , 2004). Còn ORF125 có trình tự lặp
lại là 69 bp (Bui Thi Minh Dieu , 2004).
Ở Thái Lan Wongteerasupaya et al (2003) đã phân tích 65 mẫu tôm từ 55 ao để
xác định số lần lặp lại của trình tự lặp lại thuộc ORF94. Nghiên cứu đã phát hiện
như sau: trình tự lặp lại thuộc ORF94 có số lần lặp lại nằm trong khoảng 6 đến 20,
trong đó các mẫu có 8 vùng lặp lại chiếm đa số (32%).
Ở Việt Nam vào năm 2004, Bui Thi Minh Dieu et al cũng nghiên cứu về vùng lặp
lại thuộc ORF94 (6 ao ở miền Trung, 2 ao ở miền Nam). Kết quả được ghi nhận
như sau: số vùng lặp lại thuộc ORF94 của tôm bị bệnh đốm trắng ở Việt Nam
nằm trong khoảng 7 đến 17 vùng. Tiếp theo, năm 2006 Lê Vân Hải Yến đã khảo
sát vùng lặp lại thuộc ORF94 ở 2 tỉnh Trà Vinh và Sóc Trăng. Kết quả nghiên cứu
đã xác định ở Trà Vinh số vùng lặp lại thuộc ORF94 chỉ có 3 nhóm là: 5, 8, 9 còn
ở Sóc Trăng thì có số vùng lặp lại thuộc ORF94 là 5, 7, 8, 12. Trong đó các mẫu
có 8 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất (50% ở Sóc Trăng và 57,1% ở Trà Vinh).
Kế tiếp là nhóm tác giả Trần Thị Tuyết Hoa đã khảo sát 169 mẫu tôm bệnh đốm
trắng thu từ 19 ao ở Cà Mau, Bạc Liêu đã ghi nhận: ở ao nuôi tôm Bạc Liêu số

trình tự lặp lại thuộc ORF94 trên bộ gen của WSSV là từ 4 đến 16 vùng; trong đó
kiểu gen WSSV với 5 vùng lặp lại chiếm tỉ lệ cao nhất (48.8%) (Trần Thị Tuyết
Hoa và ctv, 2008). Vào năm 2008, Lý Ngọc Hà cũng khảo sát sự biến đổi của
trình tự lặp lại thuộc ORF94 của WSSV trên tôm tại Bạc Liêu và được ghi nhận
là số vùng lặp lại thuộc ORF94 gồm 6 nhóm là: 4, 6, 7, 8, 9, 12. Trong đó, kiểu
gen WSSV với 7 vùng lặp lại thuộc ORF94 chiếm tỉ lệ cao nhất (34,48%). Đặc
biệt là có sự nhiễm đa dòng WSSV trong cùng một ao, và kiểu gen WSSV đang
tồn tại ở Bạc Liêu là rất đa dạng. Còn ở Cà Mau có 3 nhóm vùng lặp lại thuộc
ORF94 trên bộ gen WSSV, từ 5 đến 9 vùng lặp lại (Trần Thị Tuyết Hoa và ctv,
2008).
Ở Ấn Độ, vùng lặp lại thuộc ORF94 có 13 kiểu gen được tìm thấy với số lần lặp
lại từ 2 đến 16, trong đó số lần lặp lại 7 lần là phổ biến nhất chiếm 11,3%, trong
những mẫu phân tích không có mẫu nào có số lần lặp lại là 11, 15 (Pradeep B,
2007). Vì vậy có thể nói rằng số vùng lặp lại thuộc ORF94 trên bộ gen WSSV ở
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
các thời điểm thu mẫu và ở các khu vực địa lí khác nhau thì khác nhau (Trần Thị
Tuyết Hoa và ctv, 2008).
Còn ORF125, ở Ấn Độ có 11 kiểu gen khác nhau được tìm thấy với số lần lặp lại
từ 2 đến 14, số lần lặp lại được tìm thấy nhiều nhất là 7 lần chiếm 47,1%, không
tìm thấy mẫu nào có số lần lặp lại 6 lần hoặc 13 lần (Pradeep B, 2007). Bui Thi
Minh Dieu et al đã khảo sát vùng lặp lại ORF125 vào năm 2004 đã ghi nhận như
sau: vùng lặp lại thuộc ORF125 có 3 kiểu gen được tìm thấy với số lần lặp lại từ 5
đến 7. Ở Bạc Liêu được vùng lặp lại thuộc ORF125 có 3 nhóm là: 5, 6 và 7.
Trong đó, kiểu gen WSSV với 6 vùng lặp lại thuộc ORF125 chiếm tỉ lệ cao nhất
(67,9 %) (Lý Ngọc Hà, 2008).
Đối với ORF75 khi Bui Thi Minh Dieu et al ( 2004) phân tích 8 ao tôm bị bệnh
đốm trắng ở Việt Nam (6 ao ở miền Trung, 2 ao ở miền Nam) tìm thấy 3 kiểu gen
khác nhau của vùng lặp lại ORF75 là 5, 6, 14. Theo Pradeep B (2007) ở Ấn Độ
vùng lặp lại thuộc ORF75 có 6 kiểu gen. Trong đó các mẫu có cùng số lần lặp lại

trên một ORF thì có số lần lặp lại không giống nhau trên một hoặc cả hai ORF
khác.
Từ những kết quả trên cho thấy cả 3 ORFs trên đều có ý nghĩa quan trọng trong
nghiên cứu dịch tể học của virus đốm trắng. Trong 3 ORFs trên thì ORF94 có vai
trò lớn nhất trong nghiên cứu dịch tể học, tiếp theo là ORF125 và ORF75
(Pradeep B, 2007).
2.4. Kỹ thuật PCR và các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
2.4.1 Nguyên tắc phản ứng PCR
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự
(Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã tạo nên một tác động to lớn đối với các
nhà nghiên cứu sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền trên toàn thế giới (Phạm
Thành Hổ, 2003).
Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của ADN polymerase trong quá trình tổng
hợp ADN mới từ mạch khuôn. Tất cả các ADN polymerase đều cần những mồi,
là những đoạn ADN ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch
khuôn. Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của ADN
polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh. Một phản ứng PCR là một
chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước, mỗi bước kéo dài
khoảng vài chục giây đến vài phút, trình tự như sau :
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15

Bước 1: Biến tính (denaturation) nhiệt độ được nâng lên khoảng 94
0
C để làm biến
tính ADN từ dạng sợi đôi (dsADN) thành sợi đơn (ssADN).
Bước 2: Bắt cặp (anealing) trong bước này nhiệt độ trong buồng PCR hạ xuống
nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi, các đoạn mồi (primer) bắt cặp
theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi nucleic acid đích, đây là giai đoạn
quyết định nên tính đặc hiệu của sản phẩm PCR.

Bước 3: Kéo dài (extension) trong giai đoạn này nhiệt độ được nâng lên khoảng
72
0
C . Vì taq popymerase hoạt động tốt ở khoảng nhiệt độ là 70-72
0
C. Ở khoảng
nhiệt độ này, hoạt động đặc biệt của taq popymerase cao khoảng 150
nucleotide/giây/enzime (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Sự tổng hợp
này cần phải có sự hiện diện các deoxy nucleoside triphosphate (dNTPs).
Như vậy từ một số lượng N ADN đích ban đầu, sau n chu kỳ nhiệt, thử nghiệm
PCR đã tổng hợp được N.2
n
bản sao. Với một số lượng bản sao, hay còn gọi là
sản phẩm PCR (PCR product), chúng ta dễ dàng được phát hiện bằng phương
pháp điện di (Nguyễn Viết Khuê, 2006)
2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
ADN mạch khuôn: Theo Khuất Hữu Thanh (2003), trong kỹ thuật PCR khuôn
ADN có vai trò rất quan trọng, nó ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả của phản ứng
PCR. Phản ứng PCR tối ưu khi các đoạn mạch khuôn hoàn toàn tinh sạch, nhưng
khi các đoạn mạch khuôn không sạch có lẩn các protein thì hiệu quả sẽ giảm, nó
sẽ giảm theo tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của mạch khuôn ADN. Hàm lượng ADN
khuôn nằm trong khoảng 100 ng - 1 µg (Newton và Graham,1995 trích dẫn bởi
Trần Thị Mỹ Duyên, 2006).
Enzyme: Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng ADN mẫu và kích
thước phản ứng PCR.
Nồng độ Mg
2
+
: Nồng độ ion Mg
2+

tối ưu phụ thuộc vào loại ADN polymerase,
ADN khuôn và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã có sẵn 1 lượng
nhất định ion Mg
2+
).
Nồng độ dNTPs: Lượng dNTPs thường được sử dung ở nồng độ 20- 200 µM của
mỗi loại dNTPs. Nếu mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ dẫn tới lỗi sao
chép của ADN polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Việc tăng dNTPs
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
không làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố
khác.
Mồi (Primer): Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại của một
đoạn ADN đặc trưng. Mồi luôn luôn gắn với ADN khuôn ở đầu 3’ và ADN
polymerase kéo dài tổng hợp theo chiều 5’- 3’. Trình tự mồi, nhiệt độ gắn mồi và
nồng độ trong phản ứng PCR là nhân tố quyết định sự thành công của phản ứng
PCR. Khi chọn mồi cần tính toán đảm bảo Tm của mồi xuôi và mồi ngược không
chênh lệch nhau quá lớn. Trình tự ADN cần khuếch đại, là trình tự nằm giữa hai
mồi không nên quá 1 kb. (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Chu kỳ phản ứng: trong thực tế số chu kỳ của phản ứng PCR không vượt quá 40
chu kỳ cho một phản ứng. Vì phản ứng PCR diễn ra 2 giai đoạn. Giai đoạn đầu số
lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu. Sau đó hiệu quả
khuếch đại giảm do các nguyên nhân sau: (i) hoạt tính của enzyme polymerase
giảm theo thời gian ở nhiệt độ cao. (ii) Sự cạn kiệt của các thành phần phản ứng.
(iii) Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà kết hợp với nhau. (iv)
Sự xuất hiện của các sản phẩm phụ ức chế phản ứng (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
2.4.3 Ứng dụng của PCR
Phương pháp PCR được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: kiểm tra huyết thống,
chẩn đoán bệnh di truyền, tách dòng gen, gây đột biến điểm, phân tích mẫu DNA

cổ, xác định kiểu gen của các đột biến, so sánh mức độ biểu hiện của gen, nghiên
cứu quá trình tiến hoá phân tử , chọn giống vật nuôi, cây trồng ….
Ngoài ra, phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu sinh
học phân tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán…để phát hiện mầm bệnh, vi sinh
vật, virus, tạo đột biến gen và xác định các mối quan hệ họ hàng về di truyền của
các loài động vật và thực vật….Trong thủy sản PCR đã được áp dụng để chẩn
đoán bệnh, trong đó bao gồm: bệnh tôm: MBV, WSSV, YHV, TSV… (Viện
nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1, 2006).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm: phòng thí nghiệm của bộ môn Sinh Học và bệnh Thủy Sản, khoa
Thủy Sản, trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian thực hiện: 12/2008 – 5/2009.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu thí nghiệm
Mẫu tôm sú (31 mẫu) được thu từ các ao nuôi quãng canh ở Cà Mau, kích cỡ
trung bình từ 15-25 g/con.
3.2.2 Hóa chất thí nghiệm
– Dung dịch DTAB, CTAB, chloroform, cồn tuyệt đối, nước cất tiệt trùng…
– PCR buffer 5X, dNTPs 25 mM, MgCl
2
10mM, mồi ORF75-flank Forward,
ORF75-flank Reverse, taq ADN polymerase 5U/µl (Promega).
– Agarose, TAE 1X, ethidium bromide, dung dịch nạp mẫu, thang ADN (100bp
plus- Fermentas, 1kb plus- Invitrogen )
3.2.3 Dụng cụ thí nghiệm

– Dụng cụ chiết tách: que nghiền, đầu col (xanh, vàng), pipet (1000µl, 200µl),
ống eppendorf, máy vortex, máy ly tâm, máy ủ, tủ hút…
– Dụng cụ khuếch đại: đầu col (xanh, vàng), pipet, ống eppendorf, tủ hút, máy
ly tâm, máy vortex, máy PCR…
– Dụng cụ điện di: đầu col vàng, pipet, lò vi sóng, bồn điện di, máy chụp hình
gel…


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
18
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Qui trình phát hiện WSSV: thực hiện theo qui trình hướng dẫn của công
ty Farming IntelliGene Technology Corporation, Đài Loan (kit IQ2000- WSSV)
Ly trích ADN: ADN được ly trích từ mang tôm sú với bộ chiết tách là DTAB –
CTAB.
– Chuẩn bị mẫu: cho khoảng 20mg mang tôm vào ống eppendorf (1,5ml) chứa
600µl dung dịch DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền tiệt trùng.
– Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 75
0
C trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
– Lắc đều mẫu, ly tâm nhẹ, sau đó thêm 700µl chloroform, lắc đều 20 giây nữa
và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
– Chuyển phần dung dịch ở trên sang ống eppendorf 1,5ml mới, thêm 100µl
dung dịch CTAB và 900µl nước cất, lắc đều, sau đó ủ ở 75
0
C trong 5 phút.
– Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
– Cẩn thận rút bỏ phần dung dịch trong ở trên, hòa tan phần còn lại bằng 150 µl
dung dịch hòa tan, ủ ở 75
0

C trong 5 phút, sau đó làm lạnh ở nhiệt độ phòng.
– Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Chuyển phần dung dịch trong phía trên
sang ống eppendorf 0,5ml mới có chứa 300µl ethanol 95%.
– Voxter trộn mẫu, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó rửa sạch ADN
bằng cồn 70
0
, để lắng xuống, làm khô và hoà tan trong dung dịch đệm TE. Trữ
ADN ly trích ở -80
0
C.
Qui trình khuếch đại
– Chuẩn bị các chất phản ứng
Bước 1 : 8μl/phản ứng, bao gồm các chất
- First PCR PreMix 7,5μl
- IQzyme DNA Polymerase 2U/μl 0,5μl
Bước 2: 15μl/ phản ứng, bao gồm các chất
- Nested PCR Premix 14μl
- IQzyme DNA Polymerase 2U/μl 1μ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version