Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống Thực vật

177
Chương 9
Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống
Thực vật
I. Mở đầu
bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gene ngoại lai trong tế bào thực
vật. Biến nạp của các tế bào vi khuẩn được thự
. Tuy
nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằng cách đưa DNA
ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp. Sử
dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases) để cắt phân tử DNA sợi
đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA-DNA và
các gene chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào
, động vật
và thực vật bậc cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di
truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ
ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền
lại cho các thế hệ sau của chúng.
Ý nghĩa thực tiễn của quá trình biến nạp là tạo ra những tính trạng mới
hoặc cải tiến những tính trạng đã có. Về một số phương diện nào đó, kỹ
thuật này có ưu điểm hơn so với phương pháp chọn giống bằng lai hữu
tính. Nếu ở phương pháp lai hữu tính, để chuyển được một gene hay một
số gene từ một giống này, qua một giống khác người ta phải tiến hành một
quy trình lai trở lại tốn rất nhiều thời gian và công sức. Trong khi đó kỹ
thuật chuyển gene không những cho phép vượt qua được những trở ngại
do sự xa cách về quan hệ họ hàng giữa thể cho gene và nhận gene mà còn
cho phép cây trồng tiếp nhận một cách nhanh chóng những gene mới do
con người thiết kế. Có thể thực hiện được điều này bằng cách sử dụng các
hệ thống vector sinh học, nhưng không phải đều có thể thực hiện được với

bất kỳ cây trồng nào. Việc tái sinh các cây được chuyển gene chủ yếu phụ
thuộc vào các tế bào soma có tính toàn thể, mà không phải là tế bào soma
nào cũng có khả năng đó.
Thành tựu nổi bậc của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là tái sinh
được cây biến nạp gene đầu tiên vào đầu thập niên 1980. Đến nay, các kỹ
thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau. Lúc
đầu người ta sử dụng các gene chỉ thị để biến nạp, nhưng nay đã thay thế
bằng các gene quan trọng có giá trị kinh tế.nhằm mục đích cải thiện phẩm
chất cây trồng. Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ
gene ở thực vật bậc cao là: các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ
những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các


178
loài thực vật khác nhau. Muốn chuyển một gene thành công cần phải
chứng minh hiệu quả của phương pháp biến nạp gene, nhưng đôi khi các
loài nghiên cứu hoặc không thể tái sinh được cây từ các mô không phân
hoá, hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn
chỉnh. Do đó hai nhân tố nói trên thường được nghiên cứu phát triển song
song.
Các chỉ thị biến nạp gene đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium
tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gene kháng kháng sinh.
Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong
các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng
hơn, việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế. Trở ngại lớn nhất là tính đặc
trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho
phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng. Sự phát triển của
các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra
một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương
pháp biến nạp gene trực tiếp. Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gene

(particle bombardment) dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại
nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật. Việc biến nạp ở
các loài cây trồng gặp nhiều thuận lợi hơn. Các phương pháp biến nạp
khác cũng có hiệu quả đối với các trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng
ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế. Chẳng hạn các phương pháp biến
nạp gene bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng
phần, phương pháp xử lý hoá học bằng PEG (polyethylene glycol),
phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế
bào, phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các
mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào, phương
pháp biến nạp gene qua ống phấn....
Kể từ khi tạo được cây chuyển gene đầu tiên, đến nay kỹ thuật này đã
có những bước tiến rất lớn. Những thành công của nó không chỉ giới hạn ở
những cây mang tính chất mô hình như thuốc lá và các cây họ cà, mf còn
đạt được những kết quả ứng dụng ở một số cây trồng quan trọng. Vì thế
chúng ta có cơ sở để hy vọng rằng trong tương lai kỹ thuật gene sẽ trở
thành một công cụ hỗ trợ không thể thiếu được của chọn giống thực vật.
II. Kỹ thuật chuyển gene
1. Những nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene
Có một số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gene.
Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có tính toàn thể, các cây
khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gene
lạ. Một loại cây nào đó có thể được biến nạp khi nó có khả năng tái sinh
và chấp nhận sự biến nạp. Mô tế bào là một tập hợp của nhiều tế bào có
phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động đến. Một số ít tế bào
trong cây có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Những tế bào


179
khác chỉ có một trong hai khả năng ấy. Một số lớn các tế bào trong cơ thể

có khả năng điều chỉnh được khả năng đó, một số khác ngược lại không
thể làm được. Tương quan giữa các quần thể tế bào kiểu như vậy phụ
thuộc vào loài, kiểu gene, cơ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ
quan.
Một trong các cơ chế có thể chuyển các tế bào từ trạng thái tiềm ẩn
sang trạng thái thực sự có khả năng tái sinh là sự xuất hiện thương tổn trên
cơ thể. Phản ứng với sự thương tổn có lẽ là cơ sở sinh học cho sự tăng
sinh và tái sinh của các tế bào soma. Tuy nhiên phản ứng này khác nhau
giữa các loài cây, cũng như giữa các nhóm tế bào trong cùng một cây. Nói
chung các cây hòa thảo và các cây họ đậu phản ứng này xảy ra rất yếu.
Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA. Vì thế gene chỉ có thể được
đưa vào tế bào thông qua Agrobacterium, virus, bằng phương pháp vi tiêm
hay bằng súng bắn gene. Việc chuyển gene chỉ thành công khi đưa được
gene vào nhóm tế bào có khả năng tái sinh và tiếp nhận gene lạ. Tuy
nhiên, khả năng biến nạp không có liên quan chặt chẽ với khả năng biểu
hiện của gene được biến nạp. DNA không phải của virus có thể liên kết
với hệ gene của vật chủ và không di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác.
Trong khi đó các DNA của virus có thể không liên kết với hệ gene của vật
chủ, thậm chí cả khi có rất nhiều bản sao trong tế bào chủ. DNA, RNA của
virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và có thể lan truyền khắp
trong cây trừ vùng mô phân sinh.
- Phản ứng của các loại tế bào thực vật với quá trình chuyển gene
Mục đích chính của một quy trình chuyển gene là đưa một cách ổn
định một đoạn DNA vào hệ gene nhân của các tế bào có khả năng phát
triển thành một cây biến nạp. Ở nhiều loài thực vật, sự xác định kiểu tế
bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp là điều khó khăn. Hạt
phấn hay tế bào trứng sau khi được biến nạp có thể được dùng để tạo ra
cây biến nạp hoàn toàn thông qua quá trình thụ tinh bình thường. Hạt phấn
thường được coi là đối tượng lý tưởng để gây biến nạp. Trong khi đó, việc
biến nạp gene vào hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn.

Trong trường hợp này, thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi. Việc
biến nạp đối với các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô
phân sinh thường cho ra những cây khảm.
Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây
hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay
phát sinh phôi. Các chồi bất định hay các phôi được hình thành từ các tế
bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và
có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh.
2. Các phương pháp chuyển gene ở cây trồng
Khi sử dụng nấm men, nấm, động vật hoặc thực vật như là vật chủ cho
tạo dòng, cần có phương pháp đưa DNA vào trong tế bào của những sinh


180
vật này. Nói chung ở một số loài vi khuẩn tế bào được xử lý bằng dung
dịch muối. Ở tế bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tiếp xúc với
lithium chloride hoặc lithium acetat. Vì vậy người ta sử dụng phương pháp
này thường xuyên khi biến nạp nấm men (Saccharomyce cerevisiae). Đối
với phần lớn sinh vật bậc cao hơn đòi hỏi phương pháp tinh vi hơn.
2.1. Biến nạp vào tế bào riêng lẻ
Cản trở lớn nhất ở sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế
bào. Tế bào động vật không có thành. Trong nuôi cấy, chúng được biến
nạp dễ dàng, đặc biệt khi DNA gắn trên bề mặt của tế bào nhờ kết tủa với
calcium phosphat (hình 9.1a). Các enzyme được sử dụng làm mất thành tế
bào của nấm men, các loại nấm khác, tế bào thực vật, và dưới những điều
kiện thích hợp, người ta có thể tạo ra tế bào trần (hình 9.1b). Tế bào trần
tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng. Có thể thực hiện chuyển nạp bằng
những phương pháp khác nhau:

Hình 9.1 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào

2.1.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes
mang các gene ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa
một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor
inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây (Hình 9.2).


181















Hình 9.2 Cấu trúc của Ti-plasmid

Hình 9.3 Agrobacterium gây khối u ở thực vật
A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất
là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm (Hình 9.3). Sự hình
thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần phải có sự hiện diện của
vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn

DNA của Ti-plasmid là T-DNA xâm nhập vào hệ gene của cây bị bệnh.
2.1.1.1. Ti-plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật
Tạo khối u
Tổng hợp nopaline
Sử dụng
nopaline
Điểm xuất phát
sao chép
Các chức năng
chuyển T-DNA


182
Phần lớn các loại Ti-plasmid gồm 4 vùng A, B, C, D.
Vùng A luôn luôn được truyền sang tế bào thực vật nên được gọi là T-
DNA (Transferred DNA), có chứa 2 hệ gene: Hệ gene gây khối u onc
(oncogeneic), chứa ít nhất 3 gene chịu trách nhiệm tổng hợp các hormone
auxin và cytokinin và do đó có liên quan đến việc sản sinh ra và duy trì sự
phân chia tế bào liên tục. Thứ hai là hệ gene mã hoá cho một số enzyme
điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amine hay đường
gọi là opine. Hai loại enzyme đã được nghiên cứu kỹ nhất là octopine
synthetase và nopaline synthetase.
Vùng B có liên quan đến sự tái sinh
Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp
Vùng D là vùng độc có chứa các gene vir, giữ vai trò quan trọng trong
việc chuyển T-DNA vào hệ gene nhân của tế bào thực vật
Ngoài ra mỗi Ti-plasmid còn chứa các gene nằm ngoài vùng T-DNA
mã hoá cho các enzyme phân giải ocpine để làm nguồn dinh dưỡng
cacbon và nitrogen cho vi khuẩn.
2.1.1.2. T-DNA và các trật tự biên 25 bp

Vùng T-DNA có kích thước từ 10 kb đến 20 kb, nằm kẹp giữ hai trật
tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái (left border – LB) và
biên phải (right border – RB). Toàn bộ phần giới hạn giữa hai đoạn biên
này đều được chuyển sang tế bào thực vật. LB và RB là những yếu tố cần
thiết để định hướng cho sự chuyển DNA. Việc mất đi 6 bp đầu tiên hoặc
10 bp cuối cùng trong số 25 bp đều ngăn cản sự chuyển của T-DNA. Quá
trình chuyển của T-DNA được bắt đầu từ vị trí RB và kết thúc ở vị trí LB.
Sự định hướng này là rất quan trọng nếu không việc chuyển sẽ kém hiệu
quả. Trong các gene được mã hoá ở vùng T-DNA có 3 gene rất quan trọng
trong việc phát triển khối u: một gene mã hoá cho việc chuyển enzyme
AMP-isopentonyl transferase và 2 gene mã hoá cho enzyme tham gia vào
sinh tổng hợp auxin (tryptophane-2 mono oxygenase và acetamid
hydrolase). Sự hoạt động của các gene này tạo điều kiện cho sự phát triển
của tế bào thực vật có sự phụ thuộc vào auxin và cytokinin. Đặc điểm này
được sử dụng để chọn lọc các tế bào được biến nạp từ trong phần lớn các
tế bào không được biến nạp.
2.1.1.3. Vùng vir
Chính hoạt động của vùng vir đóng vai trò quan trọng cho việc chuyển
T-DNA sang tế bào thực vật. Nó có kích thước khoảng 40 kb và gồm 6
operon: virA, B, D và G là toàn toàn cần thiết cho việc tạo ra độc tính, còn
virC và E có liên quan với việc hình thành khối u. Trừ virG và A, các
operon khác đều là đa cistron. Nói chung gene virA biểu hiện ở mọi điều
kiện, gene virC biểu hiện thấp ở các tế bào sinh dưỡng nhưng thể hiện rất
mạnh ở các dịch chiết từ các mô bị tổn thương. Hoạt động của các operon
này có liên quan chặt chẽ với sự có mặt của các hợp chất phenol được tiết


183
ra từ vết thương của cây. Từ vết thương của cây thuốc lá người ta đã tinh
chiết và xác định được các hợp chất này là acetosyringon và alpha

hydroxyacetosyringon.
2.1.1.4. Quá trình chuyển T-DNA
Đoạn T-DNA muốn được chuyển, trước tiên nó cần phải được hoạt
hoá nhờ hoạt động của các gene vir. Hoạt động này xảy ra khi
Agrobacterium bắt đầu tiếp xúc với hợp chất chứa phenol được chiết ra từ
vết thương của cây hoặc từ các tế bào nuôi cấy hoặc protoplast.
Đầu tiên là sự hoạt động của các sản phẩm được tạo ra từ gene virA
(protein virA). Protein này nằm ở màng trong của tế bào Agrobacterium,
đóng vai trò như là một chất thụ cảm đối với acetosyringon có trong môi
trường. Tín hiệu này sẽ được truyền dẫn qua sự hoạt hoá (có lẽ bằng việc
phosphoryl hoá) gene virG. Protein virG sau đó lại gắn vào gene chỉ huy
nằm sát gene khởi động thuộc các gene vir khác. Bằng cách như vậy,
protein của gene virG đã được hoạt hoá làm tăng quá trình phiên mã của
chính nó, đồng thời làm giảm quá trình này của các operon B, C, D và E.
Trong tiến trình chuyển T-DNA, ở giai đoạn đầu xuất hiện các vết cắt
Ti-plasmid tại hai trật tự biên 25 bp, ở vị trí base thứ ba và thứ tư của
mạch đơn phía dưới mới được tổng hợp. Từ đó, một mạch T-DNA được
giải phóng ra khỏi Ti-plasmid và thay vào đó là một mạch đơn mới được
tổng hợp theo hướng 5’-3’, bắt đầu từ chỗ đứt của trật tự biên phải. Điều
này giải thích tại sao trật tự biên phải lại cần thiết cho sự chuyển T-DNA.
Operon D chủ yếu mã hoá cho một loại endonuclease tạo ra các vết cắt nói
trên tại hai trật tự biên. Sự hình thành mạch đơn T-DNA được tăng cường
nhờ sự tương tác giữa protein virD2 với một hoặc hai protein do gene virC
mã hoá. Protein gene vir E2 gắn vào mạch đơn T-DNA sau khi được cắt ra
làm cho nó ổn định trong quá trình chuyển vào nhân tế bào thực vật. Phức
hợp protein-mạch đơn T-DNA là cấu trúc cần thiết cho việc chuyển T-
DNA sang tế bào thực vật và nó phải được sản sinh ra từ Agrobacterium.
Gene virB mã hoá cho ít nhất 11 protein để hình thành nên một cầu nối,
cho phức hợp trên chuyển từ Agrobacterium sang tế bào thực vật.
Tế bào thực vật bị thương tổn là nơi chuyển gene T-DNA. Trong các

mô được sử dung để chuyển gene, lá là nguồn tốt nhất cho tái sinh (Hình
9.4). Những tế bào ở mép lá bắt đầu tái sinh và khi những đĩa lá này được
nuôi cấy trên môi trường chứa Agrobacterium, những tế bào này rất hiệu
quả cho tác nhân chuyển gene. Kỹ thuật đĩa lá được sử dụng hiệu quả cho
chuyển gene vào thực vật nhờ sử dụng Ti-plasmid của Agrobacterium.
2.1.2. Chuyển nạp gene trực tiếp vào protoplast
Hầu hết các tế bào thực vật được bao bọc bởi thành cellulose nên khó
để hấp thụ các phân tử DNA ngoài vào tế bào. Tuy nhiên thành tế bào có
thể làm tan nhờ xử lý tế bào với enzyme cellulase (Hình 9.5). Kết quả thu
được các protoplast chỉ còn màng sinh chất rất thuận lợi cho các thao tác


184
thí nghiệm. Protoplast có thể hấp thụ các đại phân tử như DNA và chúng
có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua sự tạo thành callus.

Hình 9.4 Tái sinh cây từ đĩa lá nhiễm Agrobacterium
Mặc dầu protoplast đã được sử dụng thành công cho nhiều loài, tuy
nhiên hầu hết các cây nông nghiệp quan trọng như ngũ cốc là rất khó tái
sinh từ protoplast.
Gần đây đã thu được một vài thành công trong sinh trưởng ở lúa và
ngô từ protoplast của nuôi cấy tế bào phát sinh phôi. Phôi thực vật sinh
trưởng in vitro là nguồn tế bào quan trọng cho nuôi cấy. Các cây lúa và
ngô hữu thụ được tạo thành từ những tế bào được thao tác di truyền thu
được từ nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi.
2.1.2. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng xung điện
Tế bào được đặt ở trong một thiết bị có hiệu điện thế cao, xung điện


185

tạo các lỗ tạm thời (cỡ 30 nm) ở trên màng tế bào và DNA có thể xâm
nhập vào chất nguyên sinh. Bên cạnh những phương pháp biến nạp, người
ta còn sử dụng các phương pháp vật lý để đưa DNA vào trong tế bào.
2.1.3. Chuyển gene bằng phương pháp bắn gene

Hinh 9.5 Tái sinh cây từ protoplast


186
Đây là phương pháp hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng
thí nghiệm công nghệ sinh học thực vật ở trong nước và trên thế giới.
Phương pháp này được Sanford (Cornell University, USA) đề xuất lần đầu
tiên vào năm 1987. Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng viên đạn
có kích thước hiển vi, tỷ trọng cao đạt gia tốc cao xuyên qua vỏ và màng
tế bào, đưa lớp DNA bọc ngoài tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào.
1-1,5 μm được dùng làm vi đạn
(microprojectile). Vi đạn được trộn với DNA theo một tỷ lệ thích hợp
cùng với các chất phụ gia và sau khi kết tủa DNA bao quang vi đạn, hỗn
hợp được làm khô trên một đĩa kim loại mỏng kích thước 0,5-0,8 cm. Đĩa
kim loại được gắn vào đầu một viên đạn lớn (macroprojectile) vừa khít với
nòng súng. Thường đạn lớn làm bằng nhựa hoặc bông nén hay các vật liệu
nhẹ. Khi bắn, áp suất hơi đẩy viên đạn lớn đi với tốc độ cao. Ra khỏi đầu
nòng, một lưới thép mịn cản viên đạn lớn lại, nhưng các vi đạn vẫn tiếp
tục quỹ đạo với gia tốc lớn đến đích và xuyên vào tế bào. Một tỷ lệ nhất
định DNA ngoại lai hội nhập với DNA tế bào và biểu hiện, thực hiện quá
trình biến nạp gene (Hình 9.6).

Hình 9.6 Sơ đồ súng bắn gene
2.1.4. Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào bằng kỹ thuật vi tiêm
(microinjection)

ông ở khá
nhiều đối tượng thực vật (Hình 9.7). Tuy nhiên, kỹ thuật này hiện nay ít
được các phòng thí nghiệm sử dụng, vì thao tác vi tiêm dưới kính hiển vi
đòi hỏi thiết bị vi thao tác (micromanipulator) cực nhạy, thiết bị kéo và
mài kim tiêm từ các ống thủy tinh (puller) rất đắt tiền. Ngoài ra, nó còn
đòi hỏi kỹ năng thao tác và sự kiên nhẫn cao của kỹ thuật viên.

Hình 9.7 vào tế bào


187
2.2. Biến nạp toàn bộ cơ thể
Ở động vật và thực vật sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế
bào biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được
tái sinh dễ dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên có vấn đề với phương
pháp tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và các loại cỏ khác. Từ một tế
bào biến nạp duy nhất người ta có thể tạo ra một cây chuyển gene, trong
đó mỗi tế bào của nó mang DNA tạo dòng và tiếp tục chuyển cho thế hệ
sau, sau khi nở hoa và tạo hạt. Tế bào động vật không thể tái sinh từ tế bào
nuôi cấy, vì vậy người ta cần một phương pháp khác cho biến nạp động
vật. Phương pháp tiêu chuẩn ở động vật có vú (ví dụ như chuột) là những
trứng đã được thụ tinh được lấy ra từ ống dẫn trứng, DNA được đưa vào
bằng phương pháp vi tiêm và tế bào biến nạp sau đó được nuôi cấy trở lại
trong bộ phận sinh sản của cơ thể mẹ.
2.3 Một số thành tựu của việc tạo các cây trồng biến đổi gene trên thế giới
và ở Việt nam
2.3.1. Một số loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành công
Nói chung, hầu hết các loài thực vật đều có thể biến nạp được gene.
Bảng 9.1. trình bày các loài cây trồng chính đã được biến nạp gene thành
công. Thông thường hiệu quả biến nạp gene khác nhau tuỳ thuộc vào

thừng loại cây trồng và quá trình biến nạp gene vẫn còn bị hạn chế ở nhiều
loài. Ở đây chỉ minh hoạ các kết quả biến nạp gene thành công ở các giống
cây trồng quan trọng.
- Cây ngô:
1988). Tuy nhiên, có thể
dùng phôi ngô trong nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh
các cây hữu thụ mang gene biến nạp, sử dụng phương pháp bắn gene và
chọn lọc bằng chất diệt cỏ “bialaphos” đã cho kết quả là mô callus phát
sinh các phôi được biến nạp gene. Các cây biến nạp gene hữu thụ đã được
tái sinh, ổn định di truyền và biểu hiện gene bar
) cùng với hoạt tính chức năng của enzyme
phosphinothricin acetyltransferase quan sát được trong những thế hệ sau.
Hiện nay biến nạp gene ở ngô bằng phương pháp bắn gene đã được sử
dụng rộng rãi. Gần đây các kết quả biến nạp gene gián tiếp ở ngô nhờ
Agrobacterium cũng đã được thông báo. Các thể biến nạp gene của dòng
ngô lai gần (inbredline) A188 đã được tái sinh sau khi nuôi cấy chung
(cocultivation) giữa vector “super-binary” với phôi non. Tần số được
thông báo ở dòng A188 là khoảng 5-30%. Các thể lai thế hệ thứ nhất giữa
dòng A188 và 5 dòng lai gần khác được biến nạp với tần số khoảng 0,4-
5,3% (tính theo số cây biến nạp gene độc lập/phôi).


188
9.1.
TT Loài Phương pháp biến nạp gene Thử nghiệm đồng ruộng
1 Chuối Bắn gene/Agrobacterium -
2 Luá mạch Bắn gene Kháng virus
3 Đậu tây Bắn gene -
4 Canola Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ,
điều khiển sự thụ phấn

5 Sắn Bắn gene/Agrobacterium -
6 Ngô Bắn gene/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống
chịu chất diệt cỏ
7 Bông Bắn gene/Agrobacterium Kháng côn trùng, chống
chịu chất diệt cỏ
8 Đu đủ Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus
9 Đậu phụng Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus
10 Bạch dương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ
11 Khoai tây Agrobacterium Kháng côn trùng, virus,
chống chịu chất diệt cỏ
12 Lúa Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ
13 Đậu tương Bắn gene/Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ
14 Bí Bắn gene/Agrobacterium Kháng virus
15 Củ cải đường Agrobacterium Chống chịu chất diệt cỏ
16 Mía Bắn gene -
17 Hướng
dương
Bắn gene -
18 Cà chua Agrobacterium Quả chín muộn, kháng
virus
19 Lúa mì Bắn gene -
- Cây lúa:
đây chưa đến 10 năm. Các nghiên cứu sau đó cũng đã sử dụng hai kỹ thuật
này để biến nạp gene vào protoplast và phục hồi các
: Taipei
309) nhưng hầu hết các giống japonica ưu tú cũng như phần lớn các giống
indica là khó tái sinh cây từ protoplast. Phương pháp bắn gene cho phép
thực hiện biến nạp gene hiệu quả ở lúa trong các kiểu gene độc lập. Hiện

189
nay, hơn 40 giống đã được biến nạp gene thành công. Mẫu vật sử dụng là
phôi non và các callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành. Hygromycin B là
marker chọn lọc thường dùng cho lúa. Tần số biến nạp có thể cao tới 50%
(tính theo số cây biến nạp gene có nguồn gốc độc lập/ số mẫu được bắn
gene). Gần đây, kỹ thuật biến nạp gene ở lúa thông qua Agrobacterium
cũng đã có những cải tiến có hiệu quả tương đương với kỹ thuật bắn gene.
- Cây lúa mì: Phương pháp bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp
gene ở lúa mì. DNA ngoại lai được bắn vào trong vảy nhỏ (scutellum) của
phôi non của hai giống lúa mùa xuân và một giống lúa mùa đông. Các
callus chống chịu được chọn lọc bằng phosphinothricin hoặc các nhân tố
ức chế trao đổi chất tương tự như basta, bialaphos hoặc glufosinate
ammonium. Chọn lọc bằng các hợp chất như thế không hiệu quả lắm và
kết quả là một số lớn cây thất thoát. Phân tích di truyền và phân tử đã xác
nhận sự hợp nhất ổn định của các gene biến nạp. Nói chung công nghệ di
truyền lúa mì vẫn còn tập trung ở một hoặc hai giống đặc trưng có khả
năng tái sinh cây nhanh, thích hợp với phương pháp bắn gene.
- Cây lúa mạch: Wan và Lemaux (1994), đã tái sinh một số lượng lớn
các cây lúa mạch biến nạp gene độc lập, tự thụ phấn. Các phôi hợp tử non,
các callus mới hình thành và các phôi có nguồn gốc từ tiểu bào tử hạt phấn
đã được dùng để bắn gene với plasmid mang gene bar gus
lùn vàng ở lúa mạch. Kiểm tra khả năng nảy mầm của phôi non để phân
lập các cây biểu hiện hoạt tính bar bằng môi trường chứa bialaphos, mặc
dù đây chưa phải là một chất chỉ thị tốt cho sự có mặt hoặc không của
gene.
- Cây đậu tương: Những cố gắng đầu tiên của cây đậu tương biến nạp
tập trung ở việc tái sinh cây từ protoplast và nuôi cấy dịch huyền phù phát
sinh phôi. Mặc dù có những thành công ban đầu, tiến triển của công việc
này vẫn còn chậm và việc phục hồi các cây biến nạp gene vẫn đang còn
gặp nhiều khó khăn. Công nghệ biến nạp gene ở đậu tương đã có triển

vọng hơn nhờ sự phát triển và tối ưu hoá của kỹ thuật bắn gene. Thực tế,
đậu tương đã được dùng như một cây mô hình để phát triển kỹ thuật cho
nhiều loài cây trồng khó áp dụng công nghệ di truyền. Kết quả đầu tiên ở
đậu tương là phục hồi thành công cây biến nạp gene nhờ Agrobacterium.
Phương thức này dựa vào sự phát sinh chồi từ lá mầm của giống Peking
chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium. Các mẫu lá mầm được
xâm nhiễm với Agrobacterium mang plasmid kháng kanamycin và có hoạt
tính gusA, hoặc kháng kanamycin và chống chịu glyphosate. Có thể biến
nạp gene hiệu quả vào
dụng nhưng rất khó tái sinh được cây. Để biến nạp gene vào các giống đậu
tương khác nhau, người ta đã phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản -
phương thức tái sinh cây độc lập (dựa trên cơ sở sự tăng sinh c


190
đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai. Hàng trăm cây
đậu tương có nguồn gốc độc lập đã thu được và kết quả biến nạp đã cho
nhiều phenotype khác nhau. Nói chung ở các dòng đậu tương biến nạp
gene có nhiều bản sao của các gene biến nạp (số bản sao khoảng từ 1-50
nhưng thường thay đổi từ 2-10). Phân tích DNA (southern blot) ở thế hệ
sau của các bản sao gene phức cho thấy tất cả các bản sao cùng tách rời,
như thế mỗi thể biến nạp sơ cấp chỉ hiện diện một kết quả biến nạp độc lập
và có thể sự tái tổ hợp thống nhất đã không xuất hiện thường xuyên.
- :
Phaseolus thành công rất ít. Hai hướng được ứng dụng trong công nghệ di
truyền ở đậu tây là kỹ thuật xâm nhiễm bằng Agrobacterium và bắn gene.
Tuy nhiên, chỉ có kỹ thuật sau mới có khả năng phục hồi các cây biến nạp.
Cây đậu tây biến nạp biểu hiện các gene gusA, bar và protein vỏ của virus
khảm màu vàng đã được phục hồi. Các cây biến nạp gene qua năm thế hệ
tự thụ phấn vẫn không mất các gene biến nạp hoặc khả năng biểu hiện. Kỹ

thuật bắn gene cũng được sử dụng để biến nạp gene gusA được điều khiển
bằng promoter concanavalin A, hoạt tính gus đã biểu hiện trong lá mầm và
vỏ hạt của các cây biến nạp.
- Cây bông: Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium
tumefaciens là kỹ thuật đầu tiên được sử dụng để biến nạp gene vào cây
bông giống Coker 312 (Umbeck 1987). Cây bông biến nạp gene cũng của
giống t
1990). Hầu hết các giống bông có giá
trị kinh tế khác không thể tái sinh cây từ giai đoạn callus. Một số ít các
giống đó có thể tái sinh cây nhưng quá trình này thiên về biến dị dòng vô
tính (somaclonal variation). Phương thức phân phối gene ngoại lai trực
tiếp vào mô phân sinh của trụ phôi cũng đã được phát triển và đã phục hồi
cây biến nạp gene.
2.3.2
sống tự do hoặc cộng sinh tồn tại
phương thức biến đổi nitơ phân tử của khí trời thành dạng NH
3
.
Nitrogenease
N
2
...
NH
3

- nif) chỉ tồn tại ở
một số loài tảo lam và vi khuẩn nốt sần sống cộng sinh với các loài họ đậu
(Fabaceae). Dùng kỹ thuật tách gene nif từ các cơ thể cố định đạm chuyển
sang các cây trồng quan trong như lúa, ngô là một mô hình lý tưởng của
các nhà tạo giống (Hình 9.8).

191

Hình 9.8 Mô hình biến nạp gene nif
Quá trình cố định đạm thông qua enzyme nitrogenease phải xảy ra
trong điều kiện yếm khí nghĩa là không có mặt O
2
ở vùng phản ứng. Điều
kiện này được thực hiên ở các nốt sần của cây họ đậ
2
được vùng phản ứng sạch O
2
hoặc đưa vào tế bào một cơ chế bảo vệ như
legoglobin. Đó là mộ
) đang tìm cách giải quyết.
III. Kỹ thuật RFLP
1 Đại cương về kỹ thuật RFLP
Kỹ thuật này dựa trên cơ sở đặc hiệu trong việc cắt đoạn DNA của
một loại hình enzyme đặc hiệu gọi là enzyme giới hạn. Khi sử dụng một
hay nhiều enzyme giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho
những đoạn DNA dài ngắn khác nhau. Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ
gene (sự đảo gene, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp...) đều dẫn
đến sự thay đổi các điểm cắt và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ
cho bản đồ enzyme giới hạn khác biệt. Cá thể đã có sự biến đổi di truyền
nhất định, hay nói cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác.
Kỹ thuật RFLP dễ làm, có độ chính xác cao và có thể thực hiện trên
DNA của nhiều cá thể trong thời gian ngắn. Sau khi xử lý kết quả nhiều
lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gene của mỗi cá thể thuần chủng
sẽ cho một bản đồ gene xác định và giống nhau. Ngược lại khi bị biến đổi,

các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau. Độ sai khác càng xa
thì sự biến chủng càng lớn. Khi độ sai khác cao hơn mức xác định, các cá