Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét bằng kỹ thuật Sinh học phân tử pptx

Chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét
bằng kỹ thuật Sinh học phân tử

Bệnh sốt rét là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu. Hằng năm,
căn bệnh này cướp đi sinh mạng của hàng triệu người trên thế giới, đặc biệt là ở
những nước đang phát triển.
Bệnh sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium (P. falciparum, P. vivax, P.malarie, P.
ovale) với trung gian truyền bệnh là muỗi cái Anopheles (hay còn gọi là muỗi đòn
xóc). Các triệu chứng điển hình của bệnh là sốt, đau đầu, nôn… Nếu không điều
trị kịp thời hoặc ký sinh trùng kháng lại thuốc có thể dẫn đến tử vong do ký sinh
trùng xâm nhập, phá vỡ hồng cầu làm tắc nghẽn các mạch máu.
Bên cạnh các phương pháp truyền thống được sử dụng để xét nghiệm phát hiện 4
loài ký sinh trùng sốt rét gây bệnh trên người như: nhuộm giemsa, QBC, ELISA,
Paracheck…Các kỹ thuật dựa trên nguyên lý của phương pháp PCR (Polymerase
chain reaction) như: Nested-PCR, Real-time PCR, LAMP đang được sử dụng rộng
rãi trong chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét.
1/ Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction):
Phương pháp PCR có khả năng tạo ra hàng triệu bản sao của trình tự gen mục tiêu
thông qua hoạt động sao chép tổng hợp mạch mới của enzyme DNA polymerase
trong điều kiện in vitro với sự hiện diện của các cặp mồi chuyên biệt.
Hiện nay, trên thị trường đã có bộ máy luân nhiệt sử dụng cho thực địa. Điều này
khắc phục được điểm yếu của phương pháp PCR là cần phòng thí nghiệm với các
máy móc chuyên dụng khá phức tạp.
Bộ trang thiết bị thí nghiệm PCR sử dụng ở thực địa
2/ Phương pháp Nested PCR:
Trong phương pháp Nested PCR (PCR lồng), sản phẩm của phản ứng PCR lần 1
sẽ làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2. Nested PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu để
nhân bản bộ gen của loài Plasmodium trong phản ứng PCR lần 1. Sau đó tiếp tục
sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale
trong phản ứng PCR lần 2. Kỹ thuật này có độ nhạy rất cao, có thể phát hiện ký
sinh trùng ở mật độ rất thấp mà các phương pháp thông thường khó có thể phát

hiện được (1-5 ký sinh trùng/1 µl máu). Đây được xem là “tiêu chuẩn vàng” mới
trong tầm soát ký sinh trùng sốt rét do độ nhạy và độ đặc hiệu cao của nó.

Kết quả chạy điện di phát hiện P. vivax và P. falciparum với các mật độ
ký sinh trùng khác nhau trong phương pháp Nested PCR
3/ Phương pháp Real-Time PCR:

Real-Time PCR có cùng nguyên lý với phương pháp PCR, cũng là một phản ứng
nhân bản các trình tự đặc hiệu nhưng có sử dụng chất phát huỳnh quang. Việc phát
hiện tín hiệu huỳnh quang được thực hiện ngay trong bước bắt cặp mồi và kéo dài.
Nhờ đó, phương pháp này vừa có thể phát hiện vừa có thể định lượng ký sinh
trùng trong mẫu xét nghiệm theo thời gian thực dựa trên mẫu dò.
Có 2 dạng cơ bản:
- Chất phát huỳnh quang liên kết với DNA mạch đôi (SYBR Green, Ethidium
bromide)

Nguyên lý Real-Time PCR với SYBR Green
- Chất phát huỳnh quang dùng đánh dấu mẫu dò đặc hiệu (TaqMan probe, Beacon
molecular, Hydrolysis probe, Hybridization probe,…)

Nguyên lý Real-Time PCR với Taqman probe
4/ Phương pháp LAMP (Loop-Mediated Isothermal PCR):
Đây là một phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử mới, đơn giản, rẻ tiền dùng
để xác định trình tự gen 18S ribosom RNA của P. falciparum. Phương pháp này
không cần các máy móc đắt tiền như PCR, nhiệt độ thực hiện cũng thấp hơn
(khoảng 65oC), thời gian thực hiện ngắn, chỉ bằng 1/3 so với phương pháp PCR
và có hiệu quả tương tự. Tuy nhiên, phương pháp này tương đối mới, các Primer
sử dụng phức tạp và cần có những nghiên cứu nhiều hơn trước khi áp dụng vào
việc chẩn đoán thường quy 4 loài ký sinh trùng sốt rét.

Phương pháp LAMP
Ưu điểm của các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử là có thể định danh và
định lượng ký sinh trùng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Đặc biệt thích hợp cho
những ca nhiễm ký sinh trùng ở mật độ thấp hoặc nhiễm phối hợp nhiều loài.
Tuy nhiên, hiện nay, kỹ thuật PCR vẫn chưa thể thay thế kỹ thuật xét nghiệm bằng
kính hiển vi trong chẩn đoán thường quy do quy trình thực hiện còn phức tạp, cần
có trang thiết bị chuyên biệt, phòng thí nghiệm phù hợp, hóa chất đắt tiền, kỹ thuật
viên phải được đào tạo và huấn luyện… Mặc dù vậy, với sự phát triển mạnh mẽ
của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng các kỹ thuật cao trong nghiên cứu sẽ đóng
một vai trò quan trọng trong công tác phòng chống bệnh sốt rét.