Chương 3: Phương pháp nghiên cứu mô học ppt

CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MÔ HỌC

Tại sao phải nghiên cứu mô học?

Vai trò của mô học trong công tác
nghiên cứu về thủy sản như thế
nào?

Mô học hiện nay đã phát triển như
thế nào?
Lịch sử nghiên cứu mô học


TK XVII TK XIX Hiện nay
Bắt đầu
nghiên cứu
mô học
Được công
nhận, phát
triển mạnh
vào cuối tk
19
Phát triển
nhiều kĩ
thuật mới
Phương pháp nghiên cứu mô học

Qui trình cơ bản trong nghiên cứu
mô học:
1. Cố định mẫu

2. Xử lí mẫu
3. Nhuộm mẫu
4. Đọc mẫu mô
1. Cố định mẫu:
Tại sao phải cố định mẫu?

Mẫu mô hay cơ quan của cá hoặc tôm
sau khi tách ra khỏi cơ thể sẽ chết đi và
trải qua quá trình hoại tử và nhanh
chóng tan rã (trump et al., 1980)

Vì vậy cần phải ngăn chặn sự hoại tử và
tan rã đó bằng việc cố định nhanh và ít
gây ra sự thay đổi cấu trúc nhất.
Mục tiêu cố định mẫu:

Ngăn chặn sự hoại tử và tan rã

Làm các tổ chức mô giữ vững cấu
trúc trong suốt quá trình xử lý và
nhuộm mẫu bằng nhiều loại hóa
chất khác nhau.

Một mẫu mô được cố định tốt khi
những tế bào cấu tạo nên mô đó
vẫn giữ nguyên hình dáng, thể hiện
được nhiều chi tiết và cấu trúc,
đồng thời giữ được mối liên quan
tương hỗ trong tế bào và mô giống
như còn sống


Mô có thể được cố định bằng nhiều
phương pháp:

Vật lí : nhiệt độ

Hóa học: các loại hóa chất

Các loại hóa chất cố định

Bouin:

AFA Davidson:

Formol trung tính (10%):

Việc chọn dung dịch cố định phụ
thuộc vào mục đích nghiên cứu
Thí dụ:

Sử dụng bouin trong nghiên cứu sự
phát triển tuyến sinh dục

Sử dụng AFA để cố định mẫu mo
bệnh học trên tôm…
Phương pháp cố định

Kích thước mẫu có ảnh hưởng đến
hiệu quả cố định


Tuy nhiên, độ dày của mẫu có tính
quyết định đến hiệu quả cố định

Đối với loại dung dịch cố định có
khả năng ngấm kém, chiều dày
mẫu mô không quá 1-2mm

Nếu dung dịch có khả năng ngấm
mạnh và sâu thì chiều dài của nó
không quá 5mm

Thể tích dung dịch cố định: thể tích
dung dịch cố định cần lớn hơn nhiều
so với thể tích mẫu mô (ít nhất 50
lần)

Thời gian cố định: thời gian cố định
phụ thuộc vào từng loại dung dịch
cố định, thường dao động từ 2-4h

Nhiệt độ cố định: Nhiệt độ cao làm
tăng và lạnh làm chậm khả năng
ngấm của dung dịch cố định. Đối với
loại dung dịch cố định dễ bay hơi
nên tiến hành ở nhiệt độ thấp.

Quá trình pha hóa chất cố định nên
thực hiện trong tủ hút

Sau khi cố định thì mẫu cần phải

được rửa (dung dịch cố định có thể
làm thay đổi tính bắt màu của tế
bào)

Thời gian rửa bằng với thời gian cố
định

Có thể rửa bằng nước hoặc cồn.
Cắt tỉa, định hướng mô

Mục đích: Định hướng những mô
cần quan sát.

Mẫu mô có thể được cắt bỏ những
phần không cần thiết, giúp tiết kiệm
thời gian trong quan sát
Qui trình xử lý mẫu
1. Loại nước
2. Làm trong mẫu
3. Ngấm paraffin
1. Loại Nước

Việc khử nước phải đảm bảo nguyên
tắc là loại bỏ hết nước trong mô mà
không làm tế bào bị biến dạng hoặc
không làm vị trí của thành phần cấu
tạo tế bào trong mô bị thay đổi

Quá trình loại nước được thực hiện
bằng cách nhúng mẫu mô qua hàng

loạt các dung dịch cồn có nồng độ
từ thấp đến cao. Thời gian khử nước
tùy theo độ dày của mẫu mô
Ví dụ: xử lí mẫu qua cồn 50-70-95-
100
2. Làm trong mẫu

Mục đích:Do paraffin không thể hòa
tan vào cồn nên cần một dung môi
vừa có khả năng hòa tan cồn và
paraffin.

Có nhiều loại dung môi làm trong
mẫu: chloroform, xilen…

Các dung môi này thường có chỉ số
khúc xạ cao.
3. Ngấm paraffin

Mẫu được ngâm trong các lọ
paraffin nóng chảy (57-60
0
) với thời
gian thay đổi 1-3h tùy theo kích
thước mẫu mô

Đối với những mẫu mô ngấm chậm
phải kéo dài thời gian nâm trong
paraffin có thể từ 6-12h


Thông thường trong các qui trình
mẫu thường được chuyển qua nhiều
dung dịch paraffin.

Mục đích: dung môi của paraffin
trong miếng mô được đẩy ra hết
ĐÚC KHỐI

Mục đích: Để cố định mẫu

Đối với mẫu cắt lạnh thì khối được
đúc bằng gelatin hay agar thay vì
bằng paraffin.

Trở ngại chính trong quá trình đúc
khối paraffin là làm miếng mô co
lại, nguyên nhân là do nhiệt độ
nóng chảy của paraffin (Bennett et
al., 1976).