CHỦ ĐỀ : KỸ THUẬT CHUYỂN GENE THỰC VẬT docx

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chủ đề
Chủ đề
KỸ THUẬT CHUYỂN GENE THỰC VẬT
KỸ THUẬT CHUYỂN GENE THỰC VẬT
Nội dung
Nội dung
•
Khái niệm
Khái niệm
•
Một số nguyên tắc chuyển ge
Một số nguyên tắc chuyển ge
ne
ne
•
Các kỹ thuật chuyển gene thự
Các kỹ thuật chuyển gene thự
c vật
c vật
•
GMO
GMO
•
Dự án chuyển gene
Dự án chuyển gene

Các khái niệm
CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN: là đưa một đoạn DNA ngoại
lai vào gen của cơ thể đa bào, sau đó DNA ngoại lai này sẽ có
mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền lại cho thế hệ sau.
GEN CHUYỂN:(transgene) là gen ngoại lai được chuyển từ
một cơ thể sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền.
GMP (genetically modified plant): thực vật biến đổi gen
Một số nguyên tắc trong chuyển công nghệ chuyển gene thực vật
Một số nguyên tắc trong chuyển công nghệ chuyển gene thực vật
- Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng (totipotency)
- Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của
một gen ngoại lai
- Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả
năng thu nhận gen biến nạp vào genome
- Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Cần
xem xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và
tái sinh cây.
- Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gen, từng
cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
- Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của ADN ngoại lai.


- Khả năng xâm nhập ổn định của gen vào genome không tỷ lệ với sự biểu
hiện tạm thời của gen
Các khâu của kỹ thuật cấy gen
Các khâu của kỹ thuật cấy gen
Kỹ thuật cấy gen gồm 3 khâu chủ yếu:

Tách ADN NST của tế bào cho và tách plasmid ra khỏi tế bào vi
khuẩn.


Cắt và nối đoạn ADN của tế bào cho vào ADN plasmid ở những
điểm xác định tạo nên ADN tái tổ hợp.
• Việc cắt nhờ enzim cắt (restrictaza)
• Việc nối nhờ enzim nối (ligaza)

Chuyển ADN tái tổ hợp vào tế bào nhận và tạo điều kiện cho gen
đã ghép được biểu hiện.
Vì sao phải phát triển công
Vì sao phải phát triển công
nghệ chuyển gene thực vật?
nghệ chuyển gene thực vật?
III) Các kỹ thuật biến đổi gene:
III) Các kỹ thuật biến đổi gene:
Kỹ
Kỹ
thuật
thuật
chuyển
chuyển
gene
gene
Kỹ
Kỹ
thuật
thuật
gián
gián
tiếp
tiếp

Kỹ
Kỹ
thuật
thuật
trực
trực
tiếp
tiếp
Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật siêu âm
Kỹ thuật siêu âm
Kỹ thuật điện xung
Kỹ thuật điện xung
Kỹ thuật PEG
Kỹ thuật PEG
Kỹ thuật chuyển gene qua ống phấn
Kỹ thuật chuyển gene qua ống phấn
Kỹ thuật vi tiêm
Kỹ thuật vi tiêm
Kỹ thuật chuyển gene bằng sốc nhiệt
Kỹ thuật chuyển gene bằng sốc nhiệt
Chuyển gen nhờ
Chuyển gen nhờ
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens


Chuyển gen nhờ virus và phage
Chuyển gen nhờ virus và phage

Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật bắn gene
Đâu là súng bắn gene?
Đâu là súng bắn gene?
Chính xác
Chính xác
Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền
vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào
thực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học
ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication
Facility, Newyork, USA.


Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật bắn gene
Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990.


Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt
biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được
gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology
(sinh học) và ballistics (sự bắn tung)).


Nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí
helium để gia tốc các hạt.

Cấu tạo súng bắn gen:
Cấu tạo súng bắn gen:
Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước
6″x7″x10″ nối với hai bơm chân không.
Đạn ở đây là các hạt tungsen có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm
chứa DNA ngoại lai (các kim loại năng khác như vàng và bạc
cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt).
Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước
với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn
rời khỏi nòng súng.
Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật bắn gene
CÁC LOẠI SÚNG BẮN
GEN
Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật bắn gene
PDS-1000
PDS-1000
Sauter1991
Sauter1991
PDS-1000He
PDS-1000He
* Ưu điểm
* Ưu điểm
- Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào
- Thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào
- Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô

- Nguyên liệu để bắn đa dạng (hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào mô
hóa và mô phân sinh)
hóa và mô phân sinh)
- Tần xuất thành công khá cao(ở cây một lá mầm). Hơn nữa việc thiết
- Tần xuất thành công khá cao(ở cây một lá mầm). Hơn nữa việc thiết
kế vector khá đơn giản.
kế vector khá đơn giản.
* Nhược điểm
* Nhược điểm
- Tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus thì ưu việt của
- Tần số biến nạp ổn định thấp vì thế theo Potrykus thì ưu việt của
phương pháp này là nghiên cứu các gen tạm thời.
phương pháp này là nghiên cứu các gen tạm thời.
Tuy nhiên, những năm gần đây phương pháp này đã thành công trên lúa,
Tuy nhiên, những năm gần đây phương pháp này đã thành công trên lúa,
mía, đu đủ, bông đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này.
mía, đu đủ, bông đã khẳng định tính ưu việt của phương pháp này.
Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật bắn gene
Kỹ thuật siêu âm
Kỹ thuật siêu âm
Nguyên tắc
Nguyên tắc
:
:


Sau khi tách, protoplast được xử lý nhẹ bằng siêu âm
Sau khi tách, protoplast được xử lý nhẹ bằng siêu âm
có hiện diện của DNA ngoại lai. Sóng siêu âm giúp DNA đi vào

có hiện diện của DNA ngoại lai. Sóng siêu âm giúp DNA đi vào
tế bào và thể hiện.
tế bào và thể hiện.
Cách tiến hành:
Cách tiến hành:
Các bước:
Kỹ thuật siêu âm
Kỹ thuật siêu âm
Kỹ thuật điện xung
Kỹ thuật điện xung
Là một phương pháp cơ học sử dụng để đưa các phân tử
phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào
Một xung điện cao thế trong khoảnh khắc điện thế cao (200 –
400 V/cm) trong khoảng thời gian 4 - 5 phần nghìn giây có
khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid
Tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA
ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào.
Quá trình được thực hiện trong cuvett chuyên
dụng. Sau quá trình xung điện, đem protoplast nuôi
trong môi trường nuôi cấy thích hợp, môi trường
chọn lọc để tách các protoplast đã được biến nạp.
Tiếp theo là nuôi cấy invitro, tái sinh cây và chọn
lọc cây chuyển gen.
Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời
Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời
trên màng bào chất
trên màng bào chất
Kỹ thuật điện xung
Kỹ thuật điện xung
Máy xung điện

Máy xung điện
Kỹ thuật vi tiêm
Kỹ thuật vi tiêm
Là phương pháp tiêm các đại phân tử vào trong tế bào thực vật
Brinster, 1981; Costantini và Lacy; 1981 đã chứng minh rằng với
phương pháp vi tiêm, các gen chuyển đã tích hợp và có khả
năng biểu hiện. Vào năm 1982, lần đầu tiên sự thay đổi kiểu
hình có thể nhìn thấy ở chuột nhắt chuyển gen đã được mô tả
(Palmiter, 1982).


Brinster
Kỹ thuật vi tiêm
Kỹ thuật vi tiêm
Nguyên tắc phương pháp vi tiêm là một lượng nhỏ DNA được tiêm
trực tiếp vào nhân tế bào phôi trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách
cơ học dưới kính hiển vi.
1.Máy gia cố kim
Microforge
2. Máy mài kim
3. Máy kéo kim tự
động Pipette Puller
Ðể biến nạp gen vào tế bào bằng phương pháp vi tiêm trước hết phải
chế tạo kim tiêm và kim giữ.
Kim được tạo ra từ những ống thuỷ tinh dẻo capillar đường kính 0,1-
1,5 mm có sợi bằng wolfram mảnh ở trong nhờ hệ thống thiết bị làm
kim.
Hệ thống này gồm có máy kéo kim tự động (pipette puller), máy mài
kim và máy gia cố kim.
Kỹ thuật vi tiêm

Kỹ thuật vi tiêm
Máy vi thao tác Olympus
(Hãng Narishige)
1. Kính hiển vi soi ngược
2. Máy vi điều chỉnh


Ðộ phóng đại thích hợp cho việc tiến hành vi tiêm vào phôi cá một tế
bào là khoảng từ 40-60 lần.


Máy vi thao tác gồm 2 phần giống
hệt nhau được bố trí hai bên kính
hiển vi, một dùng để điều chỉnh kim
tiêm, một dùng cho kim giữ.
Tính năng của máy này là cho phép
điều chỉnh các kim theo không gian
3 chiều.
Kim tiêm và kim giữ được lắp vào
máy vi thao tác và được
nối với syringe qua ống bằng chất
dẻo được nạp đầy dầu parafin.


Kỹ thuật vi tiêm
Kỹ thuật vi tiêm
Kính hiển vi dùng cho mục đích này là kính hiển vi soi ngược
(vật kính xoay ngược lên)

Sơ đồ tạo động vật chuyển gen
Vi tiêm ngoại lai tiền nhân của trứng thụ tinh