CNSHDV: Tương tác protein

CEMINAR
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT
TƯƠNG TÁC PROTEIN
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ỨNG DỤNG
Protein 1 Protein 2
Thực hiện: HOÀNG HỮU TÌNH
Lớp: ĐỘNG VẬT K17
MỞ ĐẦU
•
Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành
từ rất nhiều các đơn phân là các axit amin.
•
Trong tế bào động vật, protein có vai trò hết sức
quan trọng. Chúng tham gia cấu trúc của tế bào, là
những enzym xúc tác cho các quá trình sinh lí sinh
hóa xảy ra trong tế bào, protein còn tham gia các
quá trình vận chuyển, bảo vệ, điều khiển, là nơi dự
trữ chất dinh dưỡng, nhận biết các lọai phân tử
khác nhau, ch_u trách nhiệm về sự vận động của
động vật ` mức tế bào và cơ thể Các chức năng
này có thể do một hoặc nhiều phân tử protein đặc
hiệu đảm nhiệm. Sự tương tác giữa các protein
chính vì thế rất quan trọng đối với các hoạt động
sống của tế bào.
“Tương tác protein, phương pháp
nghiên cứu và ứng dụng”.
•
Tương tác protein có thể diễn ra giữa các protein
với nhau hoặc cũng có thể giữa phức hợp protein
với các chất khác trong tế bào. Sự tương tác này

tác động đến các hoạt động của tế bào dẫn đến
những biểu hiện ra bên ngoài của cơ thể sống.
•
Nghiên cứu tương tác protein có ý nghĩa quan
trọng nhằm xác đ_nh chức năng và sự tham gia
của chúng vào một hay nhiều hoạt động sống cụ
thể như quá trình phân chia tế bào, sao chép
DNA, tổng hợp protein hay vận chuyển tín hiệu.
1. Tương tác protein
•
Tương tác protein
là quá trình tác
động qua lại giữa
các protein với
nhau hoặc giữa
các protein với
các phân tử khác
trong tế bào ảnh
hư`ng đến các
hoạt động sống
trong tế bào và
ảnh hư`ng đến
quá trình sống
của động vật.
Protein 1 Protein 2
Hình 1. Tương tác protein-protein
NỘI DUNG
- Mạng tương tác protein
•
Việc tìm hiểu tương tác của

các protein là 1 trong những
vấn đề quan trọng trong sinh
học.
•
Các thí nghiệm thực tế cho
thấy các protein thể hiện chức
năng khi tương tác với nhau.
•
Tập hợp các tương tác của
protein được gọi là mạng
tương tác protein-protein
(protein-protein interactions -
PPIs).
•
Mạng PPIs thường được biểu
diễn bằng một đồ th_ mà mỗi
cạnh là một protein và mỗi
đỉnh là một tương tác.
Hình 2. Một mạng tương tác
protein-protein
•
Ngày nay, dữ liệu về protein và tương tác giữa
chúng của các cơ thể sống rất nhiều, và được
bổ sung thường xuyên b`i các phòng thí
nghiệm trên toàn thế giới.
•
Ví dụ dữ liệu về loài Yeast có khoảng hơn 6.000
protein và hơn 12.000 tương tác [Natasa Przulj
2003] Nhưng lượng dữ liệu này vẫn được bổ
sung hàng ngày.

•
Việc tìm hiểu cấu trúc mạng tương tác giữa các
cơ thể sống khác nhau đang được nhiều nhà
khoa học quan tâm, vì khi so sánh các mạng
tương tác này có thể tìm ra được những đặc
điểm chung giữa các loài hoặc tìm ra được vai
trò của các protein trong một cơ thể sống.
II. Phương nghiên cứu tương tác protein
Phương pháp:
•
Protein nghiên cứu được cố
đ_nh trên một chất mang (ví
dụ: Agarose, Sephadex).
•
Sau đó mẫu chứa protein
tương tác được cho đi qua
cột và chúng b_ giữ lại.
•
Các protein bám này được
tách ra khỏi cột bằng các
dung d_ch thích hợp như:
SDS, muối NaCl, dung môi
hữu cơ.
•
Người ta đã sử dụng phương
pháp này để tách các protein
tương tác với RNAaza từ 25
năm trước đây.
2.1. Sắc kí ái lực (Affinity chromatography)
protein

ligand
Hình 3. Phương pháp sắc kí ái lực
2.2. Kết tủa miễn d_ch (Immunopricipitate)
•
Phương pháp kết tủa miễn d_ch dựa vào
phản ứng kháng nguyên với kháng thể.
•
Ở đây người ta dùng chất mang
(Sepharose) gắn với protein A tương tác
với kháng thể để kết tủa phức hệ kháng
nguyên - kháng thể đồng thời kéo theo
các protein khác tương tác với protein
nghiên cứu.
•
Các protein kết tủa cũng sẽ được tách ra
để nghiên cứu.
2.3. Tạo liên kết chéo (Cross-linking)

•
Với phương pháp này thì liên kết chéo
giữa các protein tương tác với nhau nhờ
một tác nhân (ví dụ gluceraldehite). Sau
đó phức hệ được tách ra và dùng điện di
hai chiều phân tích để phát hiện khả năng
hai protein có tương tác với nhau hay
không.
2.4. Sử dụng kỹ thuật di truyền (Using
genetic engineering): hệ thống lai kép
(Two hybride system).
•

Năm 1989, Stan Field lần đầu tiên giới thiệu
phương pháp sử dụng kỹ thuật di truyền để
nghiên cứu tương tác protein có tên là hệ
thống lai kép (Two hybride system).
•
Phương pháp này có nhiều ưu việt hơn hắn các
phương pháp khác. Đặc biệt là độ chính xác và
độ nhạy cao mà không phương pháp nào có thể
đạt được.
2.4. Sử dụng kỹ thuật di truyền
Nguyên lý của phương pháp :
•
Việc hoạt động của promotor cho gen “báo cáo”
(reporter genes) phụ thuộc vào hai nhân tố phiên
mã:
- Nhân tố hoạt hoá promotor AD (Activation
Domain)
- Nhân tố bám vào sợi ADN để cho ARN polymeraza
bắt đầu quá trình phiên mã BD (DNA Binding
Domain).
•
Như vậy khi có mặt cả hai nhân tố AD và BD thì quá
trình phiên mã và d_ch mã của gen ‘báo cáo” xảy ra,
còn khi chỉ có một trong hai nhân tố trên thì sản
phẩm của gen ‘báo cáo” không được tổng hợp.
2.4. Sử dụng kỹ thuật di truyền
Phương pháp:
•
Người ta tách gen mã hoá cho hai nhân tố và gắn
vào hai vectơ tách dòng riêng rẽ. Muốn nghiên cứu

tương tác protein X và Y người ta tiến hành tách
dòng gen mã hoá cho hai protein này và lần lượt
gắn vào hai vectơ AD và BD. Sau đó hai vectơ cùng
được biến nạp vào dòng tế bào biểu hiện gen.
•
Kết quả là tạo ra các protein lai ( fussion protein)
AD-X và BD-Y. Nếu hai protein X và Y có tương tác
với nhau thì cả AD và BD cùng hoạt hoá promotor
và sản phẩm của gen “báo cáo” được phát hiện.
Ngược lại, nếu hai protein X và Y không tương tác
với nhau thì tác động của chúng đối với promotor
là riêng rẽ do đó không có sản phẩm của gen “báo
cáo”.
(a) Phức hệ
phiên mã
gồm AD và
BD
(b) Sử dụng
phức hệ
phiên mã để
nghiên cứu
tương tác hai
protein X và
Y
Hình 2: Cơ s` phân tử của hệ thống lai kép
•
Phương pháp lai kép được ứng dụng rộng rãi
để nghiên cứu tương tác protein trong một số
trường hợp sau:
- Nghiên cứu tương tác hai protein.

- Nghiên cứu tương tác giữa các đoạn peptit chức
năng (domain) khác nhau của một protein với
các protein khác.
- Nghiên cứu sàng lọc (screening) từ thư viện
gen để tìm kiếm các protein tương tác với một
protein đã biết.
III. Ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế
bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein
tương tác với photphataza (TTP30)
3.1. Vật liệu và dòng tế bào dùng cho nghiên cứu
-
Thư viện gen (cDNA library) của Arabidopsis,
Viện CNSH thực vật, ĐHTH Munich. Đức.
-
Plasmit pGBT9 mang Gal4-BD và Trp và
Plasmit pGAD424 mang Gal4-AD và Leu.
-
Dòng tế bào nấm men HF7C khuyết dưỡng
Leu., Trp., và His., thư viện gen (cDNA library)
của Arabidopsis đã được gắn vào plapsmit
pGAD424 mang gen Leu. (Công ty clontech,
USA) cung cấp.
Hoá chất dùng cho nghiên cứu
+ Sử dụng các cặp mồi dùng để tách dòng gen TTP30 và
gắn vào vectơ pGBT9 như sau: F1, R1; F2; R2 và F3.
+ Các hoá chất khác dùng cho nghiên cứu đạt độ tinh
khiết cho sinh học phân tử từ các nhà sản xuất Meck,
Sigma.
+ Điều kiện phản ứng PCR: Hỗn d_ch phản ứng 25
microlit: dNTP: 0,25 microMol., đệm tris: pH:8.0 10

mM, MgCl2:1mM, DNA mồi (primer) 50ng, DNA khuôn
(template) 10-20ng), 94
o
C: 45s, 55
o
C: 45s,72
o
C : 45s.
Số chu kỳ lặp lại: 35.
III. Ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế
bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein
tương tác với photphataza (TTP30)
•
Kỹ thuật:
-
Sử dụng cá kỹ thuật di truyền như: tách, tinh
sạch DNA, cắt với enzim giới hạn, gắn vào
vectơ và biến nạp E.coli theo các phương pháp
mô tả của Maniats.
-
Biến nạp vào nấm men theo phương pháp của
Lithium acetat.
-
Các kỹ thuật phát hiện dòng tế bào biến nạp
trên môi trường chọn lọc và sản phẩm của gen
chỉ th_ theo chỉ dẫn của Clontech.
III. Ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế
bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein
tương tác với photphataza (TTP30)
Các bước thực hiện và kết quả

- Thu nhận dòng gen mã hoá cho TTP30 bằng kỹ
thuật PCR
Gen TTP30 đã được nghiên cứu tại Viện CNSH
thực vật, ĐHTH Munich. Kết quả nghiên cứu cho
thấy sản phẩm của gen là protein có hai nhóm
chức năng phân biệt là v_ trí bám vào photphat:
PB(435 bps) và v_ trí có độ lặp lại cao của 4 axit
amin TPR (550bps). Với mục đích tìm hiểu các
protein tương tác với gen TTP30 cũng như với
từng đoạn peptit PB và TPR người ta đã dùng
phản ứng PCR để thu được các đoạn gen mong
muốn.
III. Ứng dụng kỹ thuật hệ thống lai kép với tế
bào chủ là nấm men để nghiên cứu các protein
tương tác với photphataza (TTP30)
•
Khi dùng cặp mồi F1 và R1, nhận được gen đầy đủ chứa cả
hai v_ trí PB và TPR (1050 bps) và khi dùng các cặp mồi F2,
R2 và F3, R1 sẽ thu được các phần gen riêng biệt cho PB và
TPR. Kết quả điện di sản phẩm PCR được trình bày ` hình3.
Hình 3: Sản phẩm PCR của gen TTP30 và các đoạn PB,TPR.
Gắn sản phẩm PCR vào vectơ pGBT9 và biến nạp
vào dòng tế bào nấm men HF7C.
Các đoạn mồi đều mang v_ trí cắt
của enzim giới hạn SmaI. Người ta đã
tiến hành cắt riêng rẽ các sản phẩm
PCR và vectơ pGBT9 với SmaI. Sản
phẩm PCR và vectơ tinh sạch lại được
gắn với nhau nhờ ligaza (MPI) và
được biến nạp vào E.coli (DH5anpha).

Sau đó nuôi cấy E.coli chứa plasmit
pGBT9 mang các đoạn gen nghiên
cứu , tiến hành tách plasmit và biến
nạp vào dòng tế bào nấm men HF7C.
Trên môi trường chọn lọc khuyết
dưỡng triptophan người ta thu được
dòng tế bào biến nạp. Sử dụng kỹ
thuật PCR để kiểm tra các đọan gen
đã được gắn vào vectơ pGBT9, kết
quả kiểm tra được trình bày ` hình 4.
Hình 4: Kết quả kiểm tra
bằng PCR các đoạn gen sau
khi gắn vào vectơ pGTB9 và
biến nạp vào HF7C.
•
Người ta đã tiến hành tách plasmit pGAD424
mang cDNA biến nạp vào tế bào nấm men HF7C
đã chứa plasmit pGBT9 mang các đoạn gen
tương ứng TTP30, PB, TPR ` trên. Các thể biến
nạp được phát hiện trên các môi trường chọn
lọc: MT1 không chứa Leu và Trip (phát hiện hiệu
quả và tần số biến nạp), môi trường MT2 không
chứa Leu, Trip và His (phát hiện dòng gen mã
hoá cho protein tương tác với TTP30) theo sơ đồ
1.
Tuyển chọn dòng gen mã hoá cho protein tương
tác với TTP30
Sơ đồ 1: Biến nạp plasmit pGAD424 gắn với cDNA vào dòng
nấm men HF7C mang pGBT9 có chứa TTP30, PB, TPR.
•

Kết quả thí nghiệm cho thấy các dòng tế bào
đều cho tần số biến nạp cao khi phát hiện trên
môi trương MT1. Trên môi trường MT2 chỉ
nhận được 5 khuẩn lạc với dòng tế bầo mang
gen TTP30 trong khi đó không nhận được thể
biến nạp nào với 2 dòng tế bào còn lại (PB và
TPR). Để khẳng đ_nh các thể biến nạp thu được
người ta đã xác đ_nh hoạt độ
betagalactosidaza và chỉ có hai thể biến nạp có
hoạt tính. Đồng thời đã dùng phản ứng PCR để
phát hiện đoạn gen cDNA khi dùng primer của
plasmit pGAD424 kết quả được trình bày `
hình 5.
Hình 5: Kết quả xác đ_nh hoạt độ betagalactosidaza và phản ứng
PCR của hai thể biến nạp thu được
Nhận xét
•
Như vậy, khi dùng kỹ thuật lai kép với tế bào
chủ là nấm men HF7C chúng tôi đã thu được 2 gen
mã hoá cho protein tương tác với TTP30 có kích
thước khoảng 1,6 kb (kết quả PCR). Gen TTP30 có
hai vùng chức năng PB và TPR nhưng không có
biểu hiện tương tác với một protein nào từ thư viện
gen cDNA, điều này có thể liên quan đến việc tách
dòng riêng rẽ các vùng chức năng sẽ ảnh hư`ng
đến cấu hình không gian và làm thay đổi khả năng
tương tác của chúng. Việc xác đ_nh loại gen và vùng
tương tác của hai dòng gen thu được ` trên chỉ
được thực hiện sau khi giải trình tự gen và axitamin
của protein tương ứng kết hợp với kỹ thuật tạo đột

biến điểm trong các nghiên cứu tiếp theo.