cấu trúc sinh học phân tử của hbv, ý nghĩa lâm sàng

CẤU TRÚC SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA HBV
Ý NGHĨA TRONG LÂM SÀNG
ĐẶNG THỊ NGA

DỊCH TỂ

LỊCH SỬ VỀ BỆNH VIÊM GAN DO VIRUS B
•
Hippocrate (thế kỷ thứ V trước công nguyên)
•
1898 được gọi là bệnh Botkin
•
1963 Bruch Blumberg đã tìm thấy một loại KT trong máu của bệnh
nhân bị haemophili đã được truyền máu nhiều lần. KT này phản
ứng lại với KN trong mẫu huyết thanh của một thổ dân châu Úc
(được gọi là KN Au - Australia antigen). Sau đó KN này được tìm
thấy trong huyết thanh bệnh nhân bị VGSV . Ngày nay KN Au được
xác định chính là KN bề măt của VGSV B, viết tắt là HBsAg
•
Năm 1970 Dane, J.Cameron và cộng sự đã phân lập được HBV
hoàn chỉnh gọi là tiểu thể Dane, và từ đây người ta phát hiện nhiều
dấu ấn khác của HBV như HBeAg, anti-HBe, HBcAg, anti-HBc

HBV
•
HBV thuộc họ
Hepadaviridae, là một loại
virus hướng gan có cấu trúc
DNA. Đây là một loại virus
gây bệnh cho người và một

số loài linh trưởng khác
•
Trong huyết thanh bệnh
nhân ở giai đoạn hoạt động
nhân đôi của virus, người ta
tìm thấy 3 hình dạng khác
nhau của virus
- Tiểu thể Dane (còn gọi là
virion hoàn chỉnh)
- Cấu trúc hình cầu
- Cấu trúc hình ống

•
HBV cá một phần vỏ với 3 loại
protein S,M,L (KN HBsAg)
•
Một phần nhân với
- Màng bọc protein gọi là capside
- Sợi đôi DNA
Phần nhân và màng bọc này gọi là
nucleocapsid (đủ thành phần để
cấu tạo một virion)
Cả phần vỏ và phần nucleocapside
tạo ra một virion thực sự
CẤU TRÚC BỘ GEN CỦA HBV

•
Bộ gen của HBV được cấu tạo
từ một phân tử DNA vòng, có
khoảng 3200 nucleotide (3,2

kb). DNA này bao gồm hai
chuỗi, có chiều dài khác nhau:
* Chuỗi dài nằm ngoài, (kí hiệu
là L) có tính cực âm (-), tạo nên
một vòng liên tục có chiều dài
cố định 3200 nucleotide và gần
như khép kín (3,2 kb) mã hoá
cho các thông tin di truyền của
siêu vi.
* Chuỗi ngắn nằm trong, (kí
hiệu là S) có tính cực dương
(+), chiều dài thay đổi từ 50-
100% chiều dài của bộ gen.
CẤU TRÚC BỘ GEN CỦA HBV

•
Đặc điểm DNA của HBV là ở chổ không phải xoắn 2 vòng như các DNA của các
virus khác mà chỉ xoắn một đoạn cuối và xếp thành hình tròn
•
DNA của HBV không sao chép thẳng thành một DNA của virus mới khi vào trong
tế bào gan, mà lại sao chép qua bước tạo ra 2 sợi mRNA nhờ RNA của tế bào kí
chủ
•
2 sợi mRNA này được gọi là tiền genome, chứa đựng toàn bộ thông tin di truyền
của virus. Từ 2 sợi mRNA này sẽ tổng hợp các thành phần của virion, và lúc
này thì virion lại có DNA polymerase để sao chép từ mRNA ra DNA của hệ gen
(tiến trình sao chép ngược). Như vậy DNA polymerase tác dụng như một men
sao chép ngược
•
Khi sợi DNA dài đã hình thành thì sợi mRNA cũng tự phá hủy. Quá trình nhân đôi

của sợi DNA được bắt đầu tại trình tự DR2 của sợi đầu và được tiếp tục nhờ
sự khép vòng của sợi DNA.
•
Sợi ngắn DNA có độ dài khác nhau do hoạt động của DNA polymerase, vì khi
phần capside được bao bọc sẽ làm gián đoạn hoạt động của DNA polymerase
CẤU TRÚC BỘ GEN CỦA HBV

•
Quy luật kinh điển là một
gen-một protein, nhưng ở
đây số lượng nucleoside
của HBV rất ít, chỉ 3200,
vì vậy các đoạn gen gối
chồng lên nhau ; người
ta đã xác định có 4 đoạn
gen kí hiệu là S, C, P, X.
CẤU TRÚC BỘ GEN CỦA HBV

TỔ CHỨC BỘ GEN HBV
•
Chỉ có sợi DNA (-) mới
được mã hoá. Trên sợi DNA
này có 4 đoạn gen tương
ứng với 4 khung dọc mở
(opening reading frame) là
các vùng mã hoá để tổng
hợp các protein của siêu vi
như protein bề mặt, protein
của lõi, polymerase và
protein X, qua trung gian

của các mRNA; có nhiều dài
thay đổi lần lượt là 2,1kb;
2,4kb; 3,5kb và 0,5 kb.

•
Gen pre-S1, pre-S2 và S: tổng
hợp protein của KN bề mặt
(HBsAg).
•
Gen pre-C và C: tổng hợp
protein của KN lõi (HBcAg và
HBeAg)
•
Gen X: tổng hợp Protein có tác
dụng chuyển hoạt hoá
(transactivation).
•
Gen P tổng hợp Polymerase
TỔ CHỨC BỘ GEN HBV

Gen S
•
Bao gồm vùng S, Pre-S1
và Pre-S2 mã hóa để tổng
hợp các protein bề mặt
hay HBsAg.
•
Vùng S và Pre-S2 có
chiều dài cố định trong khi
đó vùng Pre-S1 có chiều

dài thay đổi tùy theo từng
phân typ khác nhau
Gen S
Gen S

•
Gen S tổng hợp nên protein S (Small) có chiều dài 24kd gồm 226 acid amin.
Protein này gồm hai thành phần này là p24 và Gp27 (Glycoprotein) đây là
protein chủ yếu vì nó chiếm đa số
•
Đoạn S và Pre-S2 tổng hợp protein M (Medium) có chiều dài 33 kd gồm281 acid
amin. Protein này gồm hai loại Glycoprotein là Gp33 và Gp 36. Vùng Pre-S2 có
vai trò giúp cho siêu vi bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ nó liên
kết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh người, đồng thời trên
tế bào gan cũng có các thụ thể gắp với albumin trùng hợp trong huyết thanh
người pHSA (Polymerized Human Serum Albumin ). Nếu trên tế bào gan thiếu
các thụ thể này thì có thể làm cho tế bào gan có khả năng đề kháng với sự
nhiễm HBV.
•
Gen S, Pre-S1 và Pre_S2 tổng hợp protein L (Large) có chiều dài 39 kd gồm 2
loại p39 và Gp42. Chuỗi protein Pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy theo từng phân
typ khác nhau; đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt của tế bào gan
sẽ liên kết với siêu vi, giúp siêu vi xâm nhập vào trong tế bào.
Gen S

•
Cả 3 loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề
mặt của virion, trong đó Protein S chiếm đa số. Protein M chiếm 5
đến 10% và Protein L chiếm 20% trong vỏ bọc của virion
Protein bề mặt hay HBsAg

•
Nguời ta phát hiện vùng S có ít nhất 5
quyết định khàng nguyên của HBsAg.
Tùy theo sự phân bố của các quyết
định kháng nguyên này mà người ta
phân biệt ra các phân typ khác nhau.
•
Mỗi phân typ đều có chung phần
quyết định kháng nguyên a và khác
nhau tùy theo sự ghép cặp của các
quyết định kháng nguyên d hoặc y
ghép với w hoặc r để tạo nên các
phân typ như adw, ayw, adr, ayr.
•
Chính vùng a có liên quan đến tính
miễn dịch vì nó quyết định cho sự
tổng hợp Anti HBs
HBsAg
a
ay
adw adr ayw ayr
a1-2dw a3dw a1yw
ad
a3ywa2-3ywa2-1yw
Protein bề mặt hay HBsAg

Protein bề mặt hay HBsAg
HBsAg in Cytoplasm of
Ground Glass Hepatocytes

HBsAg

GEN C
•
Gen C gồm vùng C và pre-C
•
Nếu quá trình đọc mã thực hiện suốt chiều dài của đoạn pre-C và C sẽ tổng
hợp được HBeAg. Các nucleotide đầu tiên của vùng pre-C sẽ mã hóa cho
việc tạo nên một đoạn peptide tín hiệu. Đoạn peptide tín hiệu này giúp cho
HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào của tế bào gan, đồng thời
cũng giúp cho kháng nguyên này hòa tan được trong huyết thanh. Vì vậy
HBeAg được gọi là KN hòa tan. KN này không tham gia vào cấu trúc của
virion và chức năng của nó chưa được biết rõ. Sự hiện diện của HBeAg
phản ảnh tình trạng nhân đôi của siêu vi và có liên quan đến tính lây nhiễm
•
Nếu quá trình đọc mã chỉ đi suốt đoạn C thì sẽ tổng hợp nên KN lõi hay còn
gọi là HBcAg. HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu nên nó không được
bài tiết ra khỏi tế bào gan, do đó không thể tìm thấy trong huyết thanh bệnh
nhân

HBcAg
HBcAg in Nuclei and Cytoplasm
HBcAg
HBcAg

GEN P
•
Gen P chiếm 80% chiều dài của bộ gen
•
Sản phẩm của gen P là một men vừa có

hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc RNA,
vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ
thuộc DNA
•
DNA polymerase được dùng để tổng hợp
một DNA mới từ RNA tiền genome (sợi
RNA này được tạo ra từ khuôn mẫu DNA
của HBV dưới tác dụng của RNA
polymerase của tế bào gan)
•
Như vậy sản phẩm của gen P liên quan đến
cơ chế sao chép ngược của virus, và tham
gia một phần vào việc tạo ra capside bao
bọc bên ngoài cấu trúc của tiền genome

Cấu trúc và chức năng của
Polymerase
•
Gen P mã hóa để tổng hợp polymerase của virus. Men này có đặc tính
tương tự như các men sao chép ngược khác.
•
Cấu trúc của polymerase bao gồm:
Ở đầu N-tận của polymerase của virus có một acid amin là Tyrosin
tương đối hằng định, được sử dụng làm chất mồi (primase) để khởi
phát quá trình tổng hợp DNA của virus
Tiếp theo là vùng “khoảng trống” (Spacer) có trình tự rất thay đổi, nó
giúp cho men này không thay đổi chức năng khi có đột biến xãy ra.
Kế đến là vùng có hoạt tính của men sao chép ngược, bao gồm một
trình tự các a.amin tương đối hằng định đó là Tyrosin-Methionin-
Asparagin-Asparagin. Trình tự này có lẽ là vị trí xúc tác của men sao

chép ngược
Ở đầu C-tận là vùng của men Ribonuclease H (RNase H), có chức
năng làm thoái biến khuông RNA trong lúc tổng hợp sợi DNA(-)

GEN X
•
Chức năng của gen này vẫn chưa được biết chính xác, nhưng có lẽ
nó đóng vai trò chuyển hoạt hóa (transactivation) trong quá trình
nhân đôi của virus. Sự chuyển hoạt hóa như vậy có thể làm tăng sự
nhân lên của HBV và cả những virus ngoài HBV như HIV
•
Protein X còn có liên quan đến sự điều hòa quá trình tăng trưởng
của tế bào, cho nên có vai trò trong cơ chế sinh ung thư của tế bào
gan bị nhiễm

SỰ ĐỘT BIẾN GEN CỦA HBV
•
Kỹ thuật PCR giúp cho các nhà khoa học phát hiện các biến đổi trên trình
tự chuỗi DNA của bộ gen HBV
•
Sự đột biến gen của HBV có lẽ là hậu quả của 2 yếu tố
Tốc độ nhân đôi của HBV khá nhanh
Khả năng đọc và sữa chữa trong quá trình nhân đôi của bộ gen không
hoàn chỉnh: virus sử dụng DNA polymerase trong suốt quá trình nhân
đôi nhưng men này lại thiếu chức năng sữa chữa trong khi sao chép

Biến chủng Pre-C
•
Đoạn gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên HBeAg
•

Một số trường hợp xãy ra đột biến ở vùng pre-C tại vị trí nucleotide 1896,
Guanosin được thay thế bằng Adenin tạo nên một trình tự TAG (thay thế
TGG). TAG là một codon kết thúc. Chính codon kết thúc này chấm dứt việc
giải mã vùng pre-C, cho nên sự tổng hợp HBeAg không được thực hiện
mặc dù quá trình nhân đôi của HBV vẫn tiếp diễn ( HBV DNA (+), AND
polymerase (+) ), và sự tổng hợp HBcAg vẫn không ảnh hưởng nên vẫn
tạo được phần lõi.
•
HBeAg và HBcAg có chung vùng “quyết định miễn dịch” chính, cho nên
antiHBe vẫn được thành lập mặc dù không có sự hiện diện của HBeAg.
Đột biến này có liên quan đến điều trị bằng interferon

•
Việc tồn tại kéo dài của HBV biến chủng pre-C trong máu bệnh
nhân thường làm tăng men gan và các biến chứng khác như xơ
gan, Kgan, hoặc nguy cơ viêm gan bùng phát (cơ chế có lẽ do đáp
ứng miễn dịch nhanh và mạnh của kí chủ đối với HBV nhằm thải trừ
HBV thông qua sự phá hủy tế bào gan bị nhiễm ồ ạt)
Biến chủng Pre-C

•
Biến chủng này có liên quan đến những trẻ em được sinh ra từ những bà
mẹ mang HBV.Nghiên cứu trên 345 trẻ của các bà mẹ có HBsAg(+) và
HBeAg(+), mặc dù sau khi sinh ra những đứa trẻ này đươc chích miễn dịch
thụ động và chủng ngừa vaccin viêm gan B đầy đủ 3 mũi (24giờ, 1tháng,
2tháng),vẫn có 41 trẻ bị nhiễm HBV mặc dù antiHBs(+)
•
Dùng phương pháp PCR để khảo sát chuỗi gen của HBV ở những đứa trẻ
này người ta thấy có một điểm đột biến trên vùng quyết định KN “a” của
HBsAg so với HBsAg mẹ. Vùng thường xãy ra đột biến là ở vị trí a.amin

145. Đây là trường hợp chủng ngừa thất bại.
•
Đột biến trên gen S còn tạo ra các phân typ HBsAg khác nhau
Biến chủng trên vùng HBsAg

Biến chủng trên vùng HBsAg