Phân tích nguy cơ của các hệ thống marker chọn lọc sử dụng trong công nghệ tạo cây GM và các chiến lược cải tiến

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
&
TIỂU LUẬN
AN TOÀN SINH HỌC
Chuyên đề: “Phân tích nguy cơ của các hệ thống marker chọn lọc sử dụng trong
công nghệ tạo cây GM và các chiến lược cải tiến”
Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thị Phương Thảo
Sinh viên thực hiện: nhóm 5 Dương Thùy Anh 550317
Phạm Thị Lan Anh 550319
Tạ Thị Bé 550320
Đồng Huy Bình 550321
Hà Nội, 03/2013
MỤC LỤC
I. ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………….
…………………3
II. NỘI DUNG…………………………………………………………………….
…………3
1. Marker chọn lọc là gì? ……………………………………………………………… 3
2. Tại sao phải dùng marker chọn lọc……………………………………………………4
3. Một số marker chọn lọc được sử dụng……………………………………………… 4
4. Các nguy cơ của hệ thống marker chọn lọc………………………………………… 6
5. Các chiến lược cải tiến……………………………………………………………… 7
5.1. Phát triển hệ thống marker chọn lọc mới……………………………………….7
5.2. Các cơ chế loại bỏ marker ra khỏi hệ gen………………………………………7
5.2.1. Dựa vào hệ thống tái tổ hợp của vi khuẩn……………………………… 7
5.2.2. Dựa trên hệ thống các yếu tố chuyển vị………………………………… 9
5.2.3. Dựa trên hệ thống đồng biến nạp……………………………………… 10
5.2.4. Tái tổ hợp tương đồng……………………………………………………11
5.3. Chuyển gen vào lục lạp……………………………………………………… 12
III. KẾT

LUẬN………………………………………………………………………………13
IV. TÀI LIỆU THAM
KHẢO……………………………………………………………….13
2
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crop - GMC) là những cây mà vật liệu di
truyền của chúng được biến đổi theo ý muốn chủ quan của con người nhờ những công
nghệ sinh học hiện đại, hay còn gọi là công nghệ gene.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ, GMC cũng trở thành chủ đề gây tranh cãi trên phạm vi
toàn cầu. Thực tế cho thấy GMC mang đến nhiều lợi ích - như làm tăng nguồn cung
lương thực và giảm chi phí sản xuất, bảo tồn đa dạng sinh học, tiêu diệt sâu hại, tăng thu
nhập cho người nghèo, giảm tác hại của hoạt động sản xuất nông nghiệp đối với môi
trường, hạn chế tác hại của biến đổi khí hậu…
Song một bộ phận giới khoa học lo ngại chúng có thể gây nên những nguy mà con người
chưa biết - như tăng nguy cơ dị ứng, làm nhờn kháng sinh, gây độc cho cơ thể người…
 Vì vậy chúng tôi thực hiện chuyên đề này nhằm phân tích các nguy cơ mà hệ thống
marker chọn lọc sử dụng trong công nghệ tạo cây GMC có thể mang lại và đề ra một
số chiến lược cải tiến đối với hệ thống này.
II. NỘI DUNG
1. Marker chọn lọc là gì?
Marker chọn lọc là các gen mà khi được chuyển vào sinh vật sẽ bảo vệ sinh vật khỏi tác
nhân chọn lọc mà trong điều kiện bình thường nó làm chết hoặc ngừng sinh trưởng của tế
bào. Marker chọn lọc sẽ giúp ta phân biệt các tế bào đã được chuyển nạp gen với các tế
bào chưa được chuyển nạp.
Các marker chọn lọc chủ yếu thuộc 2 nhóm chính: kháng kháng sinh và kháng thuốc diệt
cỏ.
- Marker kháng kháng sinh gồm các nhóm:
• Nhóm chống lại sự ức chế quá trình tổng protein: aminoglycoside modyfing
enzyme (các gene nptII, aphIV, gen mã hóa SPT), chloramphenicol
acetyltransferase (gene cat), streptothricin acetyltransferase (gene sat3)

• Nhóm kháng lại bleomycin (một loại glycopeptides có khả năng cắt sợi DNA ở vị
trí đặc hiệu) yếu tố nhảy của Tn5 của E.coli
• Nhóm kháng sulfonamide (chất ức chế quá trình tổng hợp acid folic) (gene sulI)
- Marker kháng thuốc trừ cỏ gồm các nhóm:
• Kháng thuốc trừ cỏ nhóm PPT (chất gây tích lũy độc amon cho thực vật) (gene
pat và gene bar)
• Kháng thuốc trừ cỏ nhóm glyphosphate (ức chế quá trình tổng hợp amino acid
thơm ở lục lạp) (gene gox và cp4 epsps)
• Nhóm kháng imidazolinone (các chất ức chế con đường chuyển hóa ALS) (gene
csr 1-1)
3
• Kháng thuốc trừ cỏ nhóm oxynil (ức chế quá trình vận chuyển điện tử loại 2)
(gene bnx)
• Kháng thuốc trừ cỏ nhóm gabaculine (gene hemL)
• Kháng chất cyanamide (gene cah)
2. Tại sao phải dùng marker chọn lọc
Không phải đa số các gen cần chuyển đều mã hóa cho các đặc điểm mà có thể dễ dàng
phát hiện. Marker chọn lọc là gen mã hóa cho 1 đặc điểm dễ phát hiện như kháng thuốc
trừ cỏ, kháng kháng sinh… Biến nạp gen mong muốn với marker chọn lọc sẽ giúp ta dễ
dàng phát hiện các cá thể đã được biến nạp, cá thể có khả năng kháng thuốc trừ cỏ hay
kháng kháng sinh tức là đã được biến nạp.
3. Một số marker chọn lọc được sử dụng
- Gen neomycin phosphotransferase II (nptII)
Gen nptII , xuất phát từ chủng E.coli K12 (Beck et al 1982), mã hóa cho enzyme 3'-
phosphotransferase aminoglycoside (APH (3 ') II hoặc nptII) sẽ bất hoạt kanamycin
và kháng sinh có cấu trúc liên quan như neomycin, paromycin, ribostamycin,
butirosin, gentamicin B, và geneticin G418, mà thông thường sẽ ức chế tổng hợp
protein.
Gen npt II dùng trong chuyển gen khoai tây
- Gen Hygromycin phosphotransferase (hph, HPT)

Các gen hph (viết tắt là HPT ) kháng kháng sinh hygromycin B. hph gen được phân
lập từ E.coli (còn gọi là APH(4) gen) và Streptomyces hygroscopicus ( APH (7) ).
Gen Hygromycin phosphotransferase mã hóa cho (hph) là enzym bất hoạt
hygromycin B. Gen phân lập từ E.coli được sử dụng nhiều hơn trong chuyển gen thực
vật.
4
- Một số marker chọn lọc khác
4. Các nguy cơ của hệ thống marker chọn lọc.
• Với con người:
• gây độc
Cây trồng biến đổi gen chứa các chất chống sâu bọ, diệt côn trùng,… các chất này
khi vào cơ thể có thể gây độc cho cơ thể
Cây trồng biến đổi gen chứa các gen lạ khi vào cơ thể có thể tạo các chất độc cho
cơ thể, gây rối loạn các quá trình sinh lý
• dị ứng
5
Gen mới được đưa vào cây trồng tạo ra các chất gây dị ứng với những người mẫn
cảm với chất đó
• Tăng tính kháng kháng của vi khuẩn
Marker gen là các gen kháng kháng sinh có thể chuyển sang vi khuẩn làm tăng tính
kháng kháng sinh của vi khuẩn đối với con người và động vật
• Tạo ra các loài cỏ kháng thuốc trừ cỏ
Các gen kháng thuốc trừ cỏ khi được chuyển vào cây trồng có thể chuyển sang các
loài họ hàng hoang dại của chúng, sang các loài cỏ dại làm tăng tính kháng thuốc trừ
cỏ của chúng.
Ví dụ tiêu biểu là cây cải dầu, cải dầu đã được biến đổi gen với ít nhất ba gen kháng
thuốc diệt cỏ khác biệt (trong đó hai gen là do chuyển gen và một gen từ đột biến), và
những cá thể của các giống này có thể trở thành một mối phiền toái trong nông
nghiệp bởi nếu muốn kiểm soát chúng, chúng ta cần một loại thuốc diệt cỏ mới.
• Tăng tính kháng của các loài sâu bệnh

Khi trồng cây trồng chuyển gen kháng sâu, gen này sẽ tạo các chất tiêu diệt sâu bệnh,
do đó các loài sâu có khả năng kháng lại chất này sẽ ko bị tiêu diệt. từ đó sẽ tạo ra các
cá thể kháng lại cây chuyển gen, làm tăng khả năng kháng của sâu bệnh với cây
chuyển gen.
• Với việc bảo vệ đa dạng sinh học:
• làm tăng khả năng gây độc của cây trồng biến đổi gen với các sinh vật không phải
mục tiêu.
• Các sản phẩm của cây chuyển gen ko chỉ tiêu diệt các loài sâu hại mà còn có nguy
cơ tiêu diệt cả các loài sinh vật không phải mục tiêu
• Cây trồng kháng sâu có khả năng tiêu diệt các loại côn trùng hữu ích khác như
ong, bướm, v.v
• Làm mất đi bản chất đa dạng sinh học của vùng sinh thái, ảnh hưởng đến các chu
trình sống và hệ sinh thái vi sinh vật đất.
5. Các chiến lược cải tiến.
5.1. Phát triển hệ thống marker chọn lọc mới.
Phát triển hệ thống marker dựa trên các nhóm chuyển hóa trung gian không độc, hệ
thống gen chọn lọc âm tính, các gen phát màu: GFP, Gus,…Đây là các marker an
toàn, không mang nguy cơ xấu đối với sức khỏe con người và không ảnh hưởng đến
môi trường.
5.2. Các cơ chế loại bỏ marker ra khỏi hệ gen.
5.2.1. Dựa vào hệ thống tái tổ hợp của vi khuẩn (Simple microbial recombinase-
based systems).
6
Cơ sở của phương pháp này dựa trên hoạt động của enzyme recombiase.
Enzyme này có khả năng nhận biết các vị trí có trình tự đặc hiệu và cắt chính
xác ở vị trí đó.
Khi chuyển gen gen mã hóa cho enzyme recombiase vào cây, nếu cây đã được
biến nạp gen mục tiêu và gen marker và ở 2 đầu gen marker này có trình tự
nhận biết của emzyme recombiase thì enzyme này sẽ cắt ở 2 đầu gen marker và
gen marker sẽ bị loại bỏ ra khỏi vị trí liên kết.

Cơ chế cắt bỏ được mô tả như hình sau:
Một số hệ thống tái tổ hợp:
• Hệ thống Cre / loxP. Nó bao gồm enzyme Cre recombinase và vị trí cắt
LoxP.
• Hệ thống resolvase / res. Enzyme cắt trong trường hợp này là resolvase. Vị
trí cắt tương ứng là chuỗi res.
• Hệ thống FLP / FRT đến từ một nấm men. Trong trường hợp này, trình tự
nhận biết là FRT, được nhận biết bởi enzyme recombinase FLP.
Trình tự các vị trí nhận biết của các enzyme recombiase:
7
5.2.2. Dựa trên hệ thống các yếu tố chuyển vị (transposon)
Các transposon là các trình tự di động, nó có khả năng tách ra và di chuyển đến
các vị trí khác trong genome. Do đó, hệ thống này được sử dụng trong việc tách
gen marker ra khỏi vị trí liên kết với gen mục tiêu.
Các transposon được cảm ứng bởi chất cảm ứng, khi có mặt chất này thì
transposon sẽ tách ra và di chuyển đến vị trí khác trong genome.
Trong phương pháp này, gen marker sẽ được đặt trong các yếu tố di động
transposon, khi có mặt chất cảm ứng, các transposon sẽ tách ra và di chuyển đến
vị trí khác, làm cho gen marker và gen mục tiêu không còn liên kết với nhau.
Qua di truyền, 2 gen này sẽ biểu hiện ở thế hệ sau một cách riêng rẽ và có thể
chọn được các cả thể chỉ mang gen mục tiêu.
Ví dụ: hệ thống Ac / Ds đã được sử dụng trong loại bỏ gen marker ở ngô. Ds là
các trình tự lặp lại có khả năng di chuyển nhờ vào sự cảm ứng của emzyme Ac
transposase mã hỏa bởi gen Ac.
• Các vector được thiết kế sao cho 2 trình tự Ds nằm ở 2 đầu gen marker và
nằm ngoài gen mục tiêu (PAT: gen kháng thuốc diệt cỏ)
• Các gen này sẽ được chuyển vào trong genome thực vật
8
• Gen Ac sẽ mã hóa tạo ra Ac transposase và tách đoạn trình tự tại 2 vị trí Ds
và đoạn trình tự này sẽ di chuyển đến vị trí khác trong genome

 Nhược điểm của phương pháp:
- Hiệu quả không cao
- Sự cắt bỏ thường không chính xác
- Di chuyển nhiều có thể dẫn đến đột biến
- Cần một thời gian dài vì phải chọn lọc thế hệ sau
 Do đó hệ thống này không được sử dụng nhiều trong việc loại bỏ gen
marker
5.2.3. Dựa trên hệ thống đồng biến nạp (Co-transformation systems)
Hệ thống này sử dụng cơ chế phân ly di truyền để loại bỏ gen marker ra khỏi
genome thực vật.
Trong phương pháp này, cả gen marker và gen mục tiêu sẽ được chèn vào 2 T –
DNA khác nhau và cùng nằm trên 1 Ti – plassmid của vi khuẩn A. Tumefaciens.
Khi vi khuẩn A. Tumefaciens xâm nhập vào cây, 2 T – DNA này sẽ được tích
hợp vào hệ gen thực vật. 2 T – DNA này chèn vào các vị trí ngẫu nhiên trong hệ
gen thực vật nên có khả năng 2 vị trí này là 2 vị trí không liên kết với nhau.
Thông qua giảm phân, 2 T – DNA chứa gen marker và gen mục tiêu sẽ được
phân ly và ở thế hệ sau sẽ cho ra các cá thể chỉ mang 1 trong 2 T – DNA, và có
thể chọn lọc các cá thể chỉ mang gen mục tiêu để sử dụng.
9
 Hệ thống này có nhược điểm:
- Hiệu quả thấp vì tỉ lệ 2 T-DNA chèn vào 2 vị trí không liên kết là rất
thấp
- Không sử dụng cho phương pháp nhân giống vô tính
5.2.4. Tái tổ hợp tương đồng (intrachromosomal recombination (ICR) system)
Phương pháp này dựa vào tác dụng của enzyme cắt giới hạn để cắt bỏ marker ra
khỏi NST.
Trong phương pháp này, 2 đầu của gen marker sẽ được gắn 2 trình tự cắt của 1
emzyme cắt giới hạn. Khi có mặt enzyme cắt giới hạn, nó sẽ cắt tại 2 vị trí này
tạo ra các đầu có trình tự bổ sung với nhau. 2 trình tự ở 2 đầu của gen marker sẽ
liên kết bổ sung với nhau tạo ra 1 đoạn DNA dạng vòng, tách ra khỏi NST, 2

đầu còn lại sẽ liên kết lại với nhau và không có mặt gen marker nữa.
10
 Ưu điểm của phương pháp:
- Tương đối đơn giản vì nó không đòi hỏi sự có mặt của enzyme tái tổ hợp
tương đồng
- Có thể được sử dụng cho nhân giống vô tính thực vật
 Nhược điểm:
- Tăng nguy cơ đột biến soma
- Ngoài ra,hoạt động trình tự attP và những cơ chế tương tự tái tổ hợp của
những trình tự này xảy ra trong các loài thực vật vẫn chưa hoàn toàn được
hiểu rõ
5.3. Chuyển gene vào lục lạp
Đây là 1 kỹ thuật mới cho phép biểu hiện gen ở lục lạp với ưu điểm là số lượng bản
copy của gene lớn, biểu hiện gene chuyển ở mức cao, dễ dàng kiểm soát biểu hiện
gene theo cấu trúc operon, nâng cao tính an toàn sinh học…
Tuy công nghệ này mới bắt đầu được nghiên cứu trên các mô hình như ở cây thuốc
lá, A.thaliana, nhưng nó mở ra một triển vọng mới trong kĩ thuật chuyển gene thực
vật.
• Ví dụ: thí nghiệm trên giống thuốc lá V2. Giống thuốc lá V2 khá nhạy cảm với kháng
sinh spectinomycin và streptomycin, ở nồng độ 80 mg/l, spectinomycin ức chế sư tái sinh
chồi từ mảnh lá và tạo cây con từ chồi nách, đối với streptomycin, ngưỡng này là 125
11
mg/l. Gen HIV-1 p24 và gen aadA đã được thực hiện vào lục lạp giống thuốc lá V2 thông
qua bắn gen, đây là gen kháng spectinomycin và streptomycin. Cây chuyển gen thu được
có khả năng kháng spectinomycin và streptomycin lên đến nồng độ 500 mg/l.
III. KẾT LUẬN
Cây trồng biến đổi gen là 1 thành tựu to lớn, có khả năng ứng dụng rộng rãi và đem lại
nhiều lợi ích về kinh tế, sức khỏe, môi trường…
Mặc dù hệ thống marker chọn lọc còn tồn tại nhiều nguy cơ đối với con người và môi
trường nhưng khi sử dụng các biện pháp cải tiến cũng như loại bỏ các marker trong cây

chuyển gen thì sẽ đem lại lợi ích rất lớn.
Cho đến nay vẫn chưa có bất cứ chứng cứ nào về việc marker chọn lọc gây nguy hại đến
con người cũng như môi trường.
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thùy Linh. Cây trồng công nghệ sinh học
2. Charles P. Scutt, Elena Zubko, Peter Meyer. Techniques for the removal of marker
genes from transgenic plants. 24 October 2002
3. />4. www.wikipedia.org
5. />3121/
6. />12