Nghiên cứu quần thể vi khuẩn chuyển háo đạm trong bùn đáy ao nuôi tôm sú

i
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
------------♣♣♣-----------


PHẠM THỊ TUYẾT NGÂN



NGHIÊN CỨU QUẦN THỂ VI KHUẨN
CHUYỂN HOÁ ĐẠM TRONG BÙN ĐÁY
AO NUÔI TÔM SÚ (Penaeus monodon)



Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản nước Mặn, Lợ
Mã số: 62 62 70 05

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN

Cần Thơ, 2012

ii
Công trình được hoàn thành tại Bộ môn Thủy Sinh học Ứng
dụng, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.


Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp

PGS. TS. Trương Quốc Phú

Phản biện 1: TS. LƯU HỒNG MẪN
Phản biện 2: TS. LÊ HỒNG PHƯỚC



Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn cấp
Nhà nước, họp tại Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ.
Vào lúc: giờ ngày tháng năm 2012


Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Trung tâm Học liệu Trường Đại học Cần Thơ
- Thư viện Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ

1
KHÁI QUÁT CHUNG VỀ LUẬN ÁN
1. Tính cấp thiết của đề tài
Tôm sú (Penaeus monodon) là đối tượng nuôi tăng nhanh
nhất trong hoạt động nuôi thủy sản trên thế giới. Sự phát triển
nhanh của nghề nuôi tôm biển đã mang lại việc làm cho người
dân và tạo nguồn thu nhập ngoại tệ của nhiều quốc gia. Tuy
nhiên, hệ lụy của tốc độ phát triển nuôi tôm công nghiệp đã
dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh, do vậy
nghề nuôi tôm biển đã gặp những trở ngại lớn. Sản lượng tôm
nuôi của nhiều quốc gia suy giảm, ảnh hưởng lớn đến đời sống
kinh tế của nhiều dân cư. Để giải quyết vấn đề này chất hoá
học và kháng sinh đã được sử dụng trong hoạt động nuôi tôm
(Gomez-Gil et al., 2000; Gräslund và Bengtsson, 2001). Việc

sử dụng thuốc kháng sinh không đúng cách đã dẫn đến sự
kháng thuốc (Weston, 1996). Mặt khác sản phẩm thủy sản
xuất khẩu không đạt tiêu chuẩn do dư lượng thuốc kháng sinh,
thuốc bảo vệ thực vật và vi sinh vật gây bệnh (Đặng Đình Kim
và ctv., 2006).
Chính vì vậy giải pháp trong phòng trị bệnh đã và đang
được đặt ra bao gồm việc quản lý bệnh, địch hại tổng hợp (Li,
2008), đặc biệt là việc sử dụng các vi sinh vật hữu ích
(probiotic) nhằm cải thiện môi trường nuôi và tăng năng suất
vật nuôi. Đây là một giải pháp tích cực, có nhiều triển vọng để
quản lý vi sinh trong ao nuôi thâm canh, hạn chế tối đa thuốc
kháng sinh để bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm, hạn chế
đáng kể lượng chất hữu cơ thải ra môi trường góp phần phát
triển nghề nuôi thủy sản một cách bền vững. Việc nghiên cứu
chọn lựa các dòng vi khuẩn hữu ích có nguồn gốc tại địa
phương làm cơ sở cho việc sản xuất đại trà chế phẩm vi sinh là
rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao trong giai đoạn hiện

2
nay nhằm nâng cao hiệu quả nuôi thủy sản, hạn chế sự ô
nhiễm môi trường thúc đẩy và tăng cường sự bền vững của
nghề nuôi. Từ những nguyên nhân trên mà đề tài "Nghiên cứu
quần thể vi khuẩn chuyển hoá đạm trong bùn đáy ao nuôi
tôm sú (Penaeus monodon)” đã được thực hiện.
2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu thành lập bộ chủng vi khuẩn hữu ích có nguồn
gốc từ các ao nuôi tôm sú thâm canh nhằm bổ sung bộ sưu tập
vi khuẩn làm cơ sở khoa học trong việc chọn lựa các dòng vi
khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm vi sinh.
3. Nội dung của luận án

- Sưu tập và định danh các nhóm vi khuẩn phân hủy hữu
cơ, chuyển hoá đạm phân lập từ ao nuôi tôm sú thâm canh qua
một chu kỳ nuôi.
- Xác định biến động các yếu tố môi trường và yếu tố vi
sinh vật qua một chu kỳ nuôi.
- Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng nước của nhóm vi
phân lập và vai trò của chúng trong ương nuôi tôm trong bể ở
qui mô phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Luận án đã bổ sung bộ sưu tập những dòng vi khuẩn hữu
ích có hiệu quả xử lý nước tốt trong nuôi tôm và những kết
luận khoa học về ảnh hưởng của các dòng vi khuẩn này lên sự
thay đổi các chỉ tiêu chất lượng nước và tăng trưởng của tôm
sú vào nguồn cơ sở dữ liệu khoa học chung về ứng dụng vi
khuẩn hữu ích, làm cơ sở để phục vụ cho nghề nuôi tôm sú
phát triển bền vững.
5. Những điểm mới của luận án

3
- Luận án đã chọn lọc, định danh và đánh giá được hiệu quả
cải thiện chất lượng nước của một số loài vi khuẩn hữu ích từ
ao nuôi tôm sú thâm canh.
- Luận án đã đi sâu tìm hiểu động thái của quần thể vi
khuẩn trong ao, cũng như các biến động chất lượng môi
trường trong ao nuôi thâm canh thông qua một chu kỳ nuôi.
- Luận án đã xác định loài vi khuẩn B. cereus là loài có
nguồn gốc trong ao và không phải là loài có trong chế phẩm vi
sinh (B. subtilis và B. licheniformis).
- 6 loài vi khuẩn là B. subtilis (B41), B. cereus (B8, B9,
B37, B38) và B. amyloliquefaciens (B67) có thể được sử dụng

sản xuất chế phẩm vi sinh.
6. Bố cục của luận án
Chương 1: Giới thiệu 6 trang
Chương II: Lược khảo tài liệu 40 trang
Chương III: Phương pháp nghiên cứu 30 trang
Chương IV: Kết quả và Thảo luận 79 trang
Chương V: Kết luận và kiến nghị 2 trang
Danh mục các công trình của tác giả 1 trang
Tài liệu tham khảo 21 trang
(gồm 298 tài liệu, trong đó 34 tài liệu tiếng việt và 264 tài
liệu tiếng nước ngoài)
Phụ lục 33 trang







4
Chương 1:
TỔNG QUAN
Chương này tập trung vào tìm hiểu và phân tích các nội dung
quan trọng như:
1. Khái quát về tôm sú, hiện trạng môi trường và dịch
bệnh trong nuôi tôm sú.
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sống của tôm.
3. Hiện trạng ô nhiễm môi trường và dịch bệnh trong
nuôi tôm thâm canh.
4. Các chất độc sinh ra từ quá trình phân hủy chất thải

trong ao nuôi thâm canh (NH
3,
H
2
S và NO
2
-
).
5. X
ử lý ô nhiễm môi trường bằng phương pháp sinh

học.

6. Vai trò của vi khuẩn phân hủy hữu cơ.
7. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus.
8. Các quá trình chuyển hoá nitơ vô cơ và vai trò các
nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Nitrosomonas và
Nitrobacter).
9. Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản
10. Kỹ thuật giải trình tự nucleotid trong ADN.
11. Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh vi khuẩn trong
NTTS.
Từ tổng quan tài liệu cho thấy chưa có công trình nào
nghiên cứu hoàn chỉnh về quần thể vi khuẩn phân hủy hữu cơ
và chuyển hóa đạm trong ao nuôi tôm sú thâm canh, đặc biệt
là xác định được các vi khuẩn hữu ích chiếm ưu thế trong ao
nuôi tôm thâm canh có nguồn gốc từ tự nhiên. Tất cả các
nghiên cứu trên là cơ sở để hướng tới việc quản lý chất lượng
nước bằng biện pháp sinh học, làm cơ sở để phục vụ cho nghề
nuôi tôm sú phát triển bền vững.

5
Chương 2:
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian thu mẫu từ tháng 3/2008 đến tháng 8/2008 tại ấp
Tân Tĩnh, xã Vĩnh Hiệp, huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng.
Thời gian phân tích mẫu từ tháng 3/2008 đến tháng 10/2008
tại Bộ môn Thủy sinh học ứng dụng, Khoa Thủy sản, Trường
Đại học Cần Thơ. Thời gian định danh vi khuẩn từ tháng
8/2009 - 8/2011 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ
sinh học, trường Đại học Cần Thơ và Công ty Nam khoa, TP.
Hồ Chí Minh.
2.2 Đối tượng nghiên cứu:
Tôm sú (Penaeus monodon) giai đoạn ấu trùng và tôm
thương phẩm, vi khuẩn Bacillus sp., Nitrosomonas sp. và
Nitrobacter sp.
2.3 Chu kỳ thu mẫu
Chu kỳ thu mẫu được thực hiện trước và sau khi thả tôm
một ngày. Sau đó giữ chu kỳ thu mẫu 2 tuần/lần cho đến khi
kết thúc vụ nuôi (5,5 tháng).
2.4 Đặc điểm ao nuôi, chế độ chăm sóc tôm và bón vi sinh
trong ao thu mẫu
2.5 Các bước chuẩn bị trước khi thu mẫu
2.6 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.6.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
2.6.2. Môi trường và hóa chất
2.7 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn trong ao

2.7.1 Phương pháp thu mẫu nền đáy (Somsiri et al., 2006)
Mẫu bùn được thu bằng hệ thống ống PVC đã được tiệt
trùng bằng dung dịch cồn 70%. Mẫu được giữ lạnh bằng nước

6
đá và chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 3 - 5 giờ, sau đó
được bảo quản ở 4 °C và xử lý trong vòng 2 giờ.
2.7.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
2.7.2.1 Phương pháp phân lập và định danh Bacillus sp.
a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus:
Môi trường phân lập Bacillus dựa theo Harwood và
Archibald (1990). Cách tiến hành phân lập dựa theo Nguyễn
Lân Dũng (1983). Phương pháp cấy chuyền và lưu trữ vi
khuẩn (thực hiện theo phương pháp của Đặng Thị Hoàng
Oanh và ctv. (2004)).
b) Phương pháp định danh Bacillus sp.
Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh lý, sinh hóa
Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa để định danh các chủng vi
khuẩn phân lập được dựa theo Andretta et al., (2004).
Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh học phân tử
(1) Đối với các chủng vi khuẩn B8, B37, B41 và B67, mẫu
vi khuẩn sinh dưỡng đã phát triển trên môi trường thạch
nghiêng được gửi đến Công ty Nam Khoa - để thực hiện phản
ứng PCR và định danh với cặp mồi chung: 16F (5
’
-
TCCAGAGTTTCATCCTGGCTGAC-3
’
) và 16R (5
’

-
TACCGCGCCTGCTCGCTG-3
’
).
(2) Đối với hai chủng vi khuẩn B9 và B38 thực hiện quy
trình trích ADN, phản ứng PCR để khuếch đại đoạn gen của
bán đơn vị nhỏ 16S rRNA của vi khuẩn bằng cặp mồi 16F8
(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và 16R1391 (5’-
GACGGGCGGTGWGTRCA-3’) (Eden et al. 1991, Lane,
1991, trích dẫn bởi Kaspari, 2010). Các thí nghiệm này được
thực hiện tại viện NC & PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần
Thơ theo các bước sau:
- Trích ADN (dựa theo phương pháp của Boon et al., (2002))
- Kiểm tra chất lượng ADN sau khi trích (Trần Nhân Dũng,
2011).

7
- Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng phản ứng PCR
- Kiểm tra sản phẩm PCR
- Giải trình tự đoạn gen đã khuếch đại
- Phân tích số liệu
2.7.2.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
Nitrosomonas sp.
a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Nitrosomonas sp
Môi trường ammonium-calcium-carbonate được sử dụng
để phân lập vi khuẩn Nitrosomonas sp. dựa theo phương pháp
của Ehrlich, 1975. Nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas sp.
được thực hiện theo Lewis và Pramer (1958) và MacDonad và
Spokes (1980).
b) Phương pháp định danh vi khuẩn Nitrosomonas sp.

Định danh bằng phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh
hóa gồm 2 phép thử:
- Kiểm tra khả năng khử NH
3
thành NO
2
-
của nhóm vi khuẩn
AOB: thuốc thử Griess - Ilosvay được sử dụng để kiểm tra khả
năng chuyển hóa từ NH
3
thành NO
2
-
của nhóm vi khuẩn oxi
hóa ammonium (AOB) sau khi đã nuôi tăng sinh.
- Kiểm tra hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp
nhuộm Gram.
Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
- Phương pháp trích và kiểm tra chất lượng ADN được tiến
hành theo các bước như đối với vi khuẩn Bacillus sp. (mục
2.7.2.1).
- Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng phản ứng PCR: phản
ứng PCR được thực hiện để khuếch đại vùng gen mục tiêu của
gen 16S rRNA amoA với cặp mồi AmoA 1F: 5’-GGG GTT
TCT ACT GGT GGT-3’ và 2R: 5-CCC CTC KGS AAA GCC
TTC-3’ (Rotthauwe et al., 1997).

8
- Giải trình tự DNA định danh loài: sản phẩm PCR của các

chủng vi khuẩn được gửi đến Phòng xét nghiệm Nam Khoa -
BIOTEK để thực hiện định danh.
2.7.2.3 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
Nitrobacter sp.
a) Phương pháp phân lập vi khuẩn Nitrobacter sp.
Môi trường nitrite-calcium-carbonate sử dụng cho phân lập
vi khuẩn Nitrobacter sp. dựa trên phương pháp của Ehrlich,
1975. Môi trường Aleem và Alexander, 1960 được sử dụng để
nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrobacter.
b) Phương pháp định danh vi khuẩn Nitrobacter sp.
Định danh bằng phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh
hóa gồm 2 phép thử
- Kiểm tra khả năng khử NO
2
-
thành NO
3
-
của nhóm vi
khuẩn oxy hóa nitrite (NOB): thuốc thử Griess - Ilosvay được
sử dụng để kiểm tra khả năng chuyển hóa từ NO
2
-
thành NO
3
-

của nhóm vi khuẩn NOB sau khi đã nuôi tăng sinh.
- Kiểm tra hình dạng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp
nhuộm Gram.

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
- Phương pháp trích và kiểm tra chất lượng ADN được tiến
hành theo các bước như đối với vi khuẩn Bacillus sp. (mục
2.7.2.1).
- Khuếch đại vùng gen mục tiêu bằng phản ứng PCR: thực
hiện phản ứng PCR với primer PNGT 1F: 5’- TTT TTT GAG
ATT TGC TAG - 3’. PNTG 2R: 5’- CTA AAA CTC AAA
GGA ATT TGA - 3’ là mồi chuyên biệt để nhận diện nhóm
Nitrobacter (Degrange và Bardin, 1995) để khuếch đại vùng
gen mục tiêu của gen 16S rRNA của nhóm vi khuẩn
Nitrobacter sp.
- Giải trình tự ADN định danh loài: được thực hiện tại
Viện NC & PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ.

9
2.8 Phương pháp xác định biến động chất lượng nước và vi
khuẩn trong ao nuôi tôm sú
2.8.1 Phương pháp thu mẫu và xác định chất lượng nước
và bùn đáy ao
2.8.1.1 Phương pháp thu mẫu
Nhiệt độ, pH, độ mặn được đo tại hiện trường. Các chỉ tiêu
TAN, TSS, NO
2
-
, NO
3
-
, TN, H
2
S được thu và bảo quản lạnh (4

°C). DO được cố định tại chỗ bằng hóa chất.
2.8.1.2 Phương pháp phân tích chất lượng nước
Tất cả các chỉ tiêu môi trường được phân tích theo phương
pháp chuẩn (APHA, et al., 1995). Các hóa chất được sử dụng
trong phân tích có xuất xứ từ Đức (Merck).
2.8.1.3 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn
a) Xác định mật độ Mật độ vi khuẩn tổng số và Vibrio
bằng phương pháp đếm khuẩn lạc (Baumann et al., 1980).
Môi trường Tripticase Soya Agar (TSA) thêm 1,5% NaCl
và môi trường Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar (TCBS)
được sử dụng để xác định mật độ vi khuẩn tổng và Vibrio.
Mật số vi khuẩn được tính bằng công thức: Đơn vị hình
thành khuẩn lạc (CFU/g bùn) = số khuẩn lạc trung bình × độ
pha loãng × 10.
b) Xác định mật độ Bacillus sp. dựa theo phương pháp của
Nguyễn Lân Dũng, 1983; Harwood và Archibald, 1990. Sử
dụng môi trường thạch chuyên biệt cho xác định mật độ vi
khuẩn Bacillus. Mật độ vi khuẩn được tính như công thức đã
trình bày ở trên.
c) Xác định mật độ Nitrosomonas và Nitrobacter (Ehrlich,
1975).
Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê
sự phân bố vi khuẩn trong các độ pha loãng khác nhau của
mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định
tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha

10
loãng khác nhau. Sau đó dựa vào bảng thống kê Mac Crady để
suy ra giá trị ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu.
Đơn vị tính mật độ của 2 nhóm Nitrosomonas và

Nitrobacter là MPN/g.
2.9 Các thí nghiệm đánh giá hiệu quả xử lý nước của vi
khuẩn chọn lọc
2.9.1 Thanh lọc vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn thuộc ba nhóm Bacillus sp.,
Nitrosomonas sp., Nitrobacter sp. được thanh lọc để chọn ra
chủng có khả năng phân hủy hữu cơ, TAN, NO
2
-
tốt nhất.
2.9.2 Điều kiện bố trí thí nghiệm được kiểm soát là như nhau
ở tất cả các nghiệm thức
2.9.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn B37, S8 và N10 lên ấu trùng
tôm sú trong hệ thống ương tuần hoàn
2.9.3.1 Vật liệu thí nghiệm
Loài vi khuẩn được chọn bổ sung vào hệ thống thí nghiệm
bao gồm B37 (B. cereus), S8 (N. nitrosa) và N10 (N.
winogradskyi).
2.9.3.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức với mật độ vi khuẩn
Bacillus lần lượt là 10
6
(NT1), 10
5
(NT2), 10
4
CFU/mL (NT3)
và nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn (ĐC).
Trong hệ thống lọc tuần hoàn còn bổ sung thêm vi khuẩn
Nitrosomonas và Nitrobacter (mật độ 10

4
MPN/mL trên mỗi
loài). Các bể ương được nối với bể lọc tuần hoàn ở giai đoạn
Mysis 1, hệ thống lọc được vận hành cho đến khi kết thúc thí
nghiệm. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
Ấu trùng tôm ở giai đoạn Nauplius bố trí với mật độ 150 ấu
trùng/L. Mẫu được thu 3 ngày/lần với các chỉ tiêu bao gồm:
pH, nhiệt độ, TAN, NO
3
-
, NO
2
-
, COD, DO, TSS, TN, H
2
S và

11
mật độ vi khuẩn. Thí nghiệm được kết thúc khi ấu trùng
chuyển sang giai đoạn PL7.
2.9.3.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn
a) Nuôi tăng sinh vi khuẩn Bacillus
Môi trường nuôi tăng sinh là môi trường Luria Bertani (LB,
Hình 3.7). Mật độ vi khuẩn đậm đặc được xác định bằng
phương pháp đo OD tại bước sóng 600 nm (Leonel et al.
2006).
b) Nuôi tăng sinh vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter
Hai dòng vi khuẩn S8 và N10 được nuôi tăng sinh trong
môi trường lỏng cho giống Nitrosomonas theo Lewis và
Pramer (1958) và MacDonad và Spokes (1980) và cho giống

Nitrobacter theo Aleem và Alexander (1960).
2.9.2.4 Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu môi trường như pH, DO, COD, TSS, TAN,
NO
2
-
, NO
3
-
và TN, và các chỉ tiêu vi khuẩn như mật độ vi
khuẩn tổng số , Vibrio, Bacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter đã
được theo dõi (3 ngày/lần) cho đến kết thúc thí nghiệm. Chỉ
tiêu tỉ lệ sống của tôm được xác đinh ở giai đoạn Zoae3,
Mysic2, Postlarvae 1 và Poslarvae 7.
2.9.3.5 Phương pháp thu và phân tích mẫu chất lượng
nước (APHA et al. (1995)).






Hình 3.7 Nuôi tăng sinh vi khuẩn và hệ thống thí nghiệm

12
2.9.3.6 Phương pháp thu và phân tích mẫu vi khuẩn (xem
2.8.1.3)
2.9.3.7 Phương pháp phân tích mẫu tôm
Tỉ lệ sống (%) = Số ấu trùng * 100/Số lượng ấu trùng bố trí
2.9.4 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus B9, B41, B67 lên

chất lượng nước bể nuôi tôm sú
2.9.4.1 Vật liệu thí nghiệm
Ba loài vi khuẩn B9 (B. cereus), B41 (B.
amyloliquefaciens) và B67 (B. subtilis) đã được bố trí vào bể
nuôi tôm sú. Tôm giống thí nghiệm có nguồn gốc từ trại giống
Cần Thơ. Nguồn bùn được lấy từ ao nuôi tôm sú tại huyện
Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng.
2.9.4.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được tiến hành với 4 nghiệm thức: Nghiệm
thức 1 (ĐC): không cấy vi khuẩn. Nghiệm thức 2 (B41): cấy vi
khuẩn B. amyloliquefaciens). Nghiệm thức 3 (B67): cấy vi
khuẩn B. subtilis. Nghiệm thức 4 (B9): cấy vi khuẩn B. cereus.
10
5
- 10
6
CFU/mL / nghiệm thức. Mỗi bể được bố trí một lớp
bùn từ 4 - 5 cm ở đáy bể. Mật độ thả tôm 30 con/m
2
. Mỗi
nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Trong suốt quá trình thí
nghiệm, mẫu vi khuẩn được thu trước khi bổ sung vi khuẩn và
tiếp theo định kỳ 2 tuần thu mẫu một lần cho đến khi kết thúc
thí nghiệm.
2.9.4.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn (xem 2.9.3.3)
2.9.4.4 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn (xem
2.9.3.6)
2.9.4.5 Phương pháp thu và phân tích chất lượng nước
(APHA et al. (1995)).
2.9.4.6 Cách cho ăn và quản lý tôm nuôi thí nghiệm

Tôm được cho ăn thức ăn công nghiệp Grow Feed 5
lần/ngày (06, 10, 14, 18, 22 giờ). Khối lượng tôm được xác
định lúc bắt đầu thí nghiệm và kết thúc.

13
2.9.4.7 Phương pháp phân tích mẫu tôm
Phương pháp xác định tốc độ tăng trưởng và tỉ lệ sống của
tôm dựa theo các tác giả Robertson et al. (2000), Felix và
Sudharsan (2004); Venkat et al. (2004).
2.9.5 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bacillus B8, B37, B38 lên
chất lượng nước bể nuôi tôm sú
2.9.5.1 Vật liệu thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí trong 12 bể composite thể tích 500
L. Ba loài vi khuẩn B. cereus (B37), B. cereus. (B38), và B.
cereus (B8) được chọn thí nghiệm. Tôm giống có khối lượng
trung bình là 1 g/con. Nước biển 100‰ có nguồn gốc từ Vĩnh
Châu (Sóc Trăng), được pha với nước máy để đạt độ mặn
16‰.
2.9.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức: (1) bổ sung B. cereus
(B37); (2) bổ sung B. cereus (B38); (3) bổ sung B. cereus (B8)
và (4) đối chứng (ĐC) không bổ sung vi khuẩn. Mật độ vi
khuẩn được bổ sung là 10
5
-10
6
CFU/mL. Mật độ thả tôm là 30
con/m
2
. Vi khuẩn được bổ sung 5 ngày/lần. Tôm được cho ăn

5 lần/ngày. Mẫu được thu trước khi bổ sung vi khuẩn và định
kỳ 5 ngày một lần cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
2.9.5.3 Phương pháp nuôi tăng sinh vi khuẩn (xem 2.9.3.3)
2.9.5.4. Các chỉ tiêu theo dõi (xem 2.9.4.4 và 2.9.4.5)
2.9.6 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý với chương trình Excel và phần mềm
Statistica 6.0. Tất cả các số liệu đều được kiểm tra tính đồng
nhất và phân phối chuẩn trước khi đưa vào xử lý One-way
ANOVA. Sự khác biệt giữa các nghiệm thức được kiểm tra
bằng phép thử Duncan ở mức ý nghĩa 0,05.

14
Chương 3:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn chuyển hóa đạm từ
bùn đáy ao nuôi tôm
3.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus
3.1.1.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus
Đã thu thập được 67 chủng (B1 - B67). Tất cả các chủng
này được lưu trữ trong thạch nghiêng ở 4
°
C và trong glycerol ở
nhiệt độ -80
°
C tại khoa Thủy sản.
3.1.1.2 Định danh vi khuẩn Bacillus
a) Định danh bằng phép thử sinh lý, sinh hóa
Hình dạng khuẩn lạc: dạng hình tròn, hơi rìa, khuẩn lạc
phẳng, bề mặt nhẵn hoặc hơi nhăn, màu trắng đục đến hơi
vàng. Tế bào vi khuẩn Bacillus Gram dương, có dạng hình que

ngắn, hoặc que dài tùy thuộc vào các loài khác nhau.
Kết quả nhuộm bào tử: các tế bào dinh dưỡng của vi khuẩn
Bacillus có hiện tượng hình thành bào tử sau 24 giờ phát triển
trên bề mặt môi trường thạch. Quan sát các mẫu vi khuẩn
Bacillus đã nhuộm bào tử trên kính hiển vi cho thấy bào tử bắt
màu xanh của thuốc nhuộm Malachite Green và thành tế bào
vi khuẩn bắt màu hồng của Safranin.
Sau khi kiểm tra và đánh giá lại 67 chủng vi khuẩn đã thu
thập được dựa trên quan sát hình dạng, đặc điểm, màu sắc,
kích thước và thời gian phát triển của khuẩn lạc trên môi
trường thạch cũng như hình dạng và kích thước tế bào vi
khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram, nhuộm bào tử đã loại bỏ các
chủng vi khuẩn trùng lặp giữa các ao và các đợt thu mẫu.
Đồng thời thực hiện các thí nghiệm xác định khả năng hình