Nghiên cứu chế tạo kit chẩn đoán virút cúm a h1n1

MỤC LỤC
Trang
Lời mở đầu 1
Chương 1: Tổng quan tài liệu
1.1. Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 3
1.1.1. Tình hình thế giới 3
1.1.2. Tình hình Việt Nam 6
1.2. Virút cúm đại dịch 7
1.2.1. Virút cúm A 7
1.2.2. Các đại dịch cúm trong quá khứ 9
1.2.3. Virút cúm A đại dịch H1N1/2009 11
1.3. Các phương pháp chẩn đoán cúm 18
1.3.1. Phương pháp huyết thanh học 18
1.3.2. Phương pháp miễn d
ịch 19
1.3.2.1. Phương pháp miễn dịch enzyme 19
1.3.2.2. Phương pháp chẩn đoán nhanh 19
1.3.2.3. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20
1.3.3. Phương pháp nuôi cấy virút 21
1.3.4. Phương pháp phân tử 21
1.4. Các phương pháp chẩn đoán cúm A/H1N1-2009 22
1.4.1. Phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên 22
1.4.2. Phương pháp phân tử 23
1.5. Tác nhân ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán virút cúm 23
1.5.1. Loại mẫu bệnh phẩm 24
1.5.2. Chất lượng mẫu 24
1.6. Các đặc tính quyết định việc đánh giá chính xác trong chẩn đoán 24
1.6.1. Các đặc tính hiệu suất 25
1.6.1.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu 25
1.6.1.2. Giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm 25
1.6.1.3. Độ lặp lại 25

1.6.1.4. Độ chính xác 26
1.6.2. Các đặc tính sử dụng 26
1.6.3. Chọn lựa phương pháp chuẩn tham khảo 26
Chương 2: Vật liệu và Phương pháp
2.1. Vật liệu 28
2.1.1. Thiết bị - dụng cụ 28
2.1.1.1. Thiết bị 28
2.1.1.2. Dụng cụ 29
2.1.2. Sinh phẩm - hóa chất 29
2.2. Đối tượng nghiên cứu 32
2.3. Phương pháp nghiên cứu 33
2.3.1. Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm 33
2.3.1.1. Loại mẫu 33
2.3.1.2. Vận chuyển và trữ mẫu 33
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập virút cúm trên tế bào MDCK 34
2.3.2.1. Chuẩn bị tế bào MDCK trước nuôi cấy 34
2.3.2.2. Nuôi cấy virút 35
2.3.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu 35
2.3.4. Tách chiết RNA virút 36
2.3.5. Phương pháp real-time PCR 37
2.3.5.1. Chuẩn bị hỗn h
ợp phản ứng 37
2.3.5.2. Thực hiện phản ứng 37
2.3.6. Phương pháp RT-PCR 38
2.3.7. Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di 38
2.3.8. Thiết kế mồi 38
2.3.9. Xây dựng chứng nội 39
2.3.10. Phương pháp biến nạp 39
2.3.10.1. Nối DNA mục tiêu vào vector 39
2.3.10.2. Biến nạp các plasmid vào tế bào E. coli khả nạp TOP10 40

2.3.10.3. Phân tích kết quả biến nạp 41
2.3.10.4. Tách plasmid mục tiêu từ tế bào chọn lọc 41
2.3.10.5. Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn 41
2.3.11. Phương pháp sản xuất enzyme 42
2.3.11.1. Điều kiện nuôi cấy và biểu hiện 42
2.3.11.2. Chiết xuất và tinh sạch enzyme 42
2.3.12. Điện di SDS-PAGE 42
2.3.13. Định lượng plasmid DNA 43
2.3.14. Phương pháp giải trình tự 43
2.3.14.1. Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự 44
2.3.14.2. PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình t
ự 44
2.3.14.3. Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy giải trình tự 45
2.3.15. Các phương pháp thống kê 46
2.3.15.1. Độ nhạy 46
2.3.15.2. Độ đặc hiệu 46
2.3.15.3. Giá trị tiên đoán dương 46
2.3.15.4. Giá trị tiên đoán âm 47
2.3.15.5. Ước tính cỡ mẫu cho phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu 47
Chương 3: Kết quả và bàn luận
3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo kit xét nghiệm 49

3.1.1. Thiết kế mồi 49
3.1.1.1. So sánh trình tự và thiết kế mồi 49
3.1.1.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi được thiết kế 51
3.1.2. Điều chế enzyme Taq polymerase 52
3.1.2.1. Biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase 52
3.1.2.2. Hoạt tính Taq polymerase 54
3.1.3. Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCR 55
3.1.4. Chuẩn hóa các điều kiện phản ứng RT-PCR 59

3.1.4.1. Khảo sát điều kiệ
n phản ứng RT-PCR đơn 59
3.1.4.2. Khảo sát điều kiện multiplex RT-PCR 67
3.1.5. Xây dựng chứng nội cho phản ứng multiplex RT-PCR 73
3.1.5.1. Quy trình tạo chứng nội 73
3.1.5.2. Khảo sát nồng độ chứng nội tối thiểu cho phản ứng RT-PCR 76
3.1.5.3 Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội 77
3.1.6. Khảo sát độ nhạy và độ đặc hiệu 78
3.1.6.1. Khảo sát giới hạn phát hiện củ
a phương pháp 78
3.1.6.2. Khảo sát độ nhạy của phương pháp 79
3.1.6.3. Khảo sát độ lặp lại 82
3.1.7. Tạo chứng dương 82
3.2. Xây dựng quy trình sử dụng kit xét nghiệm cúm H1N1/09 84

3.2.1. Khảo sát điều kiện bảo quản 84
3.2.2. Quy trình xét nghiệm bằng RT-PCR 85
3.2.3. Tiêu chuẩn cơ sở 87
3.3. Kết quả kiểm định bộ kit thành phẩm pFLU 88
3.3.1. Kết quả kiểm định cơ sở tại Viện Pasteur TP.HCM 89
3.3.2. Kết quả kiểm định tại Viện kiểm định Quốc gia vắc xin và Sinh phẩm y tế
(NICVB) 91
3.3.3. Kết quả tri
ển khai thực tế tại TTYTDP các tỉnh phía Nam 92
Chương 4: Kết luận và đề nghị
4.1. Kết luận 99
4.2. Đề nghị 101
Tài liệu tham khảo 102

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

aa : Amino acid (axít amin)
ATCC : The American Type Culture Collection
(Ngân hàng giống tế bào tại Hoa Kỳ)
BHI : Brain-Heart Infusion (Môi trường nước thịt dạng lỏng)
BHIA : Brain-Heart Infusion Agar
(Môi trường nước thịt dạng thạch)
bp : Base pair (Cặp base)
BSA : Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò)
CDC : Center of Disease Prevention and Control
(Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ)
CPE : Cytopathic effect (Hiện tượng hủy hoại tế bào)
cDNA : Complementary DNA (DNA bổ sung)
ddH
2
O : Deionized distilled water (Nước cất khử ion)
ddNTP : Dideoxy nucleoside triphosphates
DDT : Dichlorodiphenyltrichloroethane
DEPC : Diethyl pyrocarbonate
dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate
DNA : Deoxyribonucleic acid
DNase : Deoxyribonuclease
dsDNA : Double-stranded DNA (DNA mạch đôi)
E.coli : Vi khuẩn Escherichia coli
EDTA : Ethylene-Di-amine-Tetra-acetic acid
EIA : Enzyme immuno assay

ER : Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất)
FAO : Food and Agriculture Organization
(Tổ chức Lương – Nông Thế giới)
FBS : Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thai bê)
FN : False negative (Âm tính giả)
FP : False positive (Dương tính giá)
HA : Haemagglutinin
HAU : Hemagglutination unit (Đơn vị ngưng kết hồng cầu)
HBSS : Hank's Buffered Salt Solution
HPAI : Highly pathogenic avian influenza
Cúm gia cầm độc lực cao
IC : Internal control (Chứng nội)
INF : Interferon
IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
kb : Kilobasepairs (~1000bp)
LB : Luria Bertani medium (Môi trường LB)
LPAI : Low pathogenic avian influenza
(Cúm gia cầm độc lực thấp)
MDA5 : Melanoma differentiation antigen 5
MDCK : Madin-Darby Canine Kidney cell
(Tế bào thận chó Madin-Darby)
MEM : Mminimum essential medium
(Môi trường thiết yếu tối thiểu)
mM : Milimolar
mRNA : Messenger RNA (RNA thông tin)
mRT-PCR : Multiplex reverse transcription - polymerase chain
reaction
NA : Neuraminidase
NASBA : Nucleic acid sequence-based amplification
NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm

Quốc gia về thông tin công nghệ sinh học của Hoa kỳ)
NEP : Nuclear export protein (Protein xuất nhân)
ng : Nanogram
nm : Nanometer
NLS : Nuclear located signal (Tín hiệu hướng nhân)
NP : Nucleoprotein
NPV : Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm)
NT : Nghiệm thức
OD : Optical density (Mật độ quang)
OIE : World organisation for animal health
(Tổ chức Thú y Thế giới)
PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)
PFU : Plaque forming unit (Đơn vị hình thành vệt tan)
PPV : Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương)
RBC : Red blood cell (Tế bào hồng cầu)
Real-time PCR : Real – time polymerase chain reaction
rRT-PCR : Real – time reverse – transcription polymerase chain
Reaction
RIDT : Rapid influenza diagnostic test
RIG-I : Rectinoic acid inducible gene - I
RNA : Ribonucleic acid
RNP : Ribonucleoprotein
rpm : Round per minute (Vòng/phút)
RT-PCR : Reverse transcription - polymerase chain reaction
(Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược)
SDS : Sodium dodecyl sulfate
S.O.C : Super optinal broth with catabolic repressor
(Môi trường giàu dinh dưỡng)
ssDNA : Single-stranded DNA (DNA mạch đơ
n)

Ta : Annealing temperature (Nhiệt độ bắt cặp)
TCID
50
: 50% tissue culture infectious dose
(Liều xâm nhiễm 50% tế bào nuôi cấy)
TEMED : Tetramethylethylenediamine
Tm : Melting temperature (Nhiệt độ tan chảy)
TN : True negative (Âm tính thực)
TP : True positive (Dương tính thực)
UV : Ultraviolet (Tia cực tím)
vRNA : Viral RNA (RNA của virút)
vRNP : Viral ribonucleoprotein (Ribonucleoprotein của virút)
WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới)
μg : Microgram
μl : Microliter
μM : Micromolar

DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các axít amin quan trọng trên các protein có vai trò trong độc tính virút
cúm 15
Bảng 1.2.
So sánh các xét nghiệm chẩn đoán cúm hiện có 21
Bảng 2.1. Thành phần hỗn hợp (mix) chẩn đoán cúm A/H1N1 2009 bằng rRT-PCR
37
Bảng 2.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng rRT-PCR chẩn đoán cúm A/H1N1 38
Bảng 2.3. Chuyển đổi 1 đơn vị hấp phụ ở bước sóng 260nm. 43
Bảng 3.1. Bảng nồng độ mồi được khảo sát trong phản ứng multiplex RT-PCR có
chứng nội 77
Bảng 3.2. So sánh kết quả 2 phương pháp multiplex RT-PCR và rRT-PCR 80

Bảng 3.3. Tiêu chuẩn cơ sở cho qui trình sản xuất kit xét nghiệm virút cúm đại dịch
A/H1N1-2009 bằng RT-PCR 87







DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009 4
Hình 1.2. Bản đồ hoạt động của các type (subtype) virút cúm đầu năm 2010 5
Hình 1.3. Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam (Viện Pasteur TP.HCM) 6
Hình 1.4. Cấu trúc hạt virút cúm A 7
Hình 1.5. Chu trình sinh trưởng của virút cúm A trong tế bào chủ 8
Hình 1.6. Mối liên hệ của các chủng virút gây đại dịch từ 1918-2009 10
Hình 1.7. Hình dạng virút cúm A/H1N1 11
Hình 1.8. Nguồn gốc tái t
ổ hợp của virút cúm A đại dịch H1N1/2009 13
Hình 2.1. Loại mẫu xét nghiệm virút cúm A/H1N1-2009 33
Hình 2.2. Minh họa phương pháp HA 36
Hình 2.3. Sơ đồ biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli 40
Hình 2.4. Nguyên tắc máy giải trình tự DNA tự động 45
Hình 3.1. Kết quả so sánh độ tương đồng các gen H, N và M trên NCBI 49
Hình 3.2. Trình tự gen M và gen H1 bảo tồn 50
Hình 3.3: Các mồi được thiết kế để phát hiện virút cúm A/H1N1-2009 51
Hình 3.4. Ki
ểm tra độ đặc hiệu của mồi 52
Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pTTQ18 vào E. Coli. 53
Hình 3.6. Kết quả phân tích SDS-PAGE Taq polymerase. 54

Hình 3.7. Kết quả kiểm tra hoạt tính enzyme 54
Hình 3.8. So sánh hỗn hợp enzyme RT-PCR 56
Hình 3.9. Khảo sát tỷ lệ thành phần hỗn hợp enzyme 57
Hình 3.10. So sánh hỗn hợp các enzyme chạy RT-PCR 1 tube 58
Hình 3.11. Khảo sát nhiệt độ phản ứng phiên mã ngược cho từng cặp mồi 59
Hình 3.12. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp mồi phản ứng đơn 61
Hình 3.13. Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng đơn 62
Hình 3.14. Kết quả khảo sát nồng
độ Mg
2+
trong phản ứng đơn 63
Hình 3.15. Kết quả khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng đơn 64
Hình 3.16. Khảo sát thời gian phiên mã ngược phản ứng đơn 65
Hình 3.17. Khảo sát thời gian trong phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR) đơn 66
Hình 3.18. Khảo sát nhiệt độ phiên mã ngược trong phản ứng multiplex 67
Hình 3.19. Khảo sát nhiệt độ bắt cặp trong phản ứng khuếch đại chuỗi multiplex . 68
Hình 3.20. Khảo sát nồ
ng độ mồi cho phản ứng multiplex 69
Hình 3.21. Kết quả khảo sát nồng độ Mg2+ trong phản ứng multiplex 70
Hình 3.22. Kết quả khảo sát nồng độ dNTP trong phản ứng multiplex 71
Hình 3.23. Khảo sát thời gian phiên mã ngược trong phản ứng multiplex 72
Hình 3.24. Khảo sát thời gian khuếch đại chuỗi (PCR) phản ứng multiplex 72
Hình 3.25. Kết quả khuếch đại MA1-MA2 74
Hình 3.26. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp mang IC trong tế bào E.coli 74
Hình 3.27
. Kết quả 6 khuẩn lạc được tách plasmid 75
Hình 3.28. Kết quả kiểm tra IC chèn vào plasmid bằng PCR 75
Hình 3.29. Kết quả khảo sát nồng độ chứng nội trong phản ứng RT-PCR 76
Hình 3.30. Kết quả nồng độ mồi trong phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội
77

Hình 3.31. Xác định số bản sao gen H1 bằng phương pháp rRT-PCR 78
Hình 3.32. Giới hạn phát hiện của phương pháp multiplex RT-PCR 79
Hình 3.33. Kết quả 28 trong số 63 mẫu dương tính cúm A/H1N1-2009
xét nghiệm bằng multiplex RT-PCR 80
Hình 3.34. Kết quả nuôi cấy mẫu bệnh phẩm virút cúm A/H1N1-2009 81
Hình 3.35. Kết quả độ lặp lại của phản ứng mRT-PCR 82
Hình 3.36. Kết quả bảo quản RNA virút 83
Hình 3.37. Khảo sát nhiệt độ và thời gian bảo quản hỗn hợp multiplex 85
Hình 3.38. Bộ kit pFLU thành phẩm 88
Hình 3.39. Kết quả kiểm định cơ sở tại Viện Pasteur TP.HCM 89
Hình 3.40. Giấy chứng nhận củ
a Viện Kiểm định Quốc gia 91
Hình 3.41. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP An Giang 93
Hình 3.42. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Bạc Liêu 94
Hình 3.43. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Bến Tre 95
Hình 3.44. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đà Lạt 96
Hình 3.45. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đồng Nai 97
Hình 3.46. Triển khai kit pFLU tại TTYTDP Đồng Tháp 98
~ 1 ~

LỜI MỞ ĐẦU
Lịch sử đã ghi nhận ba đại dịch cúm vào các năm 1918 (cúm Tây Ban
Nha), 1957 (cúm Châu Á) và 1968 (cúm Hồng Kông). So với các vụ dịch cúm
mùa hàng năm thường xảy ra vào các tháng mùa đông, đại dịch cúm thường
xuất hiện sau vài thập kỷ. Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918 được cho là đã
cướp đi trên 40 triệu người trên thế giới trong vòng chưa đầy một năm.
Cuối tháng ba và đầu tháng 4 năm 2009, vụ dịch cúm A H1N1 đã được
phát hiện đầu tiên ở Mexico và sau
đó lan ra một số nước lân cận. Bệnh cảnh
lâm sàng nhiều trường hợp nhiễm cúm H1N1-2009 khác biệt rõ rệt so với các

trường hợp nhiễm cúm mùa thông thường hàng năm, trong đó tỉ lệ mắc tập
trung vào nhóm người trẻ khỏe mạnh. Ngày 11/6/2009, Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ cao nhất, pha 6, cho thấy mức
lan rộng trong cộng đồng ở ít nhất hai
đại lục.
Các dữ liệu cuối năm 2009-đầu 2010 từ nhiều vùng dịch khác nhau cho
thấy chủng virút cúm đại dịch H1N1-2009 lây lan rất nhanh và trở thành
chủng chiếm ưu thế tại nhiều nơi trên thế giới. Theo thống kê của WHO đến
ngày 19/3/2010 đã có trên 213 quốc gia và vùng lãnh thổ có người bị nhiễm
virút cúm đại dịch 2009 và nâng tổng số người tử vong lên trên 16800 người.
Cũng tại thời điểm này, Bộ Y tế
Việt Nam đã ghi nhận trên 11000 trường hợp
bị nhiễm bệnh tại 60/64 tỉnh thành Việt Nam, con số tử vong là 58 người.
Hiện tại, các kỹ thuật phòng thí nghiệm trong chẩn đoán virút cúm đại
dịch A/H1N1-2009 bao gồm các kỹ thuật phân tử, phân lập qua nuôi cấy, định
type bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HI hay miễn dịch huỳnh quang
và test nhanh [54]. Trong đó test nhanh có thể được sử dụng rộ
ng rãi nhất
trong chẩn đoán virút cúm ở nhiều quốc gia. Tuy nhiên giá thành của các bộ
kit thương mại hiện nay là một trong những khó khăn của các nước đang phát
~ 2 ~

triển. Việc sử dụng các test nhanh trong chẩn đoán virút cúm đại dịch
A/H1N1-2009 cũng đang gặp nhiều tranh cãi do tính chính xác của nó. Do đó
các phương pháp chẩn đoán phân tử hiện được lựa chọn để phát hiện virút
cúm đại dịch 2009.
Phương pháp phiên mã ngược real-time PCR (rRT-PCR) được CDC
xây dựng và đã được sử dụng đầu tiên trong chẩn đoán virút cúm đại dịch
2009 [54]. Phương pháp này có ưu điểm ít tốn thời gian và có độ nh
ạy cao

hơn một số phương pháp truyền thồng. Nhưng đây là phương pháp đòi hỏi sử
dụng máy móc chuyên dụng đắt tiền, bộ mồi/mẫu dò phải được thay đổi phù
hợp tình hình dịch tễ và kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Do đó phương pháp
này khó có thể sử dụng rộng rãi ở tất cả các phòng xét nghiệm, đặc biệt là
phòng xét nghiệm ở vùng sâu vùng xa.
Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằ
m tạo ra bộ kít chẩn
đoán đồng thời virút cúm A nói chung và virút cúm H1N1 đại dịch 2009, sử
dụng phương pháp phân tử khá đơn giản và yêu cầu thiết bị tương đối rẻ tiền
mà các phòng xét nghiệm có thể trang bị được. Việc tạo ra bộ kít này có thể
giúp các phòng xét nghiệm trong cả nước, kể cả các phòng xét nghiệm vùng
sâu xa phát hiện sớm bệnh nhằm kịp thời định hướng điều trị cũng như
giúp
ngăn ngừa ổ dịch có thể xảy ra trong khu vực.
Mục tiêu đề tài:
1. Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo kít chẩn đoán virút cúm đại dịch
A/H1N1-2009 bằng kỹ thuật RT-PCR.
2. Sản xuất bộ kít chẩn đoán dựa trên qui trình vừa được tạo ra ở trên.



~ 3 ~

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009
1.1.1. Tình hình thế giới
Đại dịch cúm do virút cúm A/H1N1 2009 là đại dịch đầu tiên của thế
kỷ 21 khởi nguồn từ các nước ở khu vực Bắc Mỹ, đầu tiên có thể từ Mexico
[7].

Khoảng cuối tháng giêng và đầu tháng hai năm 2009, Mexico ghi nhận
sự tăng vọt các bệnh nhân mang triệu chứng giống cúm (ILI) được cho là biểu
hiện đặc trưng của virút cúm mùa. Các nhà chức trách về sức khỏ
e Mexico
cho rằng vụ dịch do virút cúm A/H1N1 “mới” có thể bắt đầu vào giữa tháng
ba khi quốc gia này xảy ra nhiều trường hợp có triệu chứng hô hấp cấp, chủ
yếu ở những người trẻ tuổi và khỏe mạnh. Ngày 14 tháng 4 một bệnh nhân trẻ
tuổi đến phòng mạch tại Bang Oxaca khám với triệu chứng hô hấp cấp không
đặc trưng và tử vong sau đó. Các bác sỹ điều trị cho rằng có thể do SARS,
nhưng kết quả kiểm tra âm tính. Mẫu tử vong được kiểm tra một lần nữa và
xác định bệnh nhân đã bị nhiễm virút cúm A/H1N1 “mới”.
Tại Hoa kỳ, các trường hợp đầu tiên được phát hiện vào giữa tháng
3/2009 là 2 trẻ em ở nam California. Trường hợp tử vong đầu tiên được báo
cáo vào ngày 29/4/2009 ở một bệnh nhi 23 tháng tuổi. Từ đó mạng lưới giám
sát cúm trên toàn Hòa kỳ đã được tăng cường mạnh mẽ.
Qu
ốc gia thứ 3 phát hiện virút cúm đại dịch 2009 là Canada vào cuối
tháng 4 năm 2009. Các virút cúm được nhận dạng tương tự virút cúm ở Hoa
kỳ và Mexico [55].
Trước tình hình gia tăng số bệnh nhân bị nhiễm cúm A/H1N1 mới tại
các nước thuộc Châu Mỹ và đặc biệt là sự lan rộng trong cộng đồng ở
~ 4 ~

Mexico, ngày 27/4/2009 Tổ chức Y tế thế giới (WHO) cảnh báo đại dịch cúm
A/H1N1 ở mức 4. Đây là mức chỉ sự lan truyền từ người sang người của
chủng virút cúm động vật hay chủng virút cúm tái tổ hợp.
WHO tiếp tục tăng mức độ báo động đại dịch cúm A/H1N1 lên mức 5
vào ngày 29/4, mức báo động cho thấy mức độ ảnh hưởng và lan rộng của
virút cúm từ hai quốc gia trở lên trong cùng một vùng
địa lý.

Hình 1.1. Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009
~ 5 ~

Đến ngày 11/6/2009, sau hai tháng kể từ khi phát hiện chủng virút cúm
“mới”, WHO tuyên bố đại dịch cúm đã thực sự nổ ra trên toàn cầu với tốc độ
lây lan từ người sang người, từ quốc gia này sang quốc gia khác và từ vùng
này sang vùng khác một cách nhanh chóng. Tại thời điểm đó gần 30.000
trường hợp dương tính đã được phát hiện ở 74 quốc gia và vùng lãnh thổ,
trong đó có 114 trường hợp tử vong.

Cho đến nay đã có trên 200 quốc gia và vùng lãnh th
ổ xác định có
trường hợp bị nhiễm virút cúm đại dịch 2009 và con số người mắc lên đến
hàng trăm ngàn trường hợp, trong đó số lượng tử vong trên 17 ngàn người
(WHO, 16/4/2010) (hình 1.1). Tuy nhiên theo đánh giá của các chuyên gia
con số này trên thực tế có thể lớn hơn rất nhiều do số người nhiễm bệnh
không được xét nghiệm hoặc không đi xét nghiệm rất lớn.
Hiện tại, virút cúm đại dịch 2009 phân bố chủ yế
u ở các khu vực châu
Mỹ, Đông phi, Tây Phi và Đông Nam Á. Tại các khu vực này virút cúm đại
dịch 2009 vẫn là chủng cúm chiếm ưu thế và lưu hành song song với các
chủng cúm mùa (A/H1N1, A/H3N2 và B) và đặc biệt là cúm gia cầm
(A/H5N1) tại khu vực Đông và Đông Nam Á (hình 1.2).










Hình 1.2. Bản đồ hoạt động của các type (subtype) virút cúm đầu năm 2010
~ 6 ~

1.1.2. Tình hình Việt Nam
Việt Nam là nước thứ 54 trên thế giới thông báo phát hiện bệnh nhân
nhiễm virút cúm đại A/H1N1-2009. Ca dương tính đầu tiên tại Việt Nam
được phát hiện vào ngày 30/5/2009 là một du học sinh từ Hoa Kỳ về. Kể từ

đó Việt Nam đã thực sự bước vào cuộc chiến chống đại dịch với chính sách
thắt chặt việc rà soát thân nhiệt, cách ly kiểm tra đối với những người có biểu
hiện thân nhiệt bất th
ường tại các cửa khẩu, sân bay. Ngoài ra những người
từng tiếp xúc với trường hợp dương tính cúm A/H1N1-2009 hay từ các vùng
dịch tễ về cũng được cách ly giám sát.
Hiện tại tình hình lây lan cũng như mối nguy hiểm do virút cúm đại
dịch A/H1N1-2009 gây ra tại Việt Nam có vẻ lắng xuống. Điều này có thể
được lý giải: thứ nhất là do chiến dịch giám sát virút cúm đại dịch A/H1N1-
2009 đã được thay đổi kể từ cuối n
ăm 2009 từ chỗ xét nghiệm đại trà trong
cộng đồng đến việc chỉ giám sát các vùng nguy cơ, phát hiện, kiểm soát và
ngăn chặn tại chỗ (không cần phải xét nghiệm từng cá nhân); thứ hai virút
cúm thường gây dịch theo mùa nhất định, ở vùng ôn đới virút thường gây
dịch vào mùa thu – đông, còn ở các nước nhiệt đới virút thường hoạt động
mạnh vào mùa mưa (WHO), do đó nhiều khả năng virút cúm đại dịch H1N1-
2009 cũng hoạ
t động theo chu kỳ tương tự.








0
1
2
3

4
5
6
7
8
An Gia
n
g
TP.HCM
Tâ
y

N
in
h
T
rà V
i
nh
Lo
n
g
A
n
K
iê
n
G
iang
Cà Mau

Hình 1.3. Biểu đồ số ca tử vong tại các tỉnh phía Nam 3/2010(Viện Pasteur TP.HCM)
~ 7 ~

Theo báo cáo của Bộ Y tế ngày 20/3/2010, Việt Nam đã xác định
11.202 trường hợp dương tính với virút cúm đại dịch H1N1-2009 tại 60/64
tỉnh, thành phố. 15 địa phương ghi nhận có trường hợp tử vong, nâng tổng số
ca tử vong lên 58 người, trong đó phụ nữ mang thai chiếm 23%, trẻ em dưới
10 tuổi chiếm 14,3%.
1.2. Virút cúm đại dịch
1.2.1. Virút cúm A
Virút cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, và được chia thành các thứ
type (subtype) khác nhau dựa trên hai kháng nguyên bề mặt Haemagglutinin
(HA) và Neuraminidase (NA). Hiện tại, có 16 kháng nguyên HA (H1 – H16)
và 9 kháng nguyên NA (N1 – N9)
đã được xác định. Virút cúm A có bộ gene
gồm 8 sợi RNA đơn, mạch âm (-), mỗi loại mã hóa cho một hoặc hai protein
(hình 1.4) [26].










Protein HA có chức năng gắn kết với các thụ thể, và dung hợp virút với
màng tế bào chủ. Sau khi xâm nhập vào tế bào theo cách thực ẩm bào
(endocytose), các hạt virút được bao bởi thể nhân (endosome). Nhờ độ pH

Hình 1.4. Cấu trúc hạt virút cúm A
~ 8 ~

axít, các ion H+ bên trong thể nhân đi vào hạt virút thông qua kênh ion M2 để
phát vỡ tương tác protein - protein, nhờ đó cắt đứt liên kết giữa vRNA và M1,
phóng thích RNP vào nhân tế bào chủ [26]. Tại đây, xảy ra quá trình sao chép
và phiên mã vRNA nhờ ba protein có hoạt tính polymerase: PB1, PB2, PA
cùng với protein NP (nucleoprotein). Các phức hệ ribonucleoprotein (vRNP)
mới tổng hợp xong sẽ được chuyển từ nhân ra tế bào chất nhờ tín hiệu xuất
nhân (nuclear export protein – NEP) của NS2 và protein nền M1 [37]. Tại bề
mặt tế bào chủ, các vRNP kết hợp với các thành phầ
n cần thiết được màng tế
bào gói lại, hình thành các hạt virion hoàn chỉnh nhô ra ngoài. Cuối giai đoạn
này, nhờ hoạt tính phân cắt axít sialic nối giữa tế bào với các kháng nguyên
bề mặt virút mới sinh của protein NA, giúp các hạt virion thoát ra ngoài và có
thể xâm nhiễm vào tế bào khác để tiếp tục chu trình sinh trưởng mới (hình
1.5).

Hình 1.5. Chu trình sinh trưởng của virút cúm A trong tế bào chủ.
~ 9 ~

1.2.2. Các đại dịch cúm trong quá khứ
Virút cúm A đã gây ra nhiều trận dịch trong quá khứ, một vài trận trong
số đó phát triển thành đại dịch. Đại dịch cúm xuất hiện thường là do sự phát
triển của chủng virút mới, xa lạ với hệ miễn dịch ở người. Có hai nguyên
nhân chính: quá trình tái sắp xếp vật liệu di truyền (reassortment) và sự lây
truyền qua nhiều loài khác nhau (interspecies transmission) dẫn đến việc hình
thành chủng virút với các protein bề mặt HA, NA ho
ặc protein bên trong mới,
rồi lưu hành trong cộng đồng người [34].
Đại dịch cúm Tây Ban Nha (Spanish influenza - H1N1). Đại dịch xảy ra
vào năm 1918 – 1919 được xem như một ví dụ điển hình về tính khốc liệt của
virút cúm trong lịch sử, làm thiệt mạng khoảng hơn 50 triệu người trên toàn
thế giới. Đầu tiên, đợt dịch nhẹ vào mùa xuân 1918 được thay thế bởi đợt dịch
thứ hai từ tháng 9 đến tháng 11, tỉ lệ
tử vong của đợt dịch này lớn hơn 2,5%
so với tỉ lệ tử vong thông thường của dịch cúm là nhỏ hơn 0,1%. Đợt dịch thứ
ba với tỉ lệ tử vong tương tự (2,5%) đã lan nhanh trên toàn thế giới năm 1919.
Tuy virút “cúm Tây Ban Nha” đã không được phân lập trong suốt hai
năm gây đại dịch 1918-1919, nhưng trình tự bộ gene của virút này đã được
giải mã và các nhà khoa học cũng phát hiện virút H1N1 này sở hữu mộ
t số
axít amin trên nhiều protein giống với virút cúm người. Virút cúm Tây Ban
Nha không có nhiều axít amin mang tính bazơ tại vị trí phân cắt trên protein
HA (multibasic HA cleavage site) – một trong số các tiêu chuẩn cho tính độc
lực cao của cúm gia cầm [34].
Bằng kỹ thuật di truyền ngược các nhà khoa học đã tái tạo ra “virút cúm

Tây Ban Nha” hoàn chỉnh cùng với những nghiên cứu trên chuột (mice) [22]
và động vật linh trưởng (primates) [24] cho thấy chủng virút cúm này có khả
năng gây ra những đáp ứng miễn dịch bẩm sinh khác th
ường, một đặc điểm
giống với chủng H5N1 độc lực cao. Điều này góp phần gây độc lực và tỉ lệ tử
~ 10 ~

vong cao ở người. Những nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng, protein HA,
phức hệ sao chép (PB1, PB2, PA), NS1 và protein PB1-F2 cũng tham gia vào
tính độc lực của virút, đặc biệt protein HA và PB2 đóng vai trò quan trọng
hàng đầu trong khả năng lan truyền giữa các loài khác nhau của virút cúm
[50].

Hình 1.6. Mối liên hệ của các chủng virút gây đại dịch từ 1918-2009
Các mũi tên màu vàng chỉ cho một hay nhiều gene được thừa hưởng từ virút cúm của loài
thủy cầm. Mũi tên gạch nối màu nâu cho biết chủng virút không lưu hành trong một thời
gian. Mũi tên màu nâu cho thấy các con đường tiến hóa của virút cúm người; mũi tên màu
xanh chỉ cho các chủng cúm heo (swine); và mũi tên màu từ xanh sang nâu chỉ cho virút
cúm người có nguồn gốc từ heo. Các gene của chủng cúm người 1918, cúm heo H1N1 và
cúm H1N1 1979 đều có nguồn gốc từ virút cúm gia cầm, một số gene khác “được tặng” cho
ch
ủng cúm đại dịch H1N1 2009.
[32]
~ 11 ~

Đại dịch cúm Châu Á (Asian Influenza – H2N2). Virút cúm Châu Á ban
đầu xuất hiện ở phía nam Trung Quốc vào khoảng tháng 2 năm 1957, sau đó
lan đến Singapore (tháng 3/1957), Hong Kong (tháng 4/1957), Nhật Bản
(tháng 5/1957), Hoa Kỳ và Vương Quốc Anh (tháng 10/1957). Chỉ tính riêng
ở Hoa Kỳ, đợt dịch này làm thiệt mạng khoảng 70.000 người. Virút gây đại
dịch “cúm Châu Á” là kết quả của quá trình tái sắp xếp vật liệu di truyền giữa
virút cúm người (human) và gia cầm (avian) dẫn đến việc hình thành chủng
H2N2 tái tổ hợp sở hữu ba gene H2, N2, PB1 của virút gia c
ầm và năm gene
còn lại của chủng virút cúm người [23].
Đại dịch cúm Hong Kong (Hong Kong Influenza – H3N2). Năm 1968,
chủng virút tái tổ hợp H3N2 xuất hiện và gây đại dịch, virút H3N2 này sở hữu
gene H3 và PB1 từ virút cúm gia cầm. Virút H3N2 lần đầu tiên được phân lập
năm 1968 và gây đại dịch vào mùa đông của những năm 1968 – 1970. Tại

Hoa Kỳ, ước tính có khoảng 33.800 người bị tử vong trong đợt dịch này [23].
1.2.3. Virút cúm A đại dịch H1N1/2009










Đa số các hạt virion cúm A đại dịch H1N1/2009 có hình dạng tròn khá
đều đặn khi chụp dưới kính hiển vi, với đường kính từ 80 – 120 nm (CDC).
Hình 1.7. Hình dạng virút cúm A/H1N1
(A) Hình dáng tròn đều của hạt virion swine H1N1 theo CDC. (B)
Hình dáng que dài trong thí nghiệm của Neumann, chiều dài của thanh bar
màu đen là 1 µm.