Báo cáo nghiên cứu khoa học: "NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CẤU TRÚC ALKALOID TRONG DỊCH CHIẾT TỪ LÁ VÔNG NEM (ERYTHRINA ORIENTALIS L. FABACEAE) THỪA THIÊN HUẾ" ppsx

225
TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 65, 2011

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CẤU TRÚC ALKALOID TRONG
DỊCH CHIẾT TỪ LÁ VÔNG NEM (ERYTHRINA ORIENTALIS L. FABACEAE)
THỪA THIÊN HUẾ
Trần Thị Văn Thi, Trần Thanh Minh
Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
TÓM TẮT
Hàm lượng alkaloid toàn phần trong lá vông nem (Erythrina orientalis L. Fabaceae)
Thừa Thiên Huế là 0,18% (so với hàm khô). Đã phát hiện 10 alkaloid trong cao lá. Trong đó, 2
alkaloid đã được phân lập và nhận dạng cấu trúc bằng LC-MS, UV-VIS and
1
H-NMR. Chúng là
erythrartine và erythrartine N- oxide. Những alkaloid này chưa từng được phát hiện trong lá
vông nem (Erythrina orientalis L. Fabaceae) trước đây.

1. Mở đầu
Vông nem - Erythrina orientalis L. (tên gọi khác Erythrina variegata L.) là một
loài vông mọc hoang hoặc trồng phổ biến ở Việt Nam. Lá Vông nem có chứa nhiều
alkaloid, từ lâu đã được nhân dân ta sử dụng để ăn hoặc sắc uống chữa bệnh kém ăn,
mất ngủ, thần kinh suy nhược. Alkaloid toàn phần trong lá vông nem có tác dụng kháng
khuẩn, trợ tim, gây ngủ, an thần [1]. Một số cơ sở y tế hiện đang sử dụng cao lá Vông
nem kết hợp với một số vị dược liệu khác để làm thuốc [2, 3]. Trên thế giới đã có một
số công trình nghiên cứu về alkaloid của các loài Vông nem khác ở Ấn độ [4], Philippin
[5], Mỹ [6], nhưng chỉ tập trung vào alkaloid trong vỏ thân cây, hoa và hạt, mà không
quan tâm nhiều đến alkaloid trong lá. Chúng tôi nghiên cứu phân lập và nhận dạng cấu
trúc alkaloid trong lá vông nem nhằm góp phần nâng cao giá trị sử dụng của các
alkaloid trong dược liệu này.

2. Thực nghiệm
2.1. Xử lý sơ bộ lá vông nem và xác định độ ẩm
Lá vông nem được thu hái ở một số địa điểm trong thành phố Huế. Sau khi thu hái
về, lá được loại bỏ cuống, rửa sạch, để khô ngoài không khí, sau đó sấy khô ở 60
0
C trong 4
giờ và bóp vụn thành bột. Bột lá được dùng làm mẫu để chiết alkaloid. Độ ẩm của mẫu
được xác định bằng phương pháp khối lượng [7].
2.2. Chiết xuất alkaloid toàn phần
Bột lá được làm ẩm bằng etanol 96
0
, NH
4
OH 12,5% và chiết ngâm kiệt bằng etanol
96
0
. Dịch chiết được cất loại dung môi đến cắn, hòa tan cắn bằng H
2
SO
4
2%, lọc lấy dịch


226
lọc (các alkaloid lúc này ở dạng muối, không tan được trong CHCl
3
). Đem dịch lọc loại tạp
bằng CHCl
3
, rồi đưa về pH = 9-10 bằng NH

4
OH đậm đặc (các alkaloid lúc này ở dạng base
tự do, tan được trong CHCl
3
) và chiết lấy alkaloid bằng CHCl
3
. Lọc dịch chiết CHCl
3
qua
giấy lọc có Na
2
SO
4
khan, rửa giấy lọc và Na
2
SO
4
khan bằng CHCl
3
, rồi bốc hơi CHCl
3
(cô
cất ở 50
0
C) thu được cắn alkaloid toàn phần [1, 7, 8].
2.3. Định lượng alkaloid toàn phần tinh khiết
Định lượng alkaloid toàn phần tinh khiết trong cắn alkaloid toàn phần bằng phương
pháp chuẩn độ acid – base [1].
2.4. Phân lập các cấu tử alkaloid
Sử dụng các phương pháp: chiết phân đoạn trong các môi trường pH khác nhau,

chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau, sắc ký cột và sắc ký lớp
mỏng để phân lập các cấu tử alkaloid từ cắn alkaloid toàn phần.
- Chiết phân đoạn trong các môi trường pH khác nhau: cắn alkaloid toàn phần
được hòa tan trong H
2
SO
4
2%, sau đó lần lượt chuyển lên các phân đoạn pH = 2, pH = 6
và pH = 9 bằng dung dịch NH
4
OH đậm đặc và chiết bằng chloroform [1, 8].
- Chiết phân đoạn cắn alkaloid toàn phần bằng các dung môi có độ phân cực
khác nhau theo phương pháp chiết rắn - lỏng, định tính bằng thuốc thử Dragendorff.
- Sắc ký cột: cột sắc ký được nhồi theo phương pháp nhồi ướt với đường kính 2
cm và chiều cao 20 cm. Chất hấp phụ là silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063 – 0,200 mm), rửa
giải lần lượt bằng các dung môi và hệ dung môi có độ phân cực tăng dần.
- Sắc ký bản mỏng: sử dụng bản mỏng nhôm silica gel GF
254
tráng sẵn của
Merck, độ dày 0,25 mm. Triển khai với hệ dung môi CHCl
3
: CH
3
OH : NH
4
OH (50 : 9 :
1 theo thể tích). Thuốc hiện màu là hơi iod hoặc thuốc thử Dragendorff.
2.5. Xác định cấu tạo của alkaloid
- Xác định độ tinh khiết và định tính bằng sắc ký lỏng - khối phổ LC-MSD-
Trap-SL (Agilent); điều kiện sắc ký: dung môi methanol - nước (85:15), thời gian 35

phút, tốc độ dòng 1 ml/phút, cột ODS-C18, detector DAD, bước sóng 284 nm; điều kiện
ghi phổ khối: Nguồn ion EFI, khí làm khô N
2
(nhiệt độ khí 350
0
C, áp suất 30 psi, lưu
lượng khí 15 lít/phút). Chân không 2,5.10
-5
mmbar. Điện thế (năng lượng detector)
1118 V.
- Định tính cấu tạo bằng phổ MS, phổ
1
H-NMR Brucker Avance 500 MHz, dung
môi DMS; phổ mô phỏng được xây dựng trên phần mềm Chemdraw Ultra 8.0
(ChemOffice), phổ UV-VIS.


227
3. Kết quả và thảo luận
3.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần và số cấu tử alkaloid trong lá Vông nem
Từ 1604 g nguyên liệu lá Vông nem khô (độ ẩm trung bình 9,97%), bằng
phương pháp chiết ngâm kiệt, sau khi tinh chế thu được 4,05 g cắn alkaloid toàn phần
với độ tinh khiết 70,02% theo phương pháp chuẩn độ acid - base, tỷ lệ alkaloid tinh
khiết so với hàm khô là 0,18%.
Các giá trị R
f
của các cấu tử trong alkaloid toàn phần từ sắc ký đồ được trình bày
trên cột (2), bảng 1 cho thấy cắn alkaloid toàn phần có chứa 10 cấu tử trong giới hạn
phát hiện của sắc ký bản mỏng.
3.2. Phân lập các cấu tử alkaloid

Kết quả chiết các phân đoạn alkaloid ở pH khác nhau, sau đó chiết bằng
cloroform cho thấy rằng các cấu tử alkaloid trong lá vông nem đều có tính base yếu,
không tạo muối ở pH=2.
Tiến hành chiết phân đoạn cắn alkaloid toàn phần lần lượt bằng các dung môi có
độ phân cực tăng dần từ n - hexan đến methanol, kết quả thể hiện trên cột (3), bảng 1.
Như vậy, các alkaloid trong lá Vông nem có độ phân cực rất gần nhau, do đó không thể
phân lập bằng các dung môi tinh khiết.
Bảng 1. Một số tính chất của các alkaloid thành phần trong dịch chiết của lá Vông nem
(SKBM: sắc ký bản mỏng, SKC: sắc ký cột)
(1)
STT
(2)
R
f
(SKBM)
(3)
Chiết lên trong dung môi
(4)
Phân đoạn rửa giải (SKC)
1 0,84 n- hexane
2 0,77 benzene, chloroform
3 0,70 benzene, chloroform
chloroform : methanol
(5,5 :1)
4 0,61 chloroform
5 0,56 chloroform
6 0,49 benzene
7 0,43 chloroform
8 0,38 chloroform
9 0,31 chloroform methanol

10 0,23 chloroform


228
Bằng sắc ký cột kết hợp với sắc ký bản mỏng điều chế, đã phân lập và tinh chế
được hai cấu tử có R
f
= 0,70 (3,0 mg) và R
f
= 0,31 (1,4 mg).
3.3. Nhận dạng cấu trúc của các alkaloid đã phân lập
Cấu tử R
f
(SKBM) = 0,70: tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, thời gian lưu trên
LC là 12,13 phút, phổ MS có các mảnh ion: 330,0 ([M+H]
+
), 283,1; 192,1; 127,0 và
113,1; phổ UV – VIS có các cực đại hấp thụ: 285; 255 và 230 nm.
Cấu tử R
f
(SKBM) = 0,31: tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, thời gian lưu trên
LC là 12,60 phút, phổ MS có các mảnh ion: 346,0 ([M+H]
+
), 330,1 và 316,1; phổ UV –
VIS có các cực đại hấp thụ: 285 và 230 nm.
Từ kết quả LC-MS cho thấy, cấu tử R
f
= 0,70 tương ứng với alkaloid
erythrartine (C
19

H
23
NO
4
) và cấu tử R
f
= 0,31 chính là alkaloid erythrartine N-oxide
(C
19
H
23
NO
5
). Các Erythrina alkaloid được ghi nhận trên LC nhờ chất chuẩn nội là các
alkaloid ở cùng dãy dienoid Erythrina hay alkenoid Erythrina. Mặt khác, phổ khối đóng
vai trò cực kỳ quan trọng trong việc xác định các Erythrina alkaloid [9]. Mọi phân tích
chi tiết phổ khối của một loạt các Erythrina alkaloid đã chứng tỏ rằng, mảnh ưu tiên của
các alkaloid dạng dienoid và lactonic tương ứng với sự bẻ gãy nhóm metyl hay nhóm
metoxy từ nhóm metoxy tại C
3
. Các alkaloid dạng alkenoid phân mảnh theo một cách
khác, nhưng khuynh hướng chung đều là tạo thành hệ liên hợp dài hơn. Kết quả phân
mảnh phổ khối của cấu tử mà chúng tôi tách được (hình 1 và hình 2) là hoàn toàn phù
hợp với cơ chế phân mảnh của các Erythrina alkaloid có cấu trúc dienoid [9].

Hình 1. Sơ đồ phân mảnh của cấu tử erythratine

erythrartine

m/z =
330

m/z = 283
N
OH
CH
3
O
CH
3
O
CH
3
O
-e
H
N
OH
CH
3
O
CH
3
O
CH
3
O
+
N

O
CH
3
O
CH
3
O
CH
3
O
H
+
N
CH
3
O
CH
3
O
-O
-
OCH
3
m/z = 329


229
Các Erythrina alkaloid thu được đều có số mảnh ion rất ít do đã tạo hệ liên hợp
bền. Điều này phù hợp với tài liệu [9]. Ngoài ra, phổ UV-VIS của các cấu tử này có các
cực đại hấp thụ tại các bước sóng 

max
= 285 nm; 230 nm, đó là các cực đại hấp thụ của
nhân thơm có chứa 2 nhóm metoxy và hệ dien liên hợp [5]. Phổ
1
H-NMR của
erythrartine N- oxide có các peak ứng với  (ppm): 8,50 (d) của =CH-; 6,80 – 7,00 (s, s)
của =CH benzen; 6,70 (d) của =CH-, 6,60 (s) của =CH-; 5,80 (s) của -CH- bậc 3; 4,10
(s) của –OCH
3
; 3,82 (s) của –OCH
3
; 3,70 (d) của –CH
2
-; 3,50 (s) của -OCH
3
; 3,40 (s)
của –CH- bậc 3; 3,20 – 3,40 (s, s) của các –CH
2
-; 3,30 (s) của -OH; 2,50(d) của –CH
2
-;
2,45 (d) của –CH
2
- hoàn toàn phù hợp với phổ mô phỏng và đã được chúng tôi quy kết
phù hợp với mỗi hydro tại các vị trí trong công thức cấu tạo của erythrartine N- oxide.

Hình 2. Sơ đồ phân mảnh của cấu tử erythrartine N- oxide
Dienoid Erythrina alkaloid erythrartine và erythrartine N- oxide đã được phát
hiện trong hoa của loài E. mulungu của Philippin [5]. Ngoài ra, cấu tử erythrartine N-
oxide đã được phát hiện từ dịch chiết hạt của loài E. berteroana của Mỹ bằng phương

pháp GC/MS [6], nhưng chưa có công trình nào xác định chúng có mặt trong lá của loài
Vông nem Erythrina orientalis L. (hay Erythrina variegata L.) Việt Nam [10].
4. Kết luận
- Hàm lượng alkaloid toàn phần trong lá vông nem là 0,18% (so với hàm khô).
Trong cắn alkaloid toàn phần có 10 cấu tử trong giới hạn phát hiện của sắc ký bản
mỏng. Các cấu tử alkaloid trong lá vông nem đều có tính base yếu và có độ phân cực
gần nhau.
- Đã phân lập được 2 cấu tử có R
f
= 0,70 (3,0 mg) là erythrartine và R
f
= 0,31
(1,4 mg) là erythrartine N- oxide. Hai cấu tử này đã được phát hiện trong hoa của loài E.
mulungu, Philippin và trong hạt của loài E. berteroana, Mỹ, nhưng chưa có công trình
nào xác định chúng có mặt trong lá của loài Vông nem Erythrina orientalis L. (hay
Erythrina variegata L.) Việt Nam.
m/z = 345
m/z = 316
m/z = 330
N
OH
CH
3
O
CH
3
O
CH
3
O

+
N
OH
CH
3
O
CH
3
O
CH
3
O
O
+
N
CH
2
OH
CH
3
O
CH
3
O
CH
3
O
H
+
H

+
-O
-
CH
2
+


230
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1]. Nguyễn Thanh Kỳ, Nguyễn Thị Tâm, Trần Văn Thanh, Bài giảng dược liệu, Nxb. Y
học, 2002.
[2]. Dược phẩm OPC,
viewid=35&idloai=9&viewopt=text.
[3]. Dược phẩm TW 5 Danapha,
product&dtd=sub&id=185.
[4]. Ghosal S., Dutta S. K., Bhattacharya S. K., Erythrina – Chemical and Pharmacological
Evaluation II: Alkaloids of Erythrina variegata L. J. of Pharmaceutical Sciences, Vol.
61(8), (1972), 1274 – 1277.
[5]. Sarragiotto M. E. , Filho H. L., Marsaiolo A., Erysotrine-N-oxide and erythrartine-N-
oxide, two novel alkaloids from Erythrina mulungu, Can. J. Chem., 59, (1981), 2771 –
2775.
[6]. Soto-Hernandez M., Jackson Anthony H., Erythrina Alkaloids: Isolation and
Characterisation of Alkaloids from Seven Erythrina Species, Planta Med., 60, (1994),
175 – 177.
[7]. Bộ Y tế, Dược điển Việt Nam III, Nxb. Y học, 2002, 503-504.
[8]. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu, Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nxb.
Y học, 1985.
[9]. Chawla A. S., Kapoor V. K., Erythrina alkaloids, Handbook of Plant and Fungal
Toxicants, 1997, 37 – 46.

[10]. Arthur W., Craig R. Elevitch, Erythrina variegata (coral tree),
www.traditionaltree.org, 2004.

STUDY ON ISOLATION AND STRUCTURE IDENTIFICATION OF
ALKALOIDS IN FOLIUM EXTRACT OF ERYTHRINA ORIENTALIS L.
FABACEAE COLLECTED IN THUA THIEN HUE
Tran Thi Van Thi, Tran Thanh Minh
College of Sciences, Hue University
SUMMARY
The content of alkaloids of dry weight is 0,18% in folium of Erythrina orientalis L.
Fabaceae collected in Thua Thien Hue. There were ten alkaloids found in folium extract. Two of
them were isolated and identified by LC-MS, UV-VIS and
1
H-NMR. They were erythrartine and
erythrartine N- oxide. These alkaloids have not been defined in folium of Erythrina orientalis L.
Fabaceae in the past.