Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus ppt

. Qui trình ELISA trực tiếp dùng để xác định Staphylococcus Aureus:
Phương pháp trực tiếp Elisa đã được chứng minh là rất phổ biến để chuẩn đoán các bệnh truyền
nhiễm nhất như: ở người viêm gan siêu vi, HIV … và ở động vật như: viêm vú, nhiễm khuẩn xuất huyết…
(Nickerson và các cộng sự, 1989. Rehmant et al, 2002).
 Vật liệu và phương pháp:
+ Chuẩn bị các KN: S. aureus được nuôi cấy trên môi trường Staph.110 ủ ở 37
0
C trong 24h. Thu
chủng vi khuẩn với nước muối đệm phosphate (pH 6.8) có chứa formalin 0.3% và đun nóng ở 100
0
C trong
1h (Heddleston et al, 1972; Zia và cộng sự, 2000).
+ Sản xuất KT: ba con thỏ được tiêm dịch huyền phù nói trên ở dưới da với lượng 0.5;1;1.5 và 2ml
khoảng 4 ngày. Sau 7 ngày tiếp tục tiêm 1ml S.aureus được nuôi cấy trong môi trường canh thịt vào thỏ.
Sau đó 14 ngày tiêm môi trường giống như trên, thu nhận máu và huyết thanh khi giết thỏ (Relman và
cộng sự, 2002).
+ Tinh chế và ước lượng Protein: KT thỏ được phân lập và tinh khiết một phần thông qua phương
pháp kết tủa ammonium sulfate (Hudson và Hay, 1980) và hàm lượng protein đã được ước tinh bằng
phương pháp Biuret sau khi tiêu bản theo đường chuẩn của huyết thanh bò albumin (Zia và cộng sự,
2001).
+ Sự tiếp hợp: Enzyme peroxidase từ đậu tương (10mg) đã được tiếp hợp với một phần KT tinh
khiết của thỏ, sử dụng bước hai trong phương pháp glutaradehyde (Zia và cộng sự, 2000).
+ Lớp vỏ KT: 100µl KT thỏ (pha loãng 1/10 trong dung dịch đệm phủ) được đổ vào từng giếng,
polystyrene, tấm microtitration gồm 96 giếng ủ ở 4
0
C trong 24h. Sau đó, tấm được rửa năm lần với đệm
rửa. Các tấm được giữ cố định bởi 100µl PSB đổ vào từng giếng và ủ ở 37
0
C trong 24h. Sau khi ủ, tấm đã
được rửa sạch bằng đệm rửa (Horadagoda et al, 1993)
 Elisa trực tiếp:

+ Elisa trực tiếp được thực hiện để phát hiện KT tiếp hợp enzyme. Các tiếp hợp enzyme này pha
loãng trong PBS là 1:100; 1:200; 1:400 và 1: 800. 100µl PBS được thêm vào mỗi giếng. Huyết thanh thỏ
được pha loãng trong PBS ở tỷ lệ 1:10. + Đó là 2 lần tuần tự pha loãng từ 2 lên đến 11 giếng, như
100µl được thêm vào. Giếng 12 được sử dụng để kiểm soát. Các đĩa được ủ ở 37
0
C trong 2h. Sau đó rửa
lại 5 lần bằng dung dịch rửa. Tiếp tục pha loãng 100µl ở mỗi hàng, đầu tiên pha loãng A+B, thứ 2 là pha
loãng C+D, thứ 3 là pha loãng E+F, thứ 4 là Pha loãng G+H trên tấm microtitration. Ủ ở 37
0
C trong 2h.
Sau khi ủ rửa lại 5 lần bằng dung dịch rữa. Sau đó thêm 100µl guaiaclo (guaicol + H
2
O
2
) và ủ ở 37
0
C
trong 20 phút. Tiếp tục thêm 50µl H
2
SO
4
1M (thuốc dừng) vào mỗi giếng. O.D đã được ghi lại ngay lập
tức trong cùng vi đĩa đọc Elisa, đọc ở bước sóng 450nm (Kemney và Challacombe, 1989).
+ Phân tích thống kê: các dữ liệu được phân tích qua Duncan’s Multiple Range (DMR) kiểm tra
hoàn toàn theo thiết kế ngẫu nhiên (CRD) (Steel và Torrie,1984).
 Kết quả và thảo luận:
+ Các xét nghiệm huyết thanh khác nhau đã được sử dụng cho các KN phát hiện như là thử nghiệm
nhanh chóng làm ngưng kết, thử nghiệm agar gel phát hiện, nhưng tốt nhất là phương pháp ELISA để phát
hiện KN. Nề tảng của phương pháp ELISA là dựa trên sự thay đổi màu sắc, có lợi thế hơn các xét nghiệm
khác như ngưng kết, huỳnh quang hoặc phóng xạ trong phản ứng KN-KT có thể được đo đều đặn khách

quan trong sắc độ kế đơn giản. Ngoài ra, sử dụng các tấm microtitre ELISA cho phép một số lượng lớn
phản ứng để được đọc trong thời gian ngắn (Dawkins et al,1990).
+ Có nhiều enzyme khác nhau được sử dụng trong phương pháp ELISA nhưng peroxidase được
ưu tiên hơn những loại khác bởi sự tinh khiết, hoạt tính đặc hiệu, nhạy cảm của chất nền thăm dò, dễ tiếp
hợp, tính hiệu quả khi tiếp hợp và sự ổn định về sự tiếp hợp (Kemeny và Challacombe, 1989). Peroxidase
là một chất oxy hóa sinh học quan trọng và phổ biến trong các vật liệu từ thực vật. Trong thực vật thì nó
1
có mặt trong cà chua (Zia et al,2001), cải ngựa, đậu tương (Ambreen et al, 2001), khoai tây, củ cải, cà rốt,
lúa mì, lê, chuối (Reed và cộng sự, 1975).
+ Peroxidase được chiết xuất từ đậu tương do tính hoạt động cao và dễ dàng tìm, kiếm. Hoạt động
của peroxidase thô đã được chứng tỏ 146.12U/ml. Đậu tương là một nguồn phong phú của peroxidase
được báo cáo bởi Ambreen et al, 2000. Sau đó peroxidase một phần được tinh khiết bằng cách sử dụng
phương pháp làm kết tủa ammonium sulfate. Kỹ thuật này sử dụng vì nó phổ biến nhất, sử dụng thuốc thử
có muối trong các protein, độ hòa tan cao và độ phân giải ion cao (Voet et al, 1999). KT được sản xuất
bằng cách tiêm các KN S. aureus vào thỏ và sử dụng phương pháp kết tủa ammonium (Hudson và Hay,
1980). Lượng protein đã được ước tính bằng cách sử dụng phương pháp biuret cũng như phương pháp
U.V. và kết quả của hai phương pháp đã được ghi trong bảng .
Bảng : Dự đoán protein của mẫu thỏ:
Sample Biuret Method (mg/ml) UV Method (mg/ml)
A 1.6 1.544
B 1.024 0.917
C 1.0791 0.932
+ Có nhiều phương pháp khác nhau để tiếp hợp giống như phương pháp meleimide, phương pháp
oxy hóa preiodate, bước một của phương pháp glutaraldehyde và bước hai của phương pháp
glutaraldehyde nhưng bước hai được ưa chuộng hơn các phương pháp khác vì kết quả của việc tiếp hợp áp
dụng hai phương pháp glutaraldehyde, cho kết quả đáng tin cậy và hiệu quả hơn (Baker, 1989). Kháng thể
được kết hợp với 10mg của peroxidase và sự kết hợp đã được thử nghiệm thông qua ELISA trực tiếp. Các
kết quả chỉ ra rằng trong pha loãng 1:100 của OD mẫu A dao động từ 1,18-0,972. Trong 1:200 OD pha
loãng trong khoảng 0,97-0,93. Trong 1:400 giá trị OD dao động 0,714-0,72. Trong 1:800 giá trị pha loãng
được hấp thụ là 0,5-0,6.

+ Trong trường hợp mẫu B, pha loãng ở 1:100 OD từ 1,406-1,205 trong khi pha loãng ở 1:200 OD
dao động từ 1,185-1,103. Trong 1:400 OD dao động từ 0,714-0,72. Trong 1:800 giá trị pha loãng được
hấp thụ từ 0,99-0,93.
Mẫu C, tỷ lệ 1:100 OD pha loãng từ 1,74-1,61. Trong pha lõang 1:200 OD từ 1,36-1,23.
+ Trong 1:400 OD từ 1,21-1,40. Trong 1:800 giá trị pha loãng hấp thụ là 1,26-1,39.
Có một sự giảm đáng kể của mẫu về giá trị OD ở độ pha loãng 1:100 so với dung dịch pha loãng 1:200,
1:400 và 1:800 là pha loãng 1:100 cho kết quả tốt nhất.
+ Kết luận và kiến nghị: 1:100 là tôt nhất cho ELISA trực tiếp chống lại S.aureus. Kết luận tương
tự đã được rút ra khi thống kê phân tích thông qua thử nghiệm DRM theo thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên
2