KỸ THUẬT DI TRUYỀN - PHẦN 4 ppt

LAI PHÂN TỬ
1. ĐÁNH DẤU MẪU DÒ DNA, RNA,
OLIGONUCLEOTIDE
2. CÁC KIỂU LAI
W
Lai trong pha lỏng
W
Lai trên pha rắn (Southern, Northern,
dot blot)
W
Lai tại chỗ
3. ỨNG DỤNG
CÁC PHÂN TỬ DÙNG ĐÁNH DẤU HOÁ HỌC
Có ái lực với anti-
Digoxigenin
Dùng phối hợp với
dATP, dCTP,
dGTP, dTTP
Có ái lực với
streptavidin
Dùng phối hợp với
dATP, dCTP,
dGTP, dTTP
ĐÁNH DẤU BẰNG BIOTIN
Đánh dấu mẫu dò (probe) Ỉ Lai với trình tự mục tiêu Ỉ Phát hiện phân tử lai
thông qua phức hợp avidin/chất phát huỳnh quang
PH
Ư
ƠNG PHA
Ù
P NICK TRANSLATION

W “Đục lỗ” trên 2 mạch của
DNA bằng Dnase I
W DNA polymerase I sử
dụng haọt tính 5’-3’
exonuclease “gặm” mạch
DNA theo chiều 5’-3’
W DNA polymerase I vừa
thủy phân vừa tổng hợp
mạch mới bù vào lỗ trống
với các dNTP (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP, dUTP đánh
dấu)
W Kết quả là probe được
đánh dấu
PHƯƠNG PHÁP RANDOM PRIMING
W Biến tính mạch đôi DNA
W Bắt cặp tổ hợp “ mồi“ ngẫu
nhiên trên 2 mạch
6
4
= 1296 primers
W DNA polymerase tổng hợp bù
vào chỗ trống bằng các dNTP
trong đó có nucleotide đánh
dấu
W Kết quả là probe đánh dấu
PHÖÔNG PHAÙP
ÑAÙNH DAÁU
OLIGONUCLEOTIDE
PHAÛN ÖÙNG

PHOSPHATASE
PHAÛN ÖÙNG
KINASE
PHÖÔNG PHAÙP ÑAÙNH DAÁU
OLIGONUCLEOTIDE SÖÛ DUÏNG
TERMINAL TRANSFERASE
TỔNG HP MẪU DÒ
RNA BẰNG PHIÊN
MÃ IN VITRO
W Trình tự sẽ dùng làm probe được tạo
dòng vào vector biểu hiện
W Tùy mạch muốn dùng làm probe sẽ
sử dụng promoter tương ứng
W RNA polymerase nhận biết promoter
đặc hiệu, gắn vào và tổng hợp RNA
W Nucleotide tự do dùng trong quá
trình phiên mã có mang một phần
nucleotide đánh dấu
W Kết quả là mẫu dò RNA đánh dấu
(riboprobe)
TỔNG HP MẪU DÒ RNA BẰNG PCR VÀ
PHIÊN MÃ IN VITRO
gene A
T7 promoter
PCR
Phiên mã in vitro với T7
RNA polymerase
Mẫu dò RNA
Thay vì tạo dòng thì sử dụng PCR để gắn thêm trình tự promoter phù
hợp

Quá trình tiếp theo giống như tạo dòng
SOUTHERN BLOT
SOUTHERN BLOT (tiếp)
Tách chiết & cắt
DNA bằng enzyme
giới hạn
Điện di Chuyển lên màng lai Lai và phát hiện phân tử lai
Biến tính DNA Tiền lai
LAI TRÊN PHA RA
É
N
& PHÁT HIỆN PHÂN
TỬ LAI BẰNG ĐỒNG
VỊ PHÓNG XẠ
Cố đònh
DNA lên
màng lai
Lai với mẫu
dò đánh dấu
phóng xạ
Rửa màng lai
Thực hiện
phóng xạ tự ghi
SOUTHERN -
NORTHERN
BLOT
KẾT QUẢ NORTHERN BLOT
Ghi chú : UN : Mẫu chứng khôn cảm ứng, 48h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 48
giờ, 96h : mẫu cảm ứng tạo E-globin sau 96 giờ. Mẫu dò đồng vò phóng xạ
DOT BLOT

Tách chiết DNA, RNA
Ỉ
Biến tính
(nếu có)
Ỉ
Đặt lên màng lai
Ỉ
Tiền
lai
Ỉ
Lai với mẫu dò (trình tự đã
biết)
Ỉ
Phát hiện phân tử lai
Dùng để phát hiện, hoặc đònh lượng
tương đối khi so với thang hàm
lượng đã biết
Phương pháp cải biên là reverse
dot blot. Trình tự đã biết được cố
đònh trên giá thể còn trình tự cần
biết (mục tiêu) được đánh dấu
WESTERN BLOT
Điện di trên
gel
polyacrylamide
Chuyển lên
màng lai
Liên kết với kháng thể 1 &
2. Rửa để loại kháng thể
thừa

Phát hiện màu
thông qua phản ứng
enzyme
CAÉT MAÃU CHO LAI “TAÏI CHOÔ (IN SITU
HYBRIDIZATION)
KẾT QUẢ LAI TRÊN NHIỄM SẮC THỂ
LAI “TẠI CHỖ” TRÊN PHÔI
Cố đònh mẫu (formol, đông lạnh)
Ỉ
Cắt lát mỏng (microtome)
Ỉ
Cố đònh
trên lam kính
Ỉ
Xử lý mẫu trước khi lai
Ỉ
Tiền lai
Ỉ
Lai với mẫu dò
đánh dấu hóa học hay đồng vò phóng xạ
Ỉ
Rửa
Ỉ
Phát hiện phân tử lai
Ỉ
Quan sát dưới kính hiển vi
NGUYÊN TẮC CỦA
MICROARRAY
- Tách mRNA từ tế bào nuôi cấy
- Phiên mã ngược thành cDNA có đánh

dấu huỳnh quang khác nhau
- Trộn chung 2 loại cDNA đánh dấu
- Rửa, loại các thành phần thừa
- Đo cường độ phát huỳnh quang ở từng
điểm :
Điểm phát màu vàng : gene biểu hiện
như nhau trong 2 lọai tế bào
Điểm phát màu xanh : gene của tế bào
nuôi trong glucose biểu hiện mạnh hơn
Điểm phát màu đỏ : gene của tế bào
nuôi trong ethanol biểu hiện mạnh hơn
KEÁT QUAÛ MICROARRAY
VÍ DỤ : PHÁT HIỆN
BỆNH HỒNG CẦU
HÌNH LIỀM BẰNG
SOUTHERN BLOT
- Tách DNA
- Cắt bằng enzyme MstII
- Chạy điện di
- Lai với mẫu dò
E
-globin đánh dấu
phóng xạ
- Phát hiện bằng phóng xạ tự ghi
mẫu DNA bệnh dựa vào kích thước
trình tự cho tín hiệu lai
KYÕ THUA
Ä
T “ÑI BO
Ä

TREÂN NHIE
Ã
M SA
É
C THE
Å
(CHROMOSOME WALKING)
KEÁT QUAÛ RFLP TRONG NGHIEÂN CÖÙU
PHAÛ HEÄ
CÂU HỎI PHẦN 4
1. Cách đánh dấu mẫu dò bằng đồng vò phóng xạ ? Bằng hóa học ? Ưu nhược
điểm của từng loại tác nhân ?
2. Cách đánh dấu mẫu dò có bản chất là DNA, RNA, oligonucleotide
3. Southern blot
z
Northern blot
z
dot blot đïc thực hiện như thế nào ?
4. Cho ví dụ về việc sử dụng reverse dot blot
5. Cách tiến hành Southern blot, Northern blot, dot blot
6. Ứng dụng của Southern blot, Northern blot, dot blot
7. Cách tiến hành và ứng dụng của phương pháp lai tại chỗ
8. Cách phát hiện phân tử lai với mẫu dò đồng vò phóng xạ ? Hóa học ?
9. Cách tiến hành phương pháp sử dụng microarray và ứng dụng của microarray
10. Kỹ thuật đi bộ trên nhiễm sắc thể : cách làm và ứng dụng