ỨNG DỤNG ENZYME TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH docx

Định nghĩa elisa
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA
(Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện
kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm.
Kháng nguyên – kháng thể
Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động
hệ miễn dịch và gây một phản ứng miễn dịch. Kháng nguyên
bao gồm protein lạ, acid nucleic, một số lipide và
polysaccharide. Chưa biết gắn trên bề mặt.
Kháng thể (antibody) tạo thành phần gramma globulin trong
các protein máu. Kháng thể là những protein hòa tan do các tế
bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng với một kháng nguyên
và chúng có thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đó
Nguyên lý của phương pháp ELISA chính là dựa
vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể
Thêm vào một cơ chất (substance) của enzyme
đó. Enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín
hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ
được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng
thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên –
kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra
Các bước tiến hành
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một KT đặc
hiệu cho KN chưa biết. Thông thường KN được cố
định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene
microtiter plate).
- Phương thức cố đinh không đặc hiệu: KN gắn trực
tiếp vào bề mặt của đĩa
- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): KN

được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng
nguyên cần kiểm tra
KT đặc hiệu cho KN chưa biết.
Đo OD
tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất
sẽ giúp phát hiện KN cần kiểm tra.
Phương thức gắn đặc hiệu :
KN được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra
Phương thức cố đinh không đặc hiệu:
KN gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa
Kết quả
Nếu KT được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang
học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện
KN cần kiểm tra.
Trong trường hợp sử dụng KT thứ cấp (secondary
antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết
cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học
(bioconjugation),
KN cần xác định sẽ được nhận biết qua KT thứ cấp
này.
Enzyme sử dụng thường là :
+ Peroxidase
+ Beta – galactoxidase
+ Alkaline phosphatase
Cơ chất (subtrate) là:
+ ODP: là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm có màu
vàng nhận bước sóng 492 nm ( bằng máy đọc elisa)
+ TMB: là cơ chất mà enzyme biến đổi tạo sản phẩm có màu
xanh bước sóng 370-652nm chuyển màu vàng 450nm
Enzyme sử dụng trong phương pháp elisa

Enzyme ở đây được sử dụng để xác định hỗn hợp kháng
nguyên – kháng thể , tạo thành trong phản ứng miễn dịch. Ta
có thể sử dụng máy so màu quang điện, huỳnh quang để xác
định phản ứng.
Enzyme alkaline phosphate
Enzyme này được sử dụng trong phản ứng miễn dịch.
Người ta thường sử dụng enzyme này với hoạt tính
2500UI/mg, ở nhiệt độ 37
o
C.
Để xác định hoạt tính alkaline phosphate có thể sử dụng
máy huỳnh quang với 4 – methylumbeliferyphosphate làm
cơ chất
ß-
galactosidase
Người ta thường sử dụng enzyme này có hoạt tính riêng lớn
hơn 250UI/mg với cơ chất là 4-nitrophenyl- ß-galactosidase, ở
37
o
C
Hoạt tính của ß-galactosidase được đo bằng máy quang điện
với 4-methylumbelliferyl- ß-galactosidase. Ngoài ra ta có thể
sử dụng 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ß-galactosidase
Horseral
peroxidase
Enzyme này chứa hai đến ba nhóm hoạt động amine trong
phân tử và chứa 12-14.5% carbohydrate. Xác định hoạt tính
enzyme này bằng máy quang điện. cơ chất thường sử dụng là
chromogen-2,2’-azinobis [3-ethylbenzothiazoline-sulfonate]
(ABTS) và peroxidase có hoạt tính riêng là 1000u/c ở 25

o
C
Trong miễn dịch người ta thường sử dụng cơ chất là 3,3’;5,5’-
tetramethyl benzidine
Thiết bị sử dụng
Khay nhựa 96 giếng
Thiết bị sử dụng
Máy đọc elisa (máy quang phổ có các bước sóng khác nhau
Thiết bị sử dụng
Micropipette
Micropipette tips
Thiết bị sử dụng
Máy rửa khay nhựa
Micropipette multi tips
Ưu điểm phương pháp elisa
+Dễ thực hiện
+ Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu
+ Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgE
Nhược điểm
+ Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h)
+ Thiết bị mắc tiền
ELISA TRỰC TiẾP
Cố định các kháng nguyên chưa biết vào các giếng
Thêm kháng thể có gắn enzyme
“Rửa”
“Rửa”
Bước “blockin”
Thêm cơ chất
Ghi nhận sự thay đổi
( màu, huỳnh quang, OD…)

1. Elisa trực tiếp
Phát hiện trực tiếp: KN virus, axit nucleic
hoặcVirus.
Áp dụng:
- Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra
từ mẹ nhiễm HIV.
- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai
đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện KT
không rõ ràng.
- Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều
trị thuốc kháng virút và trong các mục đích
nghiên cứu khác.
2.Elisa gián tiếp
Cố định các kháng nguyên chưa biết vào các giếng
Thêm kháng thể thứ cấp
“Rửa”
“Rửa”
Bước “blockin”
Thêm cơ chất
Ghi nhận sự thay đổi
( màu, huỳnh quang, OD…)
2. Elisa gián tiếp
Độ nhạy cao huyết thanh cần thử ủ với bản nhựa đã gắn kháng
nguyên, sau khi rửa để loại kháng thể thừa, không đặc hiệu,
lại tiếp tục ủ với kháng thể kháng globulinngười gắn
Enzym. Hoạt tính Enzym sẽ biến cơ chất không màu thành
một sản phẩm có màu. Phản ứng màu được nhận định sơ bộ
bằng mắt thường và đọc chính xác bằng quang kế.
3. Sandwich Elisa