Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn Acetobacter xylinum BHN2 potx

BÁO CÁO TỐT NGHIỆP
Đề tài
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới
khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2
MỤC LỤC
BÁO CÁO TỐT NGHIỆP 1
Đề tài 1
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn
Acetobacter xylinum BHN2 1
MỤC LỤC 2
KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHẦN MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Màng sinh học ( Bacterial cellulose; Biocellulose; BC) có cấu trúc và đặc
tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết với
nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose thực
vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như: ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến…do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai,
bề chắc.[17]
Trên thế giới màng Bacterial cellulose đã được ứng dụng rất nhiều trong các
lĩnh vực công nghệ khác nhau: như dùng làm màng phân tách cho quá trình
xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào,dùng làm
chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm. Đặc biệt trong lĩnh
vực y học, màng BC đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá
trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim
mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người.[13]
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng BC còn ở mức độ khiêm
tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu. Các kết

quả ứng dụng của màng BC hầu như mới chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm.
Trong những năm gần đây phòng thí nghiệm Thực vật - Vi sinh Trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2 phân lập tuyển chọn được chủng A. xylinum BHN
2
có
khả năng tạo màng BC và những nghiên cứu bước đầu cho thấy màng BC từ
chủng A. xylinum BHN
2
có khả năng ứng dụng cho trị bỏng cho thỏ là cơ sở
để tạo ra màng trị bỏng cho người.
Với mục đích tìm hiểu diện tích và thể tích liên quan đến độ thoáng khí trong
quá trình tạo màng BC trong điều kiện nuôi tĩnh chúng tôi chọn đề tài:
“ Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn Acetobacter xylinum BHN
2
”
2. Mục tiêu và ý nghĩa khoa học của đề tài
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng BC từ vi khuẩn
A. xylinum BHN
2
phân lập từ nguồn nguyên liệu từ phòng thí nghiệm.
- Khảo sát khả năng tạo màng BC của vi khuẩn A. xylinum BHN
2
.
- Bổ sung thêm các kiến thức về vi khuẩn A.xylinum nhằm ứng dụng tạo
màng BC được tốt nhất.
3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn
A. xylinum BHN
2

.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN
2
.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC của chủng A. xylinum BHN
2
.
- Nghiên cứu một số tính chất vật lý của màng BC được tạo ra từ chủng
A. xylinum BHN
2
từ đó định hướng cho ứng dụng trong trị bỏng.
PHẦN NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về vi khuẩn A. Xylinum và màng BC
1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái của A. Xylinum
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì A.xylinum thuộc
giống Acetobacter, họ Pseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp
Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn nhiều tranh cãi, có một số
tác giả coi A. xylinum như một loài phụ của A. Aceti.[21]
A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay
không di động, không sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn Gram âm, nhưng đặc
điểm nhuộm Gram có thể thay đổi do tế bào già đi hay do điều kiện môi
trường. Chúng có thể đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi.

Hình 1: Kết quả nhuộm Gram của A. xylinum BHN
2
Khuẩn lạc của A.xylinum có kích thước lớn (đường kính khuẩn lạc đạt
2-5mm), tròn, bề mặt nhầy và trơn bóng, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn

và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn.[18]
1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của A. Xylinum
Vi khuẩn A. xylinum phát triển ở nhiệt độ 25-35
0
C, pH = 4-6. Nhiệt độ
và pH tối ưu tùy thuộc vào giống. Ở 37
0
C, tế bào sẽ suy thoái hoàn toàn ngay
cả trong môi trường tối ưu.
A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế thường bổ sung thêm
acid acetic vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ.[12]
Các đặc điểm sinh hoá dùng định danh của A. xylinum bao gồm: Oxy
hoá ethanol thành acid acetic, CO
2
, H
2
O; Phản ứng catalase dương tính;
Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer; Chuyển hoá glucose thành acid;
Chuyển hoá glycerol thành dihydroxyaceton; Không sinh sắc tố nâu; Tổng
hợp cellulose.[12]
1.1.3. Màng BC của vi khuẩn A. xylinum
Trên môi trường dịch thể, trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn A. xylinum
hình thành nên một lớp màng có bản chất là cellulose, được tập hợp bởi những
bó sợi cellulose liên kết với nhau được gọi là màng Bacterial cellulose hay
màng BC.
* Cấu trúc của màng Bacterial cellulose:
Cellulose được cấu tạo bởi chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mạch
thẳng. Có thành phần hoá học đồng nhất với cellulose thực vật, nhưng cấu
trúc và đặc tính lại khác xa nhau.
Chuỗi polyme β -1,4 glucopynanose mới hình thành liên kết với nhau tạo

thành sợi nhỏ (subfibril) có kích thước 1,5nm. Những sợi nhỏ kết tinh tạo sợi
lớn hơn- sợi vĩ mô ( microfibril) ( Tonas and Farah, 1998), những sợi này kết
hợp với nhau tạo thành bó và cuối cùng tạo dải ribbon (Yamanaka et.al
2000). Dải ribbon có chiều dài trong khoảng từ 1-9nm. Những dải ribbon
được kéo ra từ tế bào này sẽ liên kết với những dải ribbon của tế bào khác
bằng liên kết hiđro hoặc lực vandesvan tạo thành cấu trúc mạng lưới hay một
lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường nuôi cấy.[15]
Do dải ribbon của màng BC có đường kính nhỏ hơn của PC, chỉ số kết
tinh cao (khoảng 60%), độ polyme hoá lớn nên màng BC có độ bền cơ học
cao, khả năng hấp thụ nước lớn.
Bacterial cellulose sản xuất bởi vi khuẩn A. xylinum được nghiên cứu đầu
tiên bởi Brown năm 1886. Nó đã thu hút sự chú ý từ nửa sau của thế kỷ XX,
những nghiên cứu tập trung sâu vào cơ chế tổng hợp, cũng như cấu trúc và
đặc tính của cellulose.[22]
1.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC
từ vi khuẩn A.xylinum
1.2.1.Ảnh hưởng hàm lượng glucose
Nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng
hợp cellulose của Acetobacter xylinum. Theo kết quả nghiên cứu của Thạc sỹ
Nguyễn Thị Nguyệt trên chủng Acetobacter xylinum HN5 thì nguồn cacbon
có ảnh hưởng lớn nhất đến sự hình thành màng của Acetobacter xylinum là
glucose. Để tạo màng phục vụ mục đích nghiên cứu, Thạc sỹ Trần Như
Quỳnh đã quyết định sử dụng hàm lượng glucose 20 g/l cho các nghiên cứu
trên chủng A. xylinum BHN
2
.[14]
1.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH
4
)
2

SO
4
Vi sinh vật và tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ trong quá trình sống để
xây dựng tế bào. Nhân tố (NH
4
)
2
SO
4
là một trong những nhân tố có ảnh
hưởng lớn đến sự phát triển của Acetobacter xylinum, là nhân tố quan trọng
cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển. Vì vậy, nếu nguồn nitơ trong môi
trường quá ít sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của tế bào, từ đó ảnh hưởng
đến quá trình tạo màng BC. Ở nồng độ 2,0 g/l môi trường cho hiệu suất màng
BC cao nhất.[14]
1.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng MgSO
4
.7H
2
O
MgSO
4
ở nồng độ 2 g/l cho sản lượng BC cao nhất, theo PGS-TS Đinh Thị
Kim Nhung, magie là nhân tố tham gia vào việc tạo thành các enzim, những
enzim này xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa các chất trong quá trình hình
thành màng BC.[14]
1.2.4. Ảnh hưởng của hàm lượng KH
2
PO
4

Phospho ngoài vai trò tham gia cấu trúc các thành phần của tế bào, nó còn có
vai trò hết sức quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter
xylinum ( Ross et.al, 1991). Sử dụng nồng độ 2g/l KH
2
PO
4
sẽ cho sản lượng
BC cao nhất.[14]
1.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn A.xylinum
1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian lên men và hàm lượng giống.
Lượng giống và thời gian nuôi cấy là 2 yếu tố quan trọng ảnh hưởng
trong quá trình lên men cellulose vi khuẩn.
Độ dai của màng phụ thuộc rất nhiều vào sự kết tinh của màng BC, độ
kết tinh của màng lại chịu ảnh hưởng lớn về thời gian lên men thu nhận màng.
Vì nếu thu sớm độ polymer hoá và kết tinh chưa cao sẽ ảnh hưởng đến tính
chất cơ học của màng BC. Ngược lại nếu để lâu trong môi trường nghèo dinh
dưỡng màng chìm xuống, vi khuẩn sẽ tiến hành phân huỷ thu năng lượng
cung cấp cho hoạt động sống của tế bào.
Đối với loài Actobacte xylinum, trong quá trình lên men, phần lơn các
tế bào liên kết với phân tử glucose để hình thành lớp màng BC trên bề mặt
nuôi cấy. Lớp màng này ngăn cản sự tiếp xúc của oxy với môi trường dich
thể. Vì vậy việc nghiên cứu xác định được lượng giống bổ sung ban đầu cho
phù hợp có ý nghĩa quan trọng để thu được màng BC với năng suất cao nhất.
Sản lượng cellulose thu được trong quá trình lên men đều tăng theo tỷ lệ
giống và thời gian lên men.[14]
1.3.2. Độ thông khí
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện tiên
quyết khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá
trình lên men, lượng oxy cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ

thông khí quyết định năng suất BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxy và
sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao
trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng,
thoáng và lớp môi trường mỏng.[19]
Wanatabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy cũng ảnh
hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành dưới
áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất
oxy cao. Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp
màng BC.[20]
1.3.3. Nhiệt độ
Nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A. xylinum từ 25-30
0
C. Ở nhiệt độ thấp
quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế hoạt động và đến
mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và hiệu suất lên men sẽ giảm.
[21]
1.3.4. Độ PH
Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp.
Do đó trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá
môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn
sự phát triển của vi sinh vật có hại.[21]
1.4. Ứng dụng của màng BC
1.4.1. Ứng dụng của BC trong một số lĩnh vực
Màng BC có nhiều lợi điểm vượt trội như: độ tinh sạch, độ kết tinh, độ
bền sức căng, độ đàn hồi, độ co giãn, khả năng giữ hình dạng ban đầu, khả
năng giữ nước và hút nước cao, bề mặt tiếp xúc lớn hơn bột gỗ thường, bề
dày của vi sợi dưới 100nm, bị phân huỷ sinh học, có tính tương thích sinh
học, tính trơ chuyển hoá, không độc và không gây dị ứng. Màng BC có các
ứng dụng đa dạng trong nhiều lãnh vực như y học, thực phẩm, mỹ phẩm, bảo
vệ môi trường, công nghiệp.[22]

1.4.2. Ứng dụng của màng BC trong điều trị bỏng
Bỏng là một tai nạn thường gặp trong lao động và sinh hoạt hằng ngày.
Ngoài tổn thương da, trường hợp bỏng nặng còn gây rối loạn nội tạng, để lại
di chứng nặng đến khả năng vận động, thẩm mỹ và sức khỏe của người bệnh.
Ở Việt Nam, chỉ riêng Viện Bỏng Quốc gia (Hà Nội) mỗi năm tiếp nhận
khoảng hơn 400 ca bỏng. Các tác nhân gây bỏng chủ yếu là bỏng nước sôi.
Ngoài ra các tác nhân khác là xăng, dầu, nước canh nóng, acid, vôi tôi nóng.
[6]
Việc điều trị tại chỗ vết thương bỏng là một công tác có ý nghĩa đặc
biệt quan
trọng. Đối với vết bỏng nông điều trị tại chỗ vết bỏng có tác dụng
làm giảm đau
ngăn chặn các biến chứng nhiễm khuẩn, tạo điều kiện tốt cho
quá trình tái tạo
phục hồi. Đối với những trường hợp bỏng sâu, điều trị tại
chỗ có tác dụng lớn
trong việc điều trị dự phòng các biến chứng của nhiễm
khuẩn tại chỗ, không để nhiễm khuẩn toàn thân, ngăn ngừa sự mất nước và
dịch trong cơ thể (là nguy cơ
dẫn đến tử vong cao), loại bỏ nhanh các tổ chức
hoại tử, tạo điều kiện tốt cho quá trình hình thành mô hạt và biểu mô hóa hình
thành sẹo, chuẩn bị tốt nền ghép da trong phẫu thuật.[6]
1.5. Tình hình nghiên cứu về màng BC ở Việt Nam và trên thế giới
1.5.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng BC từ vi khuẩn A.xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1989, dùng
màng BC làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất
mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989), Jonas và
Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các
sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc

thay thế thực phẩm. Đặc biệt Brown (1989) đã dùng BC làm vải đặc biệt,
Nogiet và cs (2005), Jonas và Farad, 1998, Soloknicki và cộng sự (2006)
dùng màng BC để sản xuất giấy chất lượng cao, làm cơ chất để cố định
protêin hay cho sắc kí.[5]
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng BC là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997),
Cienchanska (2004), Legeza và cs (2004) Wan và Millon (2005), Czaja và cs,
(2006) sử dụng màng BC đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được kết
quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã đượng đăng kí bản quyền về làm
màng BC từ A.xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả Jonas và Farad (1998),
Czaja và cs (2006) đã dùng màng BC làm da nhân tạo, làm mặt nạ dưỡng da
cho phụ nữ.[5]
1.5.2. Ở Việt Nam
Tại Việt Nam tình hình điều trị bỏng trong nước ngày càng được cải tiến.
Công tác điều trị bỏng bao gồm việc cấy ghép, phẫu thuật, tạo ra một số màng
trị
bỏng như màng ối, trung bì da lợn, da ếch, màng chitosan, sử dụng các
chất có
nguồn gốc từ tự nhiên có tác dụng điều trị bỏng …
Từ năm 2000
nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Thanh và cộng sự đã có một số
công trình nghiên cứu về màng BC từ A. xylinum và bước đầu nghiên cứu về
các đặc tính màng BC thu được là cơ sở để chế tạo màng sinh học dùng trong
trị bỏng ở Việt Nam.[9]
Điều trị bỏng bằng các thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên đã được áp dụng
từ rất
lâu và phổ biến ở tất cả các nước. Các thuốc này có sẵn trong thiên
nhiên và có
nhiều đặc tính tốt cho điều trị bỏng cũng như chữa các vết
thương, vết loét…

Màng BC có nhiều ưu điểm để trở thành chất mang các hợp chất có
nguồn gốc từ thiên nhiên sử dụng trong điều trị bỏng.[14]
1.6. Một số công trình nghiên cứu có liên quan đến đề tài
Luận văn thạc sĩ vi sinh học 2009 :
“Nghiên cứu một số đặc tính vật lý của
màng BC từ Acetobacter xylinum, ứng dụng trong trị bỏng” của Trần như
Quỳnh- ĐHSP Hà Nội đã làm được một số vấn đề sau:
- Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn A.xylinum
BHN
2
.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men tạo màng
BC của chủng A.xylinum BHN
2
, qua đó lựa chọn được môi trường thích hợp
cho chủng A.xylinum BHN
2
lên men tĩnh.
+ Điều kiện nuôi cấy: hàm lượng giống bổ sung ban đầu cho lên men tạo
màng là 10% thể tích lên men, với PH ban đầu của môi trường lên men từ
4,5-5,5.
+ Môi trường dinh dưỡng: hàm lượng đường glucose 20g/l; (NH
4
)
2
SO
4
: 2
g/l; KH
2

PO
4
: 2 g/l; MgSO
4
.7H
2
O: 2 g/l.
- Nghiên cứu được tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên men cho chủng
A.xylinum BHN
2
tạo màng tốt nhất.
- Xử lý màng BC ứng dụng trong điều trị bỏng và khảo sát các đặc tính của
màng: khả năng kháng khuẩn cao, độ bền cơ học 3,62 kN/m, độ thấu khí
120ml/phút, khả năng hút nước 6,82g/100cm
2
/24 giờ; màng không có triệu
chứng kích ứng.
- Màng BC tẩm dầu mù u và kem nghệ làm lành vết thương sau 19 ngày điều
trị.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu chính
Đối tượng nghiên cứu là các chủng A. xylinum BHN
2
được phòng thí
nghiệm Thực vật - Vi Sinh Khoa sinh - KTNN Trường Đại học Sư pham Hà
Nội 2 cung cấp.
2.1.2. Hoá chất và thiết bị
2.1.2.1. Hoá chất
- Nguồn Cacbon: Rượu etylic, Glucose, Sacrose, Manitol, Lactose, Fructose,

Dihyroxyaceton, Axit acetic.
- Nguồn Nitơ: Cao nấm men, Pepton, (NH
4
)
2
SO
4
- Các muối khoáng: KH
4
PO
4
, CaCO
3
, MgSO
4
.7H
2
O, NaOH, CuSO
4
.
- Các chất kích thích sinh trưởng: Cao nấm men, cao ngô.
- Thuốc thử: Dung dịch Fehling, dung dịch Blue Bromophenol.
- Thuốc nhuộm: Tím gentian, Fucshin, Lugol.
- Ngoài ra còn sử dụng : Các loại bia, nước dừa, các loại nước chiết quả.
2.1.2.2. Thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức).
Nồi hấp Tommy (Nhật).
Máy so màu UV – vis ( Nhật).
Máy đo pH (MP 200R - Thụy Sỹ).
Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh).

Máy li tâm Sorvall (Mỹ).
Micropipet Jinson (Pháp), các loại tử 20l – 10ml.
Kính hiển vi quang học Carl Zeiss (Đức): Axioskop 40.
Cân (Precisa XT 320M - Thụy sỹ).
Hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que trang, đèn cồn…
2.1.3. Môi trường
2.1.3.1. Môi trường phân lập giống (MT1)
Glucose: 20 g (NH
4
)
2
SO
4
: 3 g
KH
2
PO
4
: 2 g MgSO
4
.7H
2
O: 2 g
CaCO
3
: 10g Agar: 20g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.3.2. Môi trường nhân giống cơ bản (MT2)

Glucose: 20 g (NH
4
)
2
SO
4
: 3 g
KH
2
PO
4
: 2 g MgSO
4
.7H
2
O: 2 g
Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước máy: 1000ml.
2.1.3.3. Môi trường nghiên cứu khả năng tạo màng
Glucose: 20 g (NH
4
)
2
SO
4
: 3 g
KH
2

PO
4
: 2 g MgSO
4
.7H
2
O: 2 g
Cao nấm men: 3g Pepton: 4g
Axit acetic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Rượu etylic: 2% (bổ sung sau khi khử trùng).
Nước dừa: 1000ml.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp hoạt hóa giống A.xylinum BHN
2

Giống từ ống nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem sử dụng
phải hoạt hóa giống “làm thức tỉnh giống”, nhân giống đảm bảo đủ số lượng
tế bào vi sinh vật cho quá trình lên men. Phương pháp hoạt hóa giống sử dụng
môi trường tiêu chuẩn không có thạch agar, đem hấp thanh trùng ở 121
0
C
trong 20 phút. Sau đó đem xử lí trong đèn tím 15 phút để khử khuẩn, sau đó
cấy chuyển giống từ ống thạch nghiêng vào và nuôi lắc 135 vòng/phút trong
24 giờ.
2.2.2.Phương pháp lên men tạo màng BC từ vi khuẩn A.xylinum BHN
2

Sử dụng môi trường lên men tạo màng đem hấp thanh trùng ở 110
0
C

trong 20 phút để tránh phân dã đường. Sau đó khử khuẩn ở đèn cực tím trong
15 phút. Sau đó tiến hành lên men tạo màng BC bằng cách bổ sung vào môi
trường lên men 5% giống đã hoạt hóa. Nuôi cấy ở điêu kiện tĩnh trong 7-10
ngày.
2.2.3. Phương pháp bảo quản chủng giống A.xylinum BHN
2
trên môi
trường thạch nghiêng
Các chủng giống sau khi nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh sẽ được cấy
trên môi trường thạch nghiêng (MT1 đã loại bỏ CaCO
3
), nuôi trong tủ ấm 3 –
4 ngày ở 30
0
C. Sau đó, giữ lạnh ở tủ 4
0
C để bảo quản giống. Cấy truyền giữ
giống trên môi trường thạch nghiêng mỗi tháng một lần.[4]
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC từ
chủng A. xylinum BHN
2
2.2.4.1. Phương pháp nghiên cứu tìm tỷ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC
tốt nhất từ chủng A. xylinum BHN
2

S: diện tích bề mặt lên men tạo màng BC (cm
2
)
V: thể tích dịch lên men tạo màng ( cm
3

)
Với phương pháp cố định diện tích bề mặt lên men tạo màng, thay đổi thể tích
dịch lên men để tìm tỷ lệ S/V thích hợp đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ
chủng A.xylinum BHN
2
, chúng tôi tiến hành theo các bước sau:
- Bước 1: Tính diện tích bề mặt lên men tạo màng BC. Quy đổi thể tích từ đơn
vị ml sang đơn vị cm
3
. Sau đó tính tỷ lệ S/V.
+ Dụng cụ lên men tạo màng là khay nhựa hình chữ nhật có kích thước 15 x
10 x 4 cm, từ đó ta tính được diện tích bề mặt lên men tạo màng BC là
S= 15 x 10= 150 (cm
2
).
+ Thể tích dịch lên men được đo bằng ml nhưng để tính được tỷ lệ S/V thì ta
phải quy đổi ml sang cm
3
. Ta đã biết 1ml=1cm
3
. Ta có bảng sau:
Bảng 1: Tính quy đổi S/V thí nghiệm nghiên cứu
S (cm
2
) V ( ml =cm
3
) S/V (cm
-1
)
150 150 1,0

150 167 0,9
150 187.5 0,8
150 215 0,7
150 250 0,6
150 300 0,5
- Bước 2: Tiến hành lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng A.xylinum BHN
2

với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai,
cân nặng, trọng lượng khô để tìm S/V thích hợp tạo màng BC tốt nhất.
2.2.4.2. Phương pháp xác định dai (độ bền cơ học) của màng BC
. Độ chịu kéo(độ dai)(tensile strenght): Lực kéo lớn nhất mà mẫu thử
chịu được trước khi đứt trong điều kiện xác định của phương pháp thử tiêu
chuẩn.[14]
Độ bền kéo(độ dai) có thể được hiểu như là khi một lực tác động tăng
dần đến khi vật liệu dạng sợi hay trụ bị đứt. Ở giá trị lực kéo giới hạn cho sự
đứt của vật liệu được ghi lại được ký hiệu σ
k
. Độ bền kéo được ứng dụng rất
nhiều cho các vật liệu trong các lĩnh vực như thiết kế chế tạo máy, xây dựng,
khoa học vật liệu.[14]
Để xác định độ dai của màng tôi đã dùng một lực kế(đơn vị là N-
Niutơn). Sau khi thu màng tôi tiến hành đo độ dai bằng cách:
+ Cố định đầu trước của màng
+ Tiếp đến lấy lực kế lò xo cố định vào đầu sau
+ Kéo màng xem tối đa màng đó có độ bền kéo đạt được bao nhiêu N.
2.2.4.3. Phương pháp nghiên cứu thời gian đến tỷ lệ S/V thích hợp nhất
đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN
2
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày đến tỷ lệ S/V thích

hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN
2
theo các tiêu
chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng,
trọng lượng khô từ đó tìm thời gian thích hợp tạo màng BC tốt nhất.
2.2.4.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỷ lệ S/V
thích hợp nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN
2
Tiến hành thí nghiệm nghiên cứu nhiệt độ từ 20-40
0
C đến tỷ lệ S/V thích hợp
nhất đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN
2
theo các tiêu chí:
thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng, trọng
lượng khô từ đó tìm nhiệt độ thích hợp tạo màng BC tốt nhất.
2.2.5. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
Xử lý thống kê các kết quả thí nghiệm theo một số phương pháp trong
cuốn “Ứng dụng tin học trong sinh học” và “Thống kê và ứng dụng” như:
* Số trung bình cộng: Dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại
thí nghiệm.
1
1
n
i
i
X X
n
=
=

∑
* Trung bình bình phương các sai lệch
1
)(
1
2
−
−
=
∑
=
n
XX
n
i
i
δ
* Sai số đại diện của trung bình cộng
m
n
δ
± =
* Hệ số biến thiên trung bình cộng:
X
x
C
v
100
δ
=

.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hưởng của các tỷ lệ S/V tới khả năng tạo màng của vi khuẩn A.
xylinum BHN
2
.
Sau một thời gian nghiên cứu lên men bề mặt tạo màng BC từ chủng
A.xylinum BHN
2
với các tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn,
độ dày, độ dai, cân nặng, trọng lượng khô tuyệt đối để tìm S/V thích hợp tạo
màng BC tốt nhất, chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.1. Nghiên cứu tỉ lệ S/V đến khả năng tạo màng BC tốt nhất từ vi
khuẩn A. xylinum BHN
2
(Ảnh hưởng tỷ lệ diện tích bề mặt và thể tích lên
men)
Tỷ
lệ
S/V
(cm
-1
)
Đặc điểm màng
Thời
gian
xuất
hiện
màng
Màu sắc,

độ nhẵn
Độ
dày
sau
khi
lên
men
(mm
)
Độ dai
(độ bền
kéo)
Đơn vị
(N)
Cân
nặng
sau
khi
lên
men
(g)
Trọng
lượng
khô
(g)
0,5 4 Trắng đục,
sần sùi
0,50 6 4,17 0,10
0,6 4 Trắng đục,
sần sùi

1,5 10 8,54 0,14
0,7 4 Trắng đục,
sần sùi
1,9 14 8,61 0,15
0,8 3 Màng trắng
trong, nhẵn.
3,00 18 22,22 0,51
0,9 3 Màng trắng 2,50 16 18,17 0,35
trong, nhẵn.
1,0 3 Màng trắng
trong, nhẵn.
2,00 12 13,36 0,30
Biểu đồ 3.1.1 Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với khối lượng màng
Biểu đồ 3.1.2. Thể hiện mối quan hệ giữa S/V với độ bền kéo màng
Từ bảng 3.1 và biểu đồ 3.1.1 và 3.1.2 tôi thấy khả năng hình thành màng tốt
nhất ở tỷ lệ S/V = 0,8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên men h
=1,25 cm. Với tỷ lệ S/V thấp hơn hoặc lớn hơn 0,8 độ kết tinh của màng
không cao, màng dễ bị rách khả năng chịu lực kéo kém hơn.
3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC tốt nhất
của chủng A. xylinum BHN
2
với tỷ lệ S/V=0,8
Sau một thời gian tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thời gian từ 1-7 ngày với tỷ
lệ S/V=0,8 đến khả năng tạo màng BC từ chủng A. xylinum BHN
2
theo các
tiêu chí: thời gian xuất hiện màng, màu sắc, độ nhẵn, độ dày, độ dai, cân nặng,
trọng lượng khô tuyệt đối từ đó tìm thời gian để độ kết tinh của màng đạt trạng
thái tốt nhất và thu nhận màng tốt nhất, chúng tôi thu được kết quả thể hiện ở
bảng 3.2 như sau:

S/V
Độ bền kéo của màng (N)
Bảng 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo
màng BC tốt nhất từ chủng A. xylinum BHN
2
với tỷ lệ S/V=0,8
Thời gian
(ngày) 1 2 3 4 5 6 7
Xuất hiện
màng
- - + + + + +
Màu sắc,
độ nhẵn
- - Màng
trắng
trong,
nhẵn
Màng
trắng
trong,
nhẵn
Màng
trắng
trong,
nhẵn
Màng
trắng
trong,
nhẵn

Màng
trắng
trong,
nhẵn