NGHIÊN cứu CHẾ tạo KHÁNG THỂ QUA LÒNG đỏ TRỨNG gà để PHÒNG CHỐNG TIÊU CHẢY và SƯNG PHÙ đầu DO e coli ở lợn (2)

Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh

Mở đầu

Theo số liệu từ Tổng cục Thống kê năm 2008, cả nớc có 26,7 triệu con lợn,
sản lợng thịt lợn hơi đạt 2.771.000 tấn, chiếm tỷ lệ 73,9% tổng sản lợng thịt gia súc,
gia cầm [20]. Ngành chăn nuôi lợn ở nớc ta đà khẳng định đợc tầm quan trọng và đòi
hỏi sự phát triển mạnh mẽ trong tơng lai. Xuất phát từ nhu cầu ấy, Bộ Nông nghiệp
và Phát triển Nông thôn đà đề ra kế hoạch đến năm 2010 phải đạt bình quân đầu ngời
35 kg thịt lợn hơi. Cả níc sÏ cã 30 triƯu con lỵn víi chÊt lỵng đàn lợn thịt có tỷ lệ
nạc cao đáp ứng nhu cầu tiêu dùng trong nớc và xuất khẩu [20].
Tuy nhiên, việc phát triển đàn lợn cũng làm xuất hiện các loại bệnh, ảnh hởng
không nhỏ tới năng suất và hiệu quả chăn nuôi. Trở ngại lớn nhất hiện nay, đặc biệt
trong các cơ sở chăn nuôi lợn sinh sản là bệnh tiêu chảy ở lợn từ sơ sinh đến 21 ngày
tuổi và phù đầu ở lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi. Bệnh không chỉ phổ biến ở nớc ta mà còn
xuất hiện khắp thế giới, gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi lợn sinh sản.
Bệnh xuất hiện lúc ồ ạt, lúc lẻ tẻ tùy thuộc vào thời tiết, khí hậu, điều kiện chăm sóc,
quản lý. Tỷ lệ lợn mắc bệnh cao, từ 70 - 85%, có những nơi 100%, tỷ lệ chết tới 18 20% [3]. Đặc biệt, tại các trại chăn nuôi lợn tập trung, bệnh càng gây thiệt hại đáng
kể [21].
Để chống lại bệnh do E. coli, các nhà chăn nuôi đà sử dụng nhiều phơng
thuốc, từ cổ truyền đông y đến các liệu pháp kháng sinh hiện đại, kể cả các phơng
pháp hoá sinh hay dinh dìng kü tht cao, nhng cịng chØ khống chế đợc một phần.
ở Việt Nam nhiều biện pháp áp dụng đà mang lại kết quả, trong đó tác dụng cao
nhất là dùng thuốc kháng sinh. Mấy thập kỷ qua, thuốc kháng sinh đà giảm bớt đáng
kể tổn thất do dịch bệnh. Tuy nhiên, các nhà khoa học trong nớc khẳng định E. coli
đà kháng thuốc với tỷ lệ cao và kháng nhiều loại thuốc kháng sinh khác nhau [8],
[19]. Bên cạnh đó mặt trái của thuốc kháng sinh ngày càng lộ rõ, việc dùng thuốc
kháng sinh kéo dài đà tiêu diệt cả vi khuẩn có lợi trong đờng ruột. Hậu quả là lợn
con còi cọc, chậm lớn, lông xù, thịt lợn bị tồn d kháng sinh, ảnh hởng xấu đến sức
khoẻ cộng đồng và giảm giá trị thịt lợn xuất khẩu.
Xu hớng dùng các chế phẩm sinh học trong chăn nuôi là liệu pháp đúng đắn

mà thế giới đang yêu cầu và phát triển. Không chỉ giới hạn trong mục đích phòng trị
bệnh, nâng cao năng suất chăn nuôi, việc sử dụng chế phẩm sinh học còn có ý nghĩa
quan trọng đối với môi trờng và sức khoẻ cộng đồng vì nó tạo ra một nền sản xuất
thực phẩm an toàn, đảm bảo sự ổn định trạng thái cân bằng của môi trờng sinh thái.
Muốn đạt đợc yêu cầu đó, việc nghiên cứu chế tạo các chế phẩm sinh học an
toàn để phòng và chữa bệnh cho vật nuôi đang đòi hỏi cấp bách. Dựa trên cơ sở miễn
dịch học và phản ứng kháng nguyên - kháng thể ngời ta đà sản xuất đợc nhiều loại

1


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
kháng thể đặc hiệu từ huyết thanh động vật để chữa bệnh, nhng giá thành cao, khi
dùng dễ gây phản ứng huyết thanh nên ít đợc sử dụng rộng rÃi.
Gần đây ngời ta phát hiện ra rằng, khi gà đợc tiêm kháng nguyên, kháng thể ở
máu đợc truyền sang lòng đỏ trứng tới 80%, đặc biệt là thành phần IgG. Kháng thể
đặc hiệu chế từ lòng đỏ trứng gà đợc miễn dịch sẽ có nhiều u thế hơn hẳn so với
kháng thể đặc hiệu chế từ huyết thanh động vật, vì khi ứng dụng vào sản xuất nó có
thể sản xuất với số lợng lớn, giá thành sản xuất thấp, không phải giết động vật và khi
dùng không xảy ra phản ứng phụ. Cho đến nay đà có nhiều công trình ở các nớc nh:
Đức, Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc công bố về việc chế tạo và sử dụng kháng thể ở lòng
đỏ để điều trị và phòng nhiều bệnh vật nuôi có hiệu quả cao. Qua gà, ngời ta đà thu
đợc nhiều loại kháng thể chống lại các vi rút, vi khuẩn, độc tố, nọc rắn, các hoá
chất... để dùng cho các xét nghiệm chẩn đoán y học [36].
Để có thể sớm tạo ra một loại thuốc phòng và chữa trị hiệu quả, an toàn bệnh
tiêu chảy và sng phù đầu do E. coli gây ra ở lợn, chúng tôi tiến hành đề tài: "Nghiên
cứu chế tạo kháng thể qua lòng đỏ trứng gà để phòng chống tiêu chảy và sng phù
đầu do E. coli ở lợn", với hai mục tiêu sau:
Phân lập, tuyển chọn và xác định các chủng E. coli gây bệnh điển hình có độc
lực, có tính kháng nguyên mạnh để làm giống.

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học đặc hiệu kháng thể phòng và chữa
bệnh tiêu chảy và sng phù đầu của lợn do E. coli.

Chơng 1: Tổng Quan
1.1. Tình hình nghiên cứu về E. coli gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở
lợn

1.1.1. Tình hình nghiên cứu trong nớc
Hiện tợng vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở
lợn con đà có từ rất lâu và ngày càng phổ biến ở các trại chăn nuôi tập trung và trong
nông hộ. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, bệnh tiêu chảy và phù
đầu ở lợn con đà đợc khống chế phần nào, nhng việc loại trừ nó trong chăn nuôi thì
hầu hết các nhà nghiên cứu đều cho rằng còn rất nhiều khó khăn không những ở nớc
ta mà còn ở cả các nớc có trình độ khoa học tiên tiến trên thế giới [2], [5], [9]. Chính
vì vậy mà nhiều nhà khoa học vẫn quan tâm nghiên cứu.

2


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
Cù Hữu Phú và cs [13] đà phân lập đợc 60 chủng vi khuẩn E. coli ở lợn mắc
bệnh tiêu chảy từ 35 ngày đến 4 tháng tuổi, trong đó có 42 chủng gây dung huyết.
Lý Liên Khai [9] khi phân lập E. coli từ phân lợn con bị tiêu chảy và phân lợn
con khỏe mạnh đà cho biết: Các chủng E. coli mang K88, K99 và 987P là nguyên
nhân chính gây tiêu chảy cho lợn con từ 1 đến 2 tuần tuổi. Vi khuẩn E. coli thờng
xuyên c trú trong ruột lợn và chúng chỉ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi nh : tác
động stress làm giảm sức đề kháng của lợn, làm tăng số lợng vi khuẩn và sinh độc tố.
Nguyễn Khả Ngự và cs [12] xác định khả năng dung huyết và kháng thuốc
kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con trớc và sau cai sữa bị phù đầu ở
đồng bằng sông Cửu Long. Víi 21 chđng vi khn E. coli ph©n lËp tõ lợn chết, tác giả

cho biết 100% số chủng ngng kết với kháng huyết thanh K88, 40% gây dung huyết
mạnh, các chủng này đều có khả năng kháng nhiều loại thuốc kháng sinh thông thờng. Cũng nghiên cứu về khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn E. coli gây
tiêu chảy trên lợn, Bùi Thị Tho và cs [8] sau khi kiểm tra khả năng kháng thuốc kháng
sinh của 183 chủng E. coli phân lập từ phân của lợn con bị phân trắng, đà nhận định:
tính kháng thuốc của E. coli ở mỗi cơ sở có sự khác biệt rõ rệt tùy theo quá trình sử
dụng và có sự khác biệt về chủng E. coli gây bệnh ở các lứa tuổi lợn khác nhau. Các
chủng E. coli tạo khuẩn lạc dạng nhám có tính kháng thuốc cao hơn các chủng tạo
khuẩn lạc trơn. Qua 20 năm kiểm tra tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli phân
lập từ lợn con bị bệnh phân trắng, các tác giả nhận thấy tính kháng thuốc của chúng
đối với một số thuốc kháng sinh thờng dùng tăng lên rất nhanh. Tỷ lệ các chủng
kháng nhiều loại thuốc kháng sinh cũng phát triển nhanh, một số chủng đà kháng với
hầu hết các loại thuốc thờng dùng [8].
Đỗ Ngọc Thúy và cs [19] cho biết tỷ lệ kháng kháng sinh của 106 chủng
E. coli đợc phân lập từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy có xu hớng kháng mạnh với các
loại thuốc kháng sinh thờng dùng để điều trị bệnh nh amoxicillin, cloramphenicol,
streptomycin.
Đỗ Trung Cứ và cs [4] khi sử dụng chế phẩm Biosubtyl để phòng bệnh tiêu
chảy cho lợn con đà làm giảm đợc 42% số lợn tiêu chảy ở lợn con giai đoạn từ 1 đến
60 ngày tuổi.

1.1.2. Tình hình nghiên cứu ở níc ngoµi

3


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
Cox và cs [34] cho r»ng, E. coli céng sinh cã mỈt thêng trực trong đờng ruột
của ngời và động vật, trong quá trình sống vi khuẩn có khả năng tiếp nhận các yếu tố
gây bệnh nh yếu tố bám dính (K88, K99), yÕu tè dung huyÕt (Hly), yÕu tè c¹nh tranh
(Colv), yÕu tố kháng thuốc kháng sinh và độc tố đờng ruột. Các yếu tố gây bệnh này

không đợc di truyền qua ADN của nhiễm sắc thể mà đợc di truyền qua ADN nằm trên
plasmid. Những yếu tố gây bệnh này giúp cho E coli bám dính vào tế bào nhung mao
ruột non, xâm nhập vào thành ruột, phát triển với số lợng lớn. Sau đó vi khuẩn thực hiện
quá trình gây bệnh bằng cách sản sinh độc tố, gây triệu chứng tiêu chảy, phá hủy tế bào
niêm mạc ruột và tế bào nhung mao ruột non.
Fairbrother và cs [37] khi nghiên cứu các yếu tố gây bệnh ở từng chủng
E. coli phân lập đợc từ các thể bệnh khác nhau, đà đặt tên vi khuẩn theo những yếu tố
gây bệnh mà chúng có khả năng sinh ra nh: Enterotoxigenic Escherichia coli
(ETEC), Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC), Verotoxigenic Escherichia coli
(VTEC) vµ Adherencia Enteropathogenic Escherichia coli (AEEC).
E. coli gây bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con có mặt ở hầu hết các nớc trên
thế giới nên đà có nhiều tác giả nghiên cứu về chúng. Simon và cs [62] đà làm rõ vai
trò của ba loại kháng nguyên bám dính K88 trong E. coli là K88ab, K88ac và K88ad
và cho biết: các chủng E. coli sản sinh độc tố đờng ruột (ETEC) mang những kháng
nguyên bám dính này đều gây tiêu chảy nặng dẫn đến tử vong ở một số lợn con. Sự
cảm nhiễm bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn con có liên quan mật thiết đến khả năng
bám dính của E. coli.
Smith thông báo có hai loại độc tố là thành phần chính của Enterotoxin đợc tìm
thấy ở các chủng E. coli gây bệnh tiêu chảy. Sự khác biệt của hai loại độc tố này nằm ở
khả năng chịu nhiệt. Độc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin -ST) chịu đợc nhiệt độ 1000C
trong 15 phút, độc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin -LT) bị bất hoạt ở 60 0C
trong vòng 15 phút [63].
Cùng với việc phân lập và nghiên cứu các yếu tố gây bệnh của E. coli, việc
nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm phòng bệnh tiêu chảy ở lợn cũng đà đợc các
nhà khoa học trên thế giới đặc biệt quan tâm.
1.2. Vi khuẩn Escherichia coli

Trùc khuÈn ruét giµ Escherichia coli thuéc hä Enterobacteriaceae. Trong các vi
khuẩn đờng ruột, E. coli là loài phổ biến nhất. E. coli còn có tên là Bacterium coli
commune, Bacillus coli communis do Escherich phân lập năm 1885 từ phân trẻ em.

E. coli thờng xuất hiện rất sớm ở đờng ruột ngời và động vật, ngay sau khi đẻ
hai giờ và tồn tại cho đến khi vật chủ chết. Chúng thờng định c ở phần sau của ruột,
ít khi gặp ở dạ dày hay ruột non. Trong nhiều trờng hợp còn tìm thấy chúng ở niêm
mạc của nhiều bộ phận khác trong cơ thể.

4


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
Từ đờng tiêu hóa, E. coli đợc thải theo phân ra môi trờng ngoài. Việc tìm chỉ
số E. coli ở môi trờng giúp đánh giá môi trờng đó tốt hay xấu về mặt vệ sinh [6], [18].
ở điều kiện bình thờng, các chủng E. coli không gây bệnh, khi các điều kiện chăm
sóc, nuôi dỡng, vệ sinh thú y kém, điều kiện ngoại cảnh bất lợi dẫn đến sức chống đỡ
của con vật suy giảm thì E. coli trở nên độc và có khả năng gây bệnh [18].

1.2.1. Đặc tính sinh vật hóa học của E. coli
1.2.1.1. Đặc tính hình thái
E. coli là trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, kích thớc 2-3 x 0,6 m. Trên tiêu bản
nhuộm Gram, vi khuẩn bắt màu Gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu,
đứng tụ lại thành từng đám, đôi khi xếp 2 - 3 vi khuẩn thành một chuỗi dài. Trong
môi trờng nuôi cấy lâu ngày có khi thấy những trực khuẩn dài 4 - 8 m. E. coli di
động nhờ có lông ở xung quanh thân, nhng khi nuôi cấy trong điều kiện bất lợi sẽ
mất lông, không di động. Vi khuẩn không sinh bào tử, nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc
nhày để nhuộm có thể thấy màng giáp, còn khi soi tơi sẽ không thấy đợc [39]. Dới
kính hiển vi điện tử, còn phát hiện đợc các pili, yếu tố bám dính của E. coli [18].
1.2.1.2. Đặc tính nuôi cấy
E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khÝ tïy tiƯn, cã thĨ sinh trëng ë nhiƯt ®é
tõ 5 - 400C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4, nhng có thể phát triển
đợc ở pH từ 5,5 8,0 [18].
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trờng nuôi cấy thông thờng, một số

chủng có thể phát triển đợc ở môi trờng tổng hợp đơn giản [13].
- Trên môi trờng thạch thờng: Sau khi nuôi cấy 370C/24 giờ, E. coli hình thành
khuẩn lạc tròn ớt, bóng láng, màu tro nhạt, hơi lồi, đờng kính 2-3 mm. Có thể quan
sát thấy cả những khuẩn lạc dạng nhày (mucous) và dạng nhám (rough).
- Trong môi trờng nớc thịt: Sau khi nuôi cấy 370C/24 giờ, E. coli phát triển rất
nhanh, môi trờng rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình
thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trờng, môi trờng có mùi phân thối.
- Trên môi trờng thạch máu: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C hình thành khuẩn lạc to, ớt,
lồi, viền không gọn, màu sáng, kÝch thíc tõ 1 -2 mm. Cã khi g©y dung huyết.
- Trên môi trờng thạch Mac Conkey: Sau khi nuôi cấy 24 giờ ở 37 0C hình thành
khuẩn lạc màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn, không làm
chuyển màu môi trờng.
- Trên môi trờng Endo: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, có ánh
kim hoặc không có ánh kim.

5


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
- Trên môi trờng EMB (Eosin Methyl Blue): Hình thành khuẩn lạc màu tím đen có
ánh kim.
Không mọc trên các môi trờng lục Malachite và Miiller Kauffmann. Bị ức chế
khi nuôi trong các môi trờng Wilson Blair.
1.2.1.3. Đặc tính hóa sinh
- Lên men sinh hơi các loại đờng:
E. coli có khả năng lên men sinh hơi các loại đờng glucose, fructose,
galactose, lactose, maniton, mannit, levulose, xylose, không lên men andonit và
innozit, lên men không ổn định các loại đờng dulciton, saccarose, salixin [18].
E. coli lên men sinh hơi nhanh đờng lactose, còn Salmonella spp thì không có
đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E. coli với Salmonella spp.

- Các phản ứng khác:
Sữa

Đông sau 24 giờ đến 72 giờ ở 370C

Genlatin

Không tan chảy

Indol

+

Catalase

+

Oxidase

-

Urease

-

Di động

+

MR

+

VP

-

H2S

-

1.2.1.4. Sức đề kháng
E. coli có sức đề kháng yếu, bị diệt ở nhiệt độ 55 0C trong 1 giờ hoặc 600C
trong 30 phút, đun sôi 1000C thì chết ngay. Những chủng E. coli trong phân có xu hớng đề kháng với nhiệt cao hơn những chủng phân lập ở môi trờng bên ngoài. ở môi
trờng bên ngoài các chủng E. coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng. Các chất sát
trùng nh axit phenic 3%, clorua thđy ng©n (HgCl2) 0,1%, formol 0,2% cã thể diệt E.
coli sau 5 phút. E. coli đề kháng với điều kiện khô và hun khói [18] .
1.2.2. Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E. coli
E. coli đợc chia thành các nhóm huyết thanh (serogroup) và kiểu huyết thanh
(serotype) khác nhau dựa theo cấu trúc kháng nguyên O, K, H và F. Theo phản ứng

6


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
ngng kết có 250 kiểu kháng nguyên O, 89 kháng nguyên K, 56 kháng nguyên H và một
số kháng nguyên F [17], [25].
1.2.2.1. Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân - Ohne Hauch)
Kháng nguyên O của E. coli có bản chất lipopolysaccharide, rất độc. Chỉ cần
1/20 mg kháng nguyên O đủ giết chết chuột bạch sau 24 giờ. Kháng nguyên O đợc

coi nh một yếu tố độc lực có thể tìm thấy ở thành tế bào vi khuẩn.
Cấu trúc phân tử polysaccharide của kháng nguyên O gồm hai phần: phần
polysaccharide nằm ngoài chứa nhóm hydro có chức năng tạo ra tính đặc trng về
serogroup. Phần polysaccharide ở bên trong không chứa nhóm hydro có chức năng
phân biệt giữa các dạng khuẩn lạc: dạng S (Smooth), dạng R (Rough), dạng M
(Mucous). Khi làm mất dần từng đơn vị đờng của các chuỗi polisaccharide hoặc làm
thay đổi vị trí ở các đơn vị này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của các vi khuẩn.
Kháng nguyên O chịu đợc nhiệt, không bị phá hủy khi đun nóng ở 1000C trong
2 giờ. Dới tác động của cồn, axít HCl nồng độ 1N vi khuẩn chịu đợc trong 20 giờ,
nhng lại bị phá hủy bởi formol 0,5%.
Kháng nguyên O đợc cấu trúc bởi các phân tử lớn, thành phần các phân tử
gồm có:
+ Polyosit: tạo ra tính đặc hiệu của kháng nguyên.
+ Protein: làm cho phức hợp có tính kháng nguyên.
+ Lipit: kết hợp với polyosit và là cơ sở của độc tính.
Tất cả kháng nguyên O đều c trú ở bề mặt, do đó nó liên hệ trực tiếp với hệ
thống miễn dịch. Khi kháng nguyên O gặp kháng huyết thanh tơng ứng sẽ xảy ra
phản ứng ngng kết. Phản ứng ngng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt nhỏ, khi
lắc rất khó tan.
1.2.2.2. Kháng nguyên H (kháng nguyên lông - Hauch)
Kháng nguyên H là thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất protein, rất
kém bền vững so với kháng nguyên O. Kháng nguyên H không chịu nhiệt, bị phá
hủy ở 600C trong 1 giờ. Bị cồn 50% và các enzym phân giải protein phá hủy. Kháng
nguyên H tồn tại đợc khi xử lý bằng formol 0,5%.
Kháng nguyên H khi gặp kháng thể H tơng ứng sẽ tạo ra hiện tợng ngng kết
H, trong đó các vi khuẩn đợc ngng kết lại với nhau nhờ các lông vì các kháng thể H
khi cố định trên lông sẽ là cầu nối với các lông bên cạnh. Phản ứng xảy ra nhanh hơn
so với kháng nguyên O và các hạt ngng kết cũng lớn hơn, giống nh những cụm bông
rất dễ tan khi lắc vì lông của vi khuẩn rất nhỏ và dễ đứt. Vi khuẩn di động khi tiếp
xúc với kháng thể H tơng ứng sẽ trở thành không di động.

7


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
Kháng nguyên H của E. coli không có tính độc và cũng không có ý nghĩa
trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít đợc quan tâm nghiên cứu, nhng nó có ý nghĩa
rất lớn trong việc xác định tên vi khuẩn [51]. Các nhà khoa học đà dùng những
chủng E. coli có lông và không có lông của cùng một serogroup O để gây cảm
nhiễm cho chuột bằng đờng miệng với lợng vi khuẩn bằng nhau. Kết quả cho thấy
khả năng gây bệnh cho chuột thí nghiệm hoàn toàn giống nhau.
Kháng nguyên H bảo vệ cho vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thực
bào, từ đó giúp vi khuẩn sống lâu và tồn tại lâu hơn trong đại thực bào.
1.2.2.3. Kháng nguyên K (Kháng nguyên vỏ - Capsular)
Kháng nguyên K còn đợc gọi là kháng nguyên vỏ (Capsular), chúng bao
quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất hóa học là polysaccharide. Kháng nguyên này
ngăn cản sự ngng kết cđa vi khn trong hut thanh "O" t¬ng øng. Khi đun nóng
100 - 1210C kháng nguyên sẽ mất tác dụng ngăn cản. Vai trò của kháng nguyên K
cha đợc thống nhất lắm. Có nhiều ý kiến cho rằng, nó không có ý nghĩa về độc lực
của vi khuẩn, vì thấy độc lực của chủng E. coli có kháng nguyên K cũng giống độc
lực của chủng không có kháng nguyên K [33]. Cã ý kiÕn kh¸c cho r»ng, nã cã ý nghĩa
về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trớc những yếu tố phòng vệ của vật chủ
[47]. Tuy vậy, phần lớn các ý kiến đều thống nhất kháng nguyên K có hai nhiệm vụ
sau:
- Hỗ trợ trong phản ứng ngng kết của kháng nguyên O nên thờng ghi liền công thức
serotype của vi khuẩn là Ox: Ky nh E. coli O139: K88, O149: K88...
- Tạo ra hàng rào bảo vệ cho cho vi khuẩn chống lại tác động của ngoại cảnh và hiện tợng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ.
1.2.2.4. Kháng nguyên F (Kháng nguyên Fimbriae- Kháng nguyên bám dính)
Hầu hết các chủng E. coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều kháng
nguyên bám dính. Các chủng không gây bệnh không có kháng nguyên bám dính.

Kháng nguyên bám dính giúp vi khuẩn bám vào các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào
biểu mô ruột và trên lớp màng nhày, giúp vi khuẩn chống lại khả năng đào thải của
nhu động ruột. Kháng nguyên bám dính của E. coli nằm trên cấu trúc pili (fimbriae),
một cấu trúc ngắn thẳng, xuất phát từ một đĩa gốc trong màng nguyên sinh chất của
tế bào vi khuẩn. Fimbriae có bản chất là protein mọc trên bề mặt tế bào vi khuẩn với
số lợng từ 10 - 40 fimbriae trên một tế bào vi khuẩn. Quan sát dới kính hiển vi điện
tử, chúng giống nh một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn. Fimbriae của vi
E. coli khác lông ở chỗ cứng hơn, không lợn sóng và không liên quan đến chuyển
động. Kháng nguyên bám dính đợc phân loại bởi phản ứng huyết thanh, thụ thể đặc
hiệu hoặc bằng khả năng ngng kết với hồng cầu của các loài động vật khác nhau vµ

8


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
bằng phản ứng PCR [17], [51]. Kháng nguyên có chức năng bám dính đặc trng của ETEC
(Enterotoxigenic E. coli) gây bệnh cho lợn chủ yếu là F4 (K88); F6 (987P); F107 và đôi
khi có cả F5 (K99). Kháng nguyên có chức năng bám dính của ETEC gây tiêu chảy
nguyên phát ở trâu bò là F5 (K99) đôi khi thấy cả F4 (K88) với tỷ lệ ít hơn. E. coli gây
bệnh cho trẻ em thờng có kháng nguyên bám dính F41 [51], [67].
1.3. Các yếu tố gây bệnh của E. coli

1.3.1. Yếu tố bám dính của E. coli
Để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính đợc lên tế bào biểu mô của ruột
non. Quá trình bám dính đợc thực hiện qua ba giai đoạn: hấp thụ, gắn kết và bám dính.
Hai quá trình trớc đợc thực hiện nhờ các tác động vật lý, hóa học, bớc bám dính đợc
thực hiện bởi các sợi bám dính chuyên biệt (pili) trên bề mặt vi khuẩn đảm nhiệm, đó là
quá trình liên kết giữa kháng nguyên tại yếu tố bám dính với các receptor tơng ứng trên
bề mặt của các tế bào biểu mô. Hầu hết các chủng ETEC đều có các yếu tố bám dính
bao gåm: K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F17, F18, F41, F42 và F165. Fimbriae là sự

tập hợp của các đơn vị protein nhỏ, đợc sắp xếp thành những sợi dây nhỏ gắn vào tế bào
và có tính miễn dịch cao. Các sợi bám dính và độc tố đờng ruột của các chủng ETEC
nhìn chung đợc di truyền bởi plasmid ngoại trừ F41 và F17 [51], [61], [67].
Về mặt hình thái học, những sợi fimbriae này là những phần protein gắn vào, có
đoạn thẳng, có đoạn hơi cong hoặc xoắn, có nguồn gốc từ màng ngoài của các tế bào vi
khuẩn. Chúng có khối lợng phân tử khác nhau, từ 15 - 25 KDa [51], [61]. Mặc dù các
thuật ngữ fimbriae và pili trớc kia đợc sử dụng nh những từ đồng nghĩa, nhng ngày nay
thuật ngữ fimbriae đợc dùng để chỉ nhóm protein bề mặt gắn vào màng tế bào, trái lại
pili lại dùng để chỉ một đặc tính hình thái chuyên biệt của fimbriae. Pili có cấu trúc cứng
có ®êng kÝnh tõ 7 - 8 nm vµ cã mét lỗ ở trục (nhóm 1), trái lại fimbriae thì khá mảnh và
linh hoạt với đờng kính không ổn định từ 2 - 4 nm (nhãm 2). Cã thÓ thÊy râ lµ F1 vµ F6
thc vµo nhãm 1 cã cÊu tróc giống nh pili, trái lại F4 và F5 thuộc nhóm thứ 2 có cấu
trúc giống fimbriae [51]. Nhìn chung, các fimbriae bao gồm các đơn vị cấu trúc nhỏ
đợc điều khiển và tập hợp dới sự hoạt động của các gen cấu trúc, đợc gọi là sợi bám
dính.
ETEC gây bệnh tiêu chảy cho lợn thờng mang các yếu tố bám dính sau đây:
- F4 (K88)
F4 hay còn gọi là K88 đầu tiên đợc mô tả bởi Orskov và cs (1961), là một kháng
nguyên không chịu nhiệt, không đợc sản sinh ở nhiệt độ 180C. Theo nghiên cứu trớc kia
của Kauffman (1947) thì kháng nguyên bề mặt này đợc cho là kháng nguyên vỏ (K) có
bản chất là polysacharide vì thế chúng đợc cho là K88. Các nghiên cứu sau này đà chỉ
ra rằng K88 không phải là polysacharide mà có bản chất là protein, nó không phải là
kháng nguyên vỏ nh đà đợc xác nhận trớc đây mà là fimbriae hay pili. Tuy nhiªn,

9


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
thuật ngữ này vẫn đợc dùng cho đến năm 1983 khi Orskov đề nghị sử dụng kháng
nguyên F (fimbriae) thay cho kháng nguyên K (capsular). Bằng việc sử dụng các kháng

huyết thanh đặc hiệu, Orskov và cs (1964) đà phân biệt đợc hai loại khác nhau của F4 là
F4ab và F4ac. Vào năm 1979, loại thứ 3 đợc phát hiện bởi Guinee và Jansen đợc đặt tên
là F4ad [17]. Rõ ràng là sợi F4 có chứa một vùng cố định hình thành loại "a" và các
vùng khác nhau, hình thành loại "b", "c", "d". Về mặt hình thái, F4 có các cấu trúc khác
nhau, từ mảnh, linh hoạt và kéo dài cho tới dạng cứng. Sự khác nhau này phần lớn phụ
thuộc vào môi trờng nuôi cấy [61].
Thành phần chính của F4 đà đợc mô tả đầu tiên bởi Mooi và cs [54]. Phân
tích F4 tinh khiết trong hỗn dịch gel dodecyl sulfate polyacrylamide cho thấy một
dải protein đơn lẻ với khối lợng phân tử từ 23.500 đến 26.000 Da, tuỳ thuộc vào các
loại F4 phân lập đợc [54]. F4 có hàng trăm các đơn vị protein nhỏ giống nhau, các
đơn vị này tạo thành sợi fimbriae.
Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám đợc vào thụ thể tơng ứng của nó trên tế bào
biểu mô của lông nhung ruột non từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập, cố định và phát
triển đợc ở thành ruột non.
- F5 (K99)
F5 trớc kia đợc cho là kháng nguyên bám dính của E. coli chỉ gây bệnh ở bê,
nghé và cừu. Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng đợc tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng
ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy [46]. Sự sản sinh F5 phơ thc vµo nhiỊu u tè cđa
vi khn nh tèc ®é sinh trëng, pha sinh trëng, nhiƯt ®é và alanine trong môi trờng [51].
Các gen mà hóa cho sù tỉng hỵp K99 n»m trong ADN cđa plasmid. Plasmid này có
khối lợng phân tử là 87,8 KDa [46].
- F6 (987P)
F6 nằm trong số các fimbriae phát hiện thờng xuyên nhất, nó đợc sản xuất bởi
ETEC ở lợn. Fimbriae này đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC
nhờ việc gắn kết vi khuẩn với các tế bào biểu mô ruột và cải thiện sự bám dính ở
màng nhầy để đa lợng độc tố đờng ruột tối đa ®Õn vËt chđ [49].
CÊu tróc F6 bao gåm sù s¾p xếp xoắn ốc của 3 protein: đơn vị chính FaeA,
đơn vị phụ FaeF và FaeG nằm ở đỉnh và các vị trí khác nhau dọc theo sợi fimbriae.
Các protein này có vai trò gắn kết F6 với thụ thể glycoprotein [34], [35]. F6 cđa
ETEC ë lỵn cã thĨ gióp vi khuẩn bám vào cả các thụ thể đợc cấu tạo bởi

glycoprotein và glycolipid trên riềm bàn chải của các tế bào biểu mô ruột lợn [34].
- F41
Những nghiên cứu đầu tiên về K99 cho rằng, đây là kháng nguyên gồm 1 đơn
vị, nhng gần đây khi điện phân thấy rằng nó có 2 đơn vị nhỏ, 1 đi về cực dơng và 1 đi về

10


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
cực âm. Đơn vị đi về cực dơng đợc cho là 1 fimbriae riêng biệt có tên là F41. Khối lợng phân tử của F41 là 30,5 KDa [33].
Các đặc điểm của F41 đợc thể hiện khác nhau phụ thuộc vào thành phần của
môi trờng nuôi cấy. F41 nguyên thể có cấu trúc sợi với đờng kính là 3,2 nm [47].
ox và cs đà nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về khả năng mẫn cảm và sức
đề kháng của lợn đối với E. coli có mang F41. Kết quả cho thấy các chủng có F41
bám vào lông nhung (với số lợng thấp) của 23 trong số 30 lợn đợc kiểm tra ở độ tuổi
4 đến 5 tuần. Ngoài ra, những lợn lớn tuổi hơn có sức đề kháng cao hơn với sự bám
dính cđa c¸c chđng E. coli cã F41 do c¸c thơ thể tơng ứng với F41 bị giảm đi.
- F17
F17 chủ yếu đợc phát hiện ở chủng E. coli gây tiêu chảy hay nhiễm trùng máu
trên bò. Một vài nghiên cứu cịng cho thÊy sù xt hiƯn cđa F17 ë c¸c chủng E. coli
phân lập từ bò tiêu chảy ở Pháp và Bỉ (chiếm tới 46%) [57]. Các chủng E. coli có F17 đợc phân lập từ các chất trong ruột bò cũng đợc gọi là chủng ETEC, khi F41, F5 hoặc cả hai
cùng xuất hiện ở trên bề mặt tế bào vi khuẩn. F17 cũng đợc tìm thấy ở các chủng E. coli
gây tiêu chảy ở lợn [57].
- F18
F18 không làm ngng kết hồng cầu, sản sinh rất ít khi vi khuẩn đợc nuôi cấy
trong các môi trờng thông thờng [51]. F18 đợc chia làm hai loại là F18ab và F18ac
[67]. Các nghiên cứu cho thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học.
F18ab ít thấy thể hiện ở trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiƯm. Chóng thêng thÊy cïng víi viƯc s¶n xt SLT-2e ë c¸c chđng VTEC, trong khi F18ac thĨ hiƯn
rÊt râ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các đặc tính của các
chủng ETEC.

Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải của
lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm [67], cũng không tập
trung ở lớp màng nhầy ruột của lợn con mới sinh. Điều này ngợc với F5 và F6, chúng
bám vào các tế bào biểu mô ruột. Khả năng bám này ở lợn con nhiều hơn so với lợn
lớn. Lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18ab
và F18ac theo tuổi của lợn vẫn cha đợc làm rõ, nhng có thể là do sự tăng dần các thụ
thể đặc hiệu ở lông nhung ruột của lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Sự thiếu hụt các thụ
thể của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các
chủng VTEC và ETEC ở lợn cai sữa [61], [61].
1.3.2. Yếu tố xâm nhập của E. coli
Yếu tố xâm nhập của E. coli là một khái niệm đựơc dùng để chỉ quá trình cha
đợc hiểu rõ, nhờ quá trình này mà E. coli qua đợc hàng rào bảo vệ của lớp nhầy trên

11


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào biểu mô, đồng thời sinh sản và phát triển
trong lớp tế bào này. Trong khi đó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm
nhập, không thể qua đợc hàng rào bảo vệ của lớp màng nhầy hoặc khi qua đợc hàng
rào này sẽ bị bắt bởi đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc [2], [6].
1.3.3. Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên
Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù E. coli có nhiều loại kháng nguyên,
trong đó có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch
phòng vệ cho vật chủ nhng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều
kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ và tham gia vào quá trình kháng lại
các yếu tố phòng vệ tự nhiên của vật chủ. Các kháng nguyên tham gia quá trình trên
phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K và kháng nguyên F [17].
1.3.4. Ỹu tè dung hut (Hly) cđa E. coli
Khi E. coli phát triển trong tổ chức cơ quan, sắt đợc cung cấp phụ thuộc vào

chất siderofor do vi khuẩn sản sinh ra. Chất này có khả năng phân hủy sắt liên kết
trong tổ chức vật chủ thông qua sự phá vỡ hồng cầu giải phóng sắt dới dạng hợp chất
HEM để vi khuẩn sử dụng. Sự phân hủy hồng cầu chủ yếu là do enzum heamolyzin
của vi khuẩn tiết ra vì thế có thể coi nó là một yếu tố độc lực gây bệnh của vi khuẩn
[16]. Khả năng dung huyết là yếu tố độc lực quan trọng của E. coli gây bệnh đờng
tiết niệu. E. coli phân lập từ cơ quan cảm nhiễm ngoài đờng ruột thờng có khả năng
dung huyết cao hơn nhiều so với E. coli ph©n lËp tõ ph©n.
Cã 4 kiĨu dung hut cđa E. coli: -haemolysin, -haemolysin, -haemolysin,
-haemolysin nhng quan träng nhÊt lµ kiĨu -haemolysin vµ -haemolysin [16],
[63].
Heamolyzin do E. coli sinh ra cã thể gây chết chuột, phôi trứng, tế bào phôi gà,
tế bào thận chuột và gây hoại tử da thỏ. Khối lợng phân tử của heamolyzin khoảng
300.000 Da, đợc cấu tạo chủ yếu từ protein, ngoài ra còn có hydratcacbon [63].
Theo Smith [63] E. coli gây bệnh cho lợn có khả năng sản sinh heamolyzin,
thờng thấy chủ yếu ở các serotgroup O nh: O8, O138, O141, O147. §a sè E. coli gây
bệnh đờng ruột cho lợn con theo mẹ đều gây dung huyết, đặc tính này không bền vững
khi nuôi cấy nhiều đời qua môi trờng nhân tạo.
1.3.5. Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của E. coli (ColV)
Trong quá trình phát triển và c trú ở đờng ruột, E. coli phát triển và tồn tại
cộng sinh với nhiều loại vi khuẩn đờng ruột khác: Salmonella spp, Staphylococcus
spp, Clostridium, Vibrio cholera. Để tạo điều kiện cho quá trình phát triển của mình và
trở thành vi khuẩn chiếm u thế trong đờng ruột, E. coli sản sinh ra chất kháng khuẩn

12


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, đợc gọi là ColV. Vì vậy, yếu
tố này cũng đợc coi là yếu tố độc lực của E. coli gây bệnh [5].
Khả năng sản sinh Colv của E. coli đợc di truyền qua plasmid, ColV plasmid

đợc tìm thấy không chỉ ở E. coli gây bệnh mà còn tìm thấy ở các loại vi khuẩn đờng
ruột khác. Yếu tố ColV lần đầu tiên đợc tìm thấy năm 1936, nhng ColV plasmid thì
mới phân lập đợc trong thời gian gần đây. Ngời ta cho r»ng viƯc di trun ColV thêng
g¾n liỊn víi việc di truyền serotype O18:K9:H7. Nhiều tác giả cho ColV là một chất
kháng sinh có hiệu quả, có thể tác dụng với tất cả các loại vi khuẩn đờng ruột trõ vi
khuÈn sinh ra nã. Hä mong muèn r»ng trong thời gian tới ColV đợc sử dụng rộng rÃi
nh một chất kháng sinh để ức chế hay tiêu diệt các loại vi khuẩn đờng ruột khác.
1.3.6. Tính kháng thuốc kháng sinh của E. coli
Để điều trị bệnh đờng ruột ngời ta sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh, ngoài
ra còn trộn chúng vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng trọng.
Vì vậy, khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn đờng ruột nói chung và E.
coli nói riêng đang ngày một tăng làm cho hiệu quả điều trị giảm, thậm chí nhiều
loại thuốc kháng sinh còn bị vô hiệu hóa hoàn toàn. Phạm Khắc Hiếu và cs [8] đÃ
tìm thấy chủng E. coli kháng lại 11 loại kháng sinh đồng thời chứng minh khả năng
di truyền tính kháng thuốc giữa E. coli và Salmonella spp qua plasmid.
Sở dĩ khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn nói chung và E. coli nói
riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng thuốc kháng sinh nằm trong
plasmid R (Resistance). Plasmid này cã thĨ di trun däc vµ di trun ngang cho tất
cả quần thể vi khuẩn thích hợp [19]. Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên
cứu khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn không còn đơn thuần là việc lựa
chọn thuốc kháng sinh mẫn cảm để điều trị bệnh do E. coli gây ra mà là nghiên cứu
một yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này.
1.3.7. Độc tố của E. coli
E. coli bám dính, xâm nhập vào niêm mạc ruột và sản sinh ra các loại độc tố
đờng ruột. Các độc tố này làm thay đổi quá trình trao đổi nớc và điện giải ở ruột non
và dẫn tới tiêu chảy do dịch tiết ra quá nhiều ở ruột non, không đợc hấp thu lại ở ruột
già [5], [9]. Sự sản sinh độc tố đợc xem là một yếu quan trọng của E. coli. Độc tố và
yếu tố bám dính đợc coi là những yếu tố độc lực vô cùng quan trọng đà và đang đợc
nhiều tác giả quan tâm và đề cập đến trong các nghiên cứu về E. coli.
E. coli sản sinh nhiều loại độc tố: enterotoxin, verotoxin, neurotoxin. Mỗi loại

độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra.
- Nhóm độc tố đờng ruét (Enterotoxin)

13


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
Fairbrother và cs [37] cho biÕt ®éc tè ®êng ruét do E. coli tạo ra (ETEC) gây
tiêu chảy trầm trọng cho lợn sơ sinh từ 1 - 4 ngày tuổi. E. coli xâm nhập vào tế bào
biểu mô ruột bằng một hoặc nhiều yếu tố bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P)
và F41 rồi xâm nhập vào thành ruột. Tại đó chúng sản sinh ra độc tố đờng ruột gồm
hai loại:
+ Độc tố chịu nhiệt (Heat stable toxin - ST)
Độc tố này chịu đợc nhiệt độ 1000C trong 15 phút. Độc tố ST đợc chia thành hai
nhóm STa và STb dựa trên đặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol.
STa là một protein không có tính kháng nguyên, có phân tử lợng gần 2.000
Da, STa kích thích sản sinh cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển
Na+ và Cl-, làm giảm khả năng hấp thu chất điện giải và nớc ở ruột. STa thờng thấy ở
ETEC gây bệnh ở lợn dới hai tuần tuổi và ở lợn lớn [39].
STb là một protein có tính kháng nguyên yếu, có phân tử lợng gần 5.000 Da,
STb kích thích tiết dịch độc lập ở ruột, phơng thức tác dụng của nó cha đợc hiểu rõ.
STb hoạt động ở ruột non lợn, nhng không hoạt động ở ruột non chuột, bê và bị vô
hoạt bởi trypsin. STb đợc tìm thấy ở 75% các chủng E. coli phân lập từ lợn con, 33%
phân lập từ lợn lớn [39].
Vai trò của STb trong tiêu chảy cha đợc biết đến, mặc dù ETEC sản sinh STb
có thể kích thích gây tiêu chảy và làm teo lông nhung ruột ở lợn con trong điều kiện
thực nghiệm [52].
Cả STa và STb đều có vai trò quan trọng trong việc gây tiêu chảy của các
chủng E. coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh.
+ Độc tố không chịu nhiệt (Heat labile toxin - LT):

Độc tố này bị bất hoạt ở nhiệt độ 60 0C trong vòng 15 phút. LT là độc tố phức
tạp có khối lợng phân tử cao, gồm 5 nhóm trong đó nhóm B có thể gắn với thụ thể
trên bề mặt tế bào biểu mô, còn nhóm A cã ho¹t tÝnh sinh häc cao. Nhãm A kÝch
thÝch sản sinh cAMP ở mức cao trong tế bào, dẫn đến tăng tiết Cl -, Na+, HCO3- và nớc vào trong rt [56]. Sù tiÕt níc qu¸ møc sÏ dÉn đến sự mất nớc nặng và rối loạn
trao đổi chất, cã thĨ dÉn ®Õn chÕt gia sóc.
LT cịng cã hai nhóm phụ LT1 và LT2, chỉ có LT1 bị trung hòa bởi
anticholerae toxin. LT đợc sinh ra bởi các chủng E. coli ở lợn thuộc nhóm phụ LT1,
còn LT2 đợc sinh ra bởi ETEC phân lập từ lợn và ngời. LT là một trong những yếu tố
quan trọng gây triệu chứng tiêu chảy [64]. Cả hai loại độc tố ST và LT đều bền vững
ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở nhiệt độ âm 200C.
Cơ chế tác động gây tiêu chảy của LT: tiểu phần B của phân tử LT gắn lên các
thụ thể đặc hiệu trên bề mặt màng tế bào biểu mô nhung mao ruột non, đoạn A 1 đợc

14


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
vận chuyển vào màng tế bào. Tại đây đoạn A 1 tơng tác víi hƯ thèng enzym
adenylate cyclase. Enzym nµy cã Ýt nhÊt ba thành phần: phần thứ nhất đảm bảo chức
năng chuyển ATP thành cAMP, phần thứ hai thực hiện chức năng enzym điều khiển
GTP, phần thứ ba là thụ thể cho hormone. Trong điều kiện bình thờng hệ thống trên
hoạt động khi hormone gắn lên các thụ thể của hệ thống này, do vậy GTP đợc nối
với điểm hoạt động của protein điều khiển adenylate cyclase, làm thành tổ hợp GTP
và protein điều khiển. Khi GTP chuyển thành GDP bởi enzym GDP-ase, hệ thống
này ở trạng thái không hoạt động. Đoạn A1 cđa LT lµ mét adenylase diphosphate
tranferase, chun ADP ribosom từ nicotinamide dinucleotile (NDA) đến protein
điều khiển. ADP-ribosom vừa đợc chuyển đến ức chế GTP-ase dẫn đến mất chức
năng kiểm soát hệ thống trên. Hiện tợng trên làm cho hệ thống adenylate cyclase thờng xuyên hoạt động, gây tăng cAMP hơn mức bình thờng dẫn đến bài xuất các ion
Na+, Cl+ và nớc từ tế bào vào xoang ruột gây hiện tợng tiêu chảy [64].
- Nhóm độc tố tế bào (Shiga /Verotoxin)

Năm 1977, Konowalchuck và cs [50] đà phát hiện một loại độc tố hoạt động
trong môi trờng nuôi cấy tế bào Vero (do đó đợc đặt tên là độc tố tế bào Vero), đợc
sinh ra bởi E. coli gây bệnh tiêu chảy ở ngời, tiêu chảy và bệnh phù đầu ở lợn con.
Tác động gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với tác động của độc tố đờng
ruột không chịu nhiệt cổ điển thuộc nhóm E. coli gây bệnh đờng ruột (ETEC). Cũng
trong năm đó, Konowalchuck và cs tìm thấy một số chủng E. coli, bao gồm cả chủng
H30 ở ngời, có độc tố tế bào trong môi trờng nuôi cấy tế bào Hela. Độc tố tế bào này
đợc trung hòa bởi kháng thể ®Ỉc hiƯu cho ®éc tè Shiga (Stx) cđa vi khn gây bệnh
lỵ, do đó nó còn đợc gọi là độc tè gièng nh Shiga (SLT).
Sù ph¸t hiƯn cđa c¸c nhãm nghiên cứu khác nhau về các loại độc tố tế bào này
đà đa ra nhiều thuật ngữ tơng đồng. Thuật ngữ độc tố Vero (VTs) hay độc tố giống
nh Shiga (SLTs) đợc sử dụng trong nhiều năm bởi các nhà nghiên cứu ở Canada và
Anh, nhng nhóm nghiên cứu ở Mỹ lại thờng dùng thuật ngữ E. coli sản sinh ®éc tè
Vero (VTEC) hay vi khuÈn E. coli s¶n sinh độc tố giống nh Shiga, mặc dù chúng là
những từ để chỉ một khái niệm nh nhau.
Stx đợc sản sinh bëi E. coli bao gåm 2 nhãm: Stx1 lµ nhãm độc tố giống nh
Stx của vi khuẩn gây bệnh lỵ và Stx2 là nhóm độc tố có liên hệ với Stx. Loại Stx1 đợc sản sinh từ chủng E. coli H19, H30, và 933 [31], [41]. Các loại độc tố kh¸c nhau
trong nhãm Stx1 chØ kh¸c nhau ë mét axit amin và không gây khác biệt ở tính độc tố
hay tính kháng nguyên. Stx2 đợc sản sinh bởi E. coli chủng 933 và E32511 [41],
[51]. Độc tố Stx2e đợc sản sinh bởi E. coli chủng E57, S1191 và 412, độc tố này xuất
hiện ở bệnh phù đầu của lợn sau cai sữa [51]. Các loại độc tố khác của Stx2 cũng đợc
mô tả bởi Konowalchuck và cs [50] khi phát hiƯn ë chđng E. coli H.I.8 trªn ngêi. Nã cã

15


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
mối liên hệ gần với Stx2e hơn Stx2 và đợc đặt tên là Stx2ev sau loại gây bệnh phù đầu
(Stx2va), hay (Stx2vh) sau loại gây bệnh ở ngời.
Stx có cấu trúc đơn vị nhỏ A-B bao gồm một đơn vị A có kích thớc khoảng 33

KDa và 5 đơn vị B, mỗi đơn vị có kích thớc 7,5 KDa. Đơn vị A là phần hoạt hóa của
độc tố, còn các đơn vị B gắn kết độc tố với thụ thể ở màng tế bào. Sự chuyên hóa của
thụ thể dựa trên một vài axit amin ở đơn vị B [50].
- Độc tố Stx2e (Vt2e)
Độc tố Shiga ở lợn là một loại trong nhóm độc tố Stx2 với một số khác biệt
trong đặc tính sinh học. Stx1 và Stx2 gây độc cho các tế bào Hela. Stx2e kém độc
hơn so với các loại độc tố Stx2 khác. Stx2e độc hơn đối với tế bào Vero, từ 10-100
lần so với tế bào Hela. Các quan sát này có liên quan tới lợng thụ thể chuyên biệt có
mặt trên các loại tế bào [50].
Stx2e đợc mô tả là độc tố trong nhóm đồng hợp và với rất ít ngoại lệ là đặc
hiệu trên lợn [55]. Ngoài Stx2e, các độc tố Stx khác (Stx1, Stx2) hiếm khi đợc phát
hiện ở các chủng E. coli gây bệnh phù đầu [41].
Stx2e đóng vai trò quan trọng trong nguyên nhân gây bệnh và sự xuất hiện
các triệu chứng của bệnh phù đầu. Sau khi tụ đám và phát triển ở ruột, E. coli sinh
độc tố Shiga (STEC) sản sinh ra Stx2e, độc tố này đi qua tế bào biểu mô ruột vào
máu. Từ đó Stx2e gắn kết với các thụ thể có mặt ở các tế bào màng trong của động
mạch, các tiểu động mạch ở các mô và cơ quan khác nhau gây ra các tổn thơng vi thể.
Đó cũng là cơ sở của những tổn thơng đại thể và triệu chứng lâm sàng. Triệu chứng
cũng có thể thấy khi tiêm tĩnh mạch độc tố Stx2e tinh lọc [41]. E. coli sinh độc tố
Shiga (STEC) cũng gây ra bệnh tiêu chảy cho lợn sau cai sữa, nhng Stx2e không có
vai trò trong việc xuất hiện tiêu chảy, đó là do các độc tố đờng ruột cổ điển
(STEC/ETEC) [31].
1.4. Bệnh tiêu chảy và phù đầu ở lợn do E. coli gây ra

1.4.1. Bệnh tiêu chảy do E. coli ở lợn
Bệnh tiêu chảy ở lợn con đà trở thành một bệnh gây thiệt hại lớn về mặt kinh tế.
Nó có thể chia làm ba loại bệnh viêm ruột chính nh: tiêu chảy ở lợn sơ sinh (một vài
ngày đầu sau khi sinh), tiêu chảy ở lợn con theo mẹ (từ tuần đầu cho đến lúc cai sữa) và
tiêu chảy ở lợn sau cai sữa. Có nhiều nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở lợn con bao
gồm: virut gây viêm dạ dày ruột (Transmissible gastroenteritis virut-TGE),

Rotavirut, Coccidia. Trong đó, E. coli là nguyên nhân quan trọng nhất trong bệnh
tiêu chảy của lợn mới sinh và sau cai sữa [2], [6]. E. coli gây bệnh thờng có khả năng
sản sinh một hay nhiều yếu tố gây bệnh, ở những chủng E. coli không gây bệnh
không tìm thấy những yếu tố này.

16


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
1.4.1.1. Mầm bệnh
Tiêu chảy ở lợn con do E. coli thờng thấy ở lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Các
chủng gây bệnh đều sản sinh độc tố đờng ruột nên đợc gọi là ETEC (Enterotoxigenic
E. coli). ETEC bám vào màng nhày ruột non của lợn con bằng một hay nhiều kháng
nguyên bám dính F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) hoặc F41. Chúng phát triển ở tế bào
biểu mô ruột non và sản xuất một hay nhiều loại độc tố đờng ruột: STa (ST1), STb
(ST2) hoặc LT. Nhiều tác giả cho rằng hầu hết các chủng ETEC gây bệnh tiêu chảy ở
lợn con thuộc nhóm O149, O8, O147, O157 và sản sinh độc tố LT và STb [27], [40].
Ngoài ra, còn có c¸c chđng ETEC thc c¸c nhãm O8, O9, O64, O101 ngày càng
tăng lên. Các chủng này có F5, F6 hoặc F41 và chủ yếu sản sinh độc tố STa, ít thấy
sản sinh STb. Những chủng ETEC này gây bệnh chủ yếu ở lợn từ sơ sinh đến 6 ngày
tuổi, ít thấy ở lợn lớn hơn. Trái lại ETEC có F4 thờng phân lập đợc ở lợn từ sơ sinh
đến cai sữa.
1.4.1.2. Dịch tễ học
Sự xuất hiện của bệnh tiêu chảy do E. coli phụ thuộc vào sự tơng tác giữa vi
khuẩn gây bệnh với điều kiện môi trờng và các yếu tố từ bản thân vật chủ. Chỉ có
E. coli mang các yếu tố gây bệnh tăng sinh với số lợng lớn thì mới gây tiêu chảy.
Lợn con khi mới sinh, trớc khi bú mẹ đà tiếp xúc với môi trờng bị ô nhiễm nặng ở
chuồng đẻ, da của lợn mẹ và hệ vi sinh vật trong phân lợn mẹ. Do vËy, trong ®iỊu
kiƯn vƯ sinh kÐm hay trong chng đẻ dùng liên tục không có thời gian sát trùng và
để trống chuồng thì sự lây nhiễm E. coli gây bệnh ở môi trờng cao, khả năng bội

nhiễm cao dẫn đến xuất hiện dịch tiêu chảy do E. coli ở lợn con. Sữa đầu có chứa
kháng thể đặc hiệu IgA có thể ngăn ngừa sự bám dính của E. coli trong đờng ruột
của lợn con. Nếu lợn mẹ không tiếp xúc với E. coli gây bệnh trong môi trờng,
kháng thể đặc hiệu không có trong sữa đầu, lợn con sẽ rất mẫn cảm với mầm bệnh
[11], [21].
1.4.1.3. Triệu chứng
Sự lây nhiễm E. coli thờng gây ra tiêu chảy ở mức độ nặng nhẹ khác nhau phụ
thuộc vào các yếu tố gây bệnh của E. coli, tuổi và khả năng miễn dịch của lợn con.
Trong trờng hợp nặng, triệu chứng lâm sàng là mất nớc, rối loạn trao đổi chất
và chết. Trong vài trờng hợp, đặc biệt là ở lợn con, sự lây nhiễm rất nhanh và lợn
chết trớc khi xuất hiện tiêu chảy.
Triệu chứng tiêu chảy ở lợn con có thể quan sát thấy đầu tiên lúc 2 - 3 giê sau
khi sinh vµ cã thĨ thÊy ë mét vµi lợn con hay toàn ổ. Lợn con của những lợn nái hậu
bị thờng có tỷ lệ nhiễm bệnh tiêu chảy cao hơn so với những lợn con của lợn nái đẻ ở
những lứa sau. Phần lớn lợn con trong chuồng đều bị nhiễm bệnh và tỷ lệ chết rất cao
trong vài ngày đầu sau khi sinh. Tiêu chảy có thể ở mức độ nhẹ, lợn không có biểu

17


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
hiện mất nớc hoặc tiêu chảy nặng với phân toàn nớc. Phân lợn có màu khác nhau từ
trắng sang nâu, phân có thể chảy tự do từ hậu môn xuống sàn và chỉ phát hiện thấy
khi quan sát gần. Trong những ổ dịch nặng, một số lợn có thể nôn. Khối lợng cơ thể
bị giảm sút 30 - 40% do mất nớc. Cơ bụng hóp lại, lợn gầy, suy kiệt và xiêu vẹo, mắt
trũng sâu, da tái xám và nhợt nhạt. Sự mất nớc và giảm khối lợng cơ thể làm cho lợn
bị suy sụp nhanh, những lợn con này thờng chết. Trong trờng hợp mÃn tính hay bệnh
ít nghiêm trọng, da quanh hậu môn và vùng háng có thể đỏ lên do tiếp xúc với phân
kiềm tính, lợn ít bị mất nớc và nếu đợc điều trị tích cực có thể khỏi bệnh.
1.4.1.4. Phòng bệnh

Phòng bệnh tiêu chảy cho lợn con nên tập trung vào việc giảm số mầm bệnh
E. coli trong môi trờng bằng vệ sinh tốt, duy trì các điều kiện môi trờng thích hợp và
tạo miễn dịch ổn định.
Một điều quan trọng là lợn đợc nuôi trong môi trờng có nhiệt độ ổn định ở 32
- 34 C đối với lợn con theo mẹ, 30 - 320C đối với lợn con cai sữa, lợn con đợc nuôi
trong môi trờng thông thoáng, không có rác bẩn, nền chuồng có độ dẫn nhiệt thấp.
Lợn nái nên nuôi ở môi trờng 220C, vì vậy trong chuồng lợn đẻ cần có ổ có nhiệt độ
cao hơn cho lợn con [11].
0

Độ ẩm trong chuồng nuôi cũng ảnh hởng không nhỏ tới bệnh tiêu chảy ở lợn
con. Độ ẩm càng cao thì lợn con mắc tiêu chảy càng nhiều. Độ ẩm thích hợp cho lợn
con đợc khuyến cáo là 70 - 85% [21].
Thiết kế chuồng đẻ cũng rất quan trọng vì nó ảnh hởng đến vị trí thải phân
của lợn nái. Khi chuồng quá dài, phân rải rác trong diện tích chuồng do đó làm tăng
khả năng ô nhiễm. Tốt nhất là dùng cũi đẻ có thể điều chỉnh đợc, ngắn cho lợn cái
hậu bị, dài hơn cho lợn nái. Chuồng đẻ thờng cao trên mặt đất, nền chuồng bằng sàn
nhựa để hổng có lỗ cho phân rơi xuống. Nuôi trong những ổ đẻ nh vậy lợn con ít tiêu
chảy hơn những ổ đẻ có nền chuồng bằng xi măng. Chuồng đẻ nên đợc rửa sạch và
sát trùng giữa các lứa đẻ. Một hệ thống chuồng đẻ cùng vào cùng ra và đợc sát trùng
toàn bộ chuồng đẻ giữa các đợt sẽ làm giảm mật độ của E. coli ở môi trờng [22].
Khẩu phần ăn cho lợn có thể đợc điều chỉnh để làm giảm sự phát triển của
E. coli trong ruột [66].
- Phòng bệnh bằng miễn dịch
Khả năng miễn dịch chống bệnh tiêu chảy ở lợn con trớc tiên đợc cung cấp
thông qua sữa đầu của con mẹ, sau đó là sự đáp ứng miễn dịch tại ruột non. Những
kháng thể đặc hiệu trong sữa đầu hoặc ở niêm mạc ruột ngăn cản sự bám dính của vi
khuẩn vào các thụ thể trên tế bào biểu mô ruột non và trung hòa hoạt động của độc
tố đờng ruột, độc tố tế bào của E. coli. Sữa đầu của lợn nái có chứa hàm lợng kh¸ng

18


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
thể IgG cao và nó giảm rất nhanh trong quá trình tiết sữa, sau đó IgA trở thành
globulin miễn dịch chính [1]. IgA bảo vệ ruột chống lại sự xâm nhập của E. coli.
Hầu hết IgA, IgM và IgG trong sữa của lợn nái đợc sản xuất trong tuyến vú. Lợn con
mới sinh bắt đầu tổng hợp kháng thể đặc hiệu và phát triển hệ miễn dịch ở ruột non
trong tuần đầu tiên sau khi sinh [1], [30]. Trớc hết IgM thịnh hành ở 2 - 3 tuần đầu,
sau đó nó đợc thay thế bởi IgA, đây là một kháng thể quan trọng nhất ở trong ruột
non. Do vậy, trong tuần đầu tiên sau khi sinh thì sữa đầu là nguồn miễn dịch bảo vệ
chính cho lợn con [1].
1.4.1.5. Điều trị
Điều trị bệnh tiêu chảy do E. coli ở lợn con cần đợc tập trung vào việc loại bỏ
các yếu tố gây bệnh, khắc phục những ảnh hởng độc hại của chúng, bổ sung nớc và
điện giải đà mất và tạo môi trờng sống tối u cho lợn. Các liệu pháp điều trị càng áp
dụng nhanh, đồng bộ càng có hiệu quả. Để loại bỏ nguyên nhân gây bệnh, trớc tiên
cần sử dụng thuốc kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng để điều trị, đến khi biết đợc
kết quả của kháng sinh đồ thì dùng thuốc có độ mẫn cảm mạnh với E. coli để điều
trị.
Liệu pháp bổ sung dung dịch điện giải có đờng glucose để chống mất nớc và rối
loạn điện giải đem lại hiệu quả cao trong điều trị bệnh tiêu chảy.
Một số thuốc cản trở sự tiết dịch do độc tố đờng ruột có tác dụng tốt trong
điều trị tiêu chảy. Việc sử dụng các loại thuốc chống tiết dịch nh bencetimide và
loperamide đơn thuần hay kết hợp với thuốc kháng khuẩn cũng đà đợc khuyến cáo sử
dụng [22].
1.4.2. Bệnh phù đầu do E. coli gây ra ở lợn
1.4.2.1. Mầm bệnh
Bệnh phù đầu (Edema Disease) là bệnh gây ra bởi E. coli mang yếu tố bám
dính F18, F6, độc tố vero và khả năng dung huyết. Chúng sản xuất verotoxin đi vào

máu và làm tổn thơng thành mạch. Các khái niệm bệnh phù đầu, phù thũng, phù ruột
đợc coi là một bệnh, bởi vì phù ở lớp dới màng nhầy của dạ dày và ở giữa ruột kết
đều là những đặc điểm nổi bật của bệnh.
Bệnh phù đầu do các chủng E. coli gây ra hầu hết thuộc một số serotype rất
hạn chế trong một vùng nào đó, những serotype này thờng gắn với một số yếu tố bám
dính và độc tố ổn định. Serotype O139 đợc tìm thấy trên khắp thế giới và có F18ab.
Những chủng thuộc serotype này ở úc lại thờng gây bệnh tiêu chảy ở lợn sau cai sữa.
Trái lại, những chủng của nhóm này ở châu Âu thì thờng gây bệnh phù đầu [139].
Loại F18 (tríc kia gäi lµ F107, 2134P, 8813, Av24) vµ F4 (K88) đợc phát hiện với tỷ
lệ tơng ứng là 44% và 36% trong các chủng sản sinh độc tố. Trong khoảng 24% các

19


Luận văn thạc sĩ - Trần Văn Khánh
chủng có F4 không phát hiện thấy các gen mà hóa cho những loại fimbriae đà biết
khác. F6 (987P) thờng có mặt cùng với F4 hoặc F18 [63].
1.4.2.2. Dịch tễ học
Nhóm tuổi bị nhiễm bệnh phù đầu phụ thuộc vào tuổi cai sữa. Lợn con cha cai
sữa cũng có thể bị mắc phù đầu và mức độ trầm trọng phụ thuộc vào kháng thể trong
sữa của lợn mẹ. ở lợn trởng thành, phù đầu thờng là nguyên nhân của triệu chứng
thần kinh và là nguyên nhân gây chết đáng kể [7]. Tỷ lệ nhiễm bệnh trong các đàn
rất khác nhau, có thể lên tới 80%, nhng trung bình là 30 - 40%. Với bệnh phù đầu, tỷ
lệ chết từ 50 đến trên 90%. Thời gian bệnh kéo dài trong một đàn cũng khác nhau từ
4 - 14 ngày, trung bình là dới 1 tuần. Bệnh biến mất cũng đột ngột nh khi nó xuất
hiện. Sự tái diễn cũng có thể xảy ra tại chuồng đó [7].
Môi trờng ở chuồng cai sữa có thể là nguồn lây nhiễm các chủng E. coli gây
bệnh phù đầu. Lợn cha cai sữa có thể nhiễm trong chuồng đẻ và mang nó đến chuồng
cai sữa. Thờng xuyên rửa và sát trùng chuồng cũng cha đủ để cắt đứt chu kú lu trun
mÇm bƯnh [13]. Sù lan trun cđa các chủng E. coli gây bệnh có thể qua đờng không

khí, thức ăn, phơng tiện vận chuyển, qua lợn hoặc các dụng cụ chăn nuôi [14].
1.4.2.3. Cơ chế gây bệnh
Bớc đầu tiên của quá trình gây bệnh phù đầu ở lợn con sau cai sữa cũng giống
nh ở lợn con theo mẹ, đó là sự bám dính và phát triển trong ruột non, sản sinh độc tố.
Nhng để có đợc sự bám dính, E. coli phải tập trung thành đám ở lớp màng nhầy của
riềm bàn chải. Mức độ tập trung này quyết định liệu có gây ra bệnh hay không và
phụ thuộc vào nhiều nhân tố, không chỉ dựa vào khả năng sinh sản của vi khuẩn. Vi
khuẩn tập trung ở màng nhầy sẽ bám dính vào thụ thể nằm ở riềm bàn chải đặc thù
cho từng loại kháng nguyên bám dính và không phải có ở tất cả các lợn. Sau khi bám
dính, vi khuẩn xâm nhập vào lớp tế bào biểu mô rồi nhân lên, sản sinh độc tố đờng
ruột gây tiêu chảy. Từ lớp tế bào biểu mô E. coli xâm nhập vào hệ lâm ba, vào hệ
tuần hoàn gây dung huyết, theo máu đến các cơ quan nội tạng, phát triển nhân lên
phá hủy tế bào tổ chức, sản sinh verotoxin, neurotoxin làm tăng tính thấm thành
mạch gây phù, tác động vào tế bào thần kinh gây các biểu hiện thần kinh [6].
1.4.2.4. Triệu chứng
Biểu hiện đầu tiên là biếng ăn, bệnh nặng trong một thời gian ngắn. Triệu chứng
thần kinh xuất hiện vào ngày thø 6 sau khi m¾c bƯnh. Sng mÝ m¾t cịng xuất hiện vào
thời điểm đó. Liệt (mất chức năng điều khiển) kết hợp với rối loạn thần kinh thờng thấy
rất rõ. Những lợn bị bệnh thờng nằm nghiêng sang một bên. Nhiệt độ cơ thể luôn trong
giới hạn bình thờng, ở một vài cá thể trớc khi chết thân nhiệt có thể hạ xuống dới mức
bình thờng [11], [27].

20