KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 5 ppsx

TAÏO DOØNG
HAI CHIE
Á
N L
Ö
ÔÏC TAÏO DO
Ø
NG
IN VIVO & IN VITRO
NGUYEÂN TA
É
C TAÏO DO
Ø
NG (
I
N VIVO)
CÁC BƯỚC TẠO DÒNG
Chuẩn bò
vector
Chuẩn bò
trình tự
tạo dòng
(insert)
Tạo vector
tái tổ hợp
Biến nạp
vector tái tổ
hợp vào vi
khuẩn
Chọn lọc
dòng cần

tìm
Xử lý
enzyme
tạo
đầu so
le, đầu
bằng
Nối
vector/
insert
W Hóa
biến nạp
W Điện
biến nạp
W Biến
nạp bằng
siêu âm, …
W DNA :
tách chiết
DNA bộ
gene, PCR,
tổng hợp
W RNA :
tách chiết
RNA và
RT, RT-
PCR
W Lai với
mẫu dò
đặc hiệu

W PCR
với mồi
đặc hiệu
W Sử
dụng
kháng
thể đặc
hiệu
CHUẨN BỊ
cDNA ĐỂ TẠO
DÒNG
mRNA
Ỉ
cDNA
Ỉ gắn thêm các
linker có mang
trình tự nhận biết
của RE
Ỉ
Cắt bằng RE
tương ứng tạo đầu
so le
X
Ử LY
Ù
ĐOẠN GA
É
N CHE
Ø
N CO

Ù
Đ
A
À
U BA
È
NG
W Gắn thêm các
linkers mang
trình tự nhận biết
của RE
W Vector có chứa
các trình tự nhận
biết của RE tương
ứng
TẠO DÒNG BẰNG
PCR
W Mồi (primer) dùng trong phản
ứng PCR có mang trình tự nhận biết
của RE
W Sản phẩm PCR được cắt bằng RE
phù hợp tạo đầu so le
W Nối với vector đã xử lý với cùng
loại RE
TẠO DÒNG TRONG
PLASMID
- Tạo plasmid tái tổ hợp
- Biến nạp tế bào E. coli : ủ chung với
plasmid TTH có hiện diện CaCl2 ; tạo
sốc nhiệt

- Nuôi trên đóa thạch có ampicillin để
chọn dòng vi khuẩn có thu nhận
plasmid TTH
- Thu nhận các dòng tế bào có chứa
plamid TTH
pBR322
W Plasmid theá heä thöù nhaát
W Plasmid theá heä thöù hai :
pBR322
W Plasmid theá heä thöù ba :
pUC, pSP, Bluescript,
PLASMID pUC18/19
TAÏO DO
Ø
NG TRONG
PLASMID pUC
BO GENE PHAGE VAỉ Sệẽ Tệẽ RAP
TẠO DÒNG VỚI VECTOR LÀ PHAGE
Thu nhận DNA phage
Ỉ
Loại bỏ trình tự không
cần cho sự đóng gói
Ỉ
Gắn trình tự cần tạo dòng
vào thay cho trình tự loại bỏ
Ỉ Đóng gói vào vỏ bọc của
phage
Ỉ
Đem xâm nhiễm tế bào vi
khuẩn để chuyển trình tự

cần tạo dòng vào vi khuẩn
TẠO DÒNG cDNA
TRONG PHAGE
O
Đem dung dòch phage tái tổ hợp trải trên lớp
tế bào vi khuẩn phủ đầy mặt thạch
Ỉ
tạo đóa
ly giải
TẠO ĐĨA LY GIẢI (PLAQUE ASSAY)
Bề mặt thạch phủ một lớp tế bào E. coli
Ỉ
Thêm huyền phù virus tái tổ
hợp
Ỉ
Phủ tiếp lên trên một lớp agar mềm
Ỉ
Ủ
Ỉ
Mỗi đóa ly giải tương
ứng với vùng ly giải do một phần tử virus gây ra
PHÁT HIỆN ĐĨA LY GIẢI CÓ CHỨA DÒNG CẦN TÌM
Hộp thạch với các đóa ly giải
È
p màng lai lên mặt thạch
È
Ủ màng lai trong dung dòch kiềm để
ly giải phage giải phóng DNA phage
È
Tiền lai - Lai với mẫu dò

È
Phát hiện phân tử lai
TOÅNG HÔÏP M13 MAÏCH ÑOÂI
COSMID VECTOR PHC79
TAÏO DO
Ø
NG BA
È
NG VECTOR COSMID
TAÏO NGAÂN HA
Ø
NG BO
Ä
GENE
TẠO DO
Ø
NG VỚI BAC (NHIỄM SA
É
C
THỂ NHÂN TẠO CỦA VI KHUẨN
TẠO DÒNG TRONG
VECTOR BIỂU HIỆN
W Vector biểu hiện là vector có
mang các promoter cho phép phiên
mã trình tự gắn chèn (insert)
W Sử dụng RNA polymerase phù
hợp với promoter để phiên mã
mạch muốn sử dụng làm khuôn
PHIEN MAế & DềCH MAế TRèNH Tệẽ TAẽO DOỉNG
TẠO DO

Ø
NG BA
È
NG VECTOR “CON THOI”
Mục tiêu : Nhân bản và chọn lọc trình tự gắn chèn (insert)
trong 2 loại tế bào chủ khác nhau
PHƯƠNG PHÁP IN
Dùng để tạo màng lai dùng
phát hiện dòng cần tìm
Dùng để chọn lọc dòng cần tìm
trên nhiều loại môi trường
khác nhau