So sánh hoạt độ của một số Enzym bảo vệ tổn thương oxi hóa và phổ băng ADN

SO SÁNH HOẠT ĐỘ CỦA MỘT SỐ ENZYM BẢO VỆ
TỔN THƯƠNG OXY HOÁ VÀ PHỔ BĂNG ADN
CỦA ỐC BRADYBAENA SIMILARIS THU THẬP Ở
MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN TỈNH ĐỒNG NAI

Đặng Quang Hưng, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn
Nghĩa
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

1. MỞ ĐẦU

Các tác nhân oxy hoá như peroxit hydro, các gốc tự do
superoxit (O
2
.
-
), gốc hydroxyl (OH.) luôn được hình thành
trong các hoạt động sống của các cơ thể sinh cũng như
trong quá trình tương tác của sinh vật với môi trường.
Chính những tác nhân này là nguyên nhân gây ra các tổn
thương oxy hoá [5]. Để chống lại tác dụng tổn thương của
các tác nhân này, sinh vật đã hình thành các cơ chế bảo vệ
khác nhau, trong đó chủ yếu dựa vào các enzym có hoạt
tính phân huỷ các hợp chất oxy hoá như là superoxit
dismutase (SOD) triệt tiêu gốc superoxit hay NADH
oxidase (NOX), catalase (CAT), alkyl hydroperoxide,
glutathion reductase có tác dụng phân huỷ peroxit
hydro...Chính vì vậy, nghiên cứu các enzym này sẽ là cơ sở
để tìm hiểu sự đáp ứng của cơ thể với các tác nhân oxy hoá
khác nhau bao gồm các tác nhân nội sinh cũng như ngoại
sinh.

Bài báo này trình bày các kết quả nghiên cứu bước đầu về
việc so sánh hoạt độ của enzym SOD, CAT, NOX, phổ
băng protein và ADN của loài ốc Bradybaeana similaris
thu thập từ hai vùng Mã Đà và Cát Tiên (tỉnh Đồng Nai),
đặt cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo về sự tác động của
môi trường lên cơ thể.

2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU

Nguyên liệu.

Loài ốc Bradybaena similaris (Ferussae) được thu thập ở
Mã Đà và Cát Tiên thuộc tỉnh Đồng Nai, được PGS. TS.
Nguyễn Xuân Quýnh định tên khoa học. Mẫu vật được giữ
sống hoặc giữ ở –80
o
C cho đến khi phân tích.

Mồi dùng cho phân tích phổ băng RAPD bao gồm: OPA4
(5'-AATCGGGCTG), OPA10 (5'-CAGGCCCTTC),
OPA12 (5'-GGGCGGTACT) và thang chuẩn ADN được
đặt từ hãng Invitrogen (Mỹ). Xanthine, xanthine oxidase,
nitro tetrazolium blue (NTB) và riboflavin được mua từ
hãng Sigma (Mỹ), các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh sạch
dùng cho phân tích.

Phương pháp nghiên cứu:

Dịch chiết mẫu ốc được chuẩn bị bằng cách loại bỏ vỏ,
cắt lấy phần cơ và nghiền trong cối sứ ở 4
o
C với tỷ lệ 1g
nguyên liệu: 10 ml đệm chiết (Tris-HCl 100mM, pH 7 chứa
KCl 50mM). Mẫu sau khi nghiền được ly tâm ở tốc độ
10.000 vòng/phút ở 4
o
C trong10 phút để thu dịch trong
dùng cho phân tích protein và hoạt độ enzym.

ADN của ốc được tách chiết theo phương pháp được
mô tả trong [14] sau đó được hoà tan trở lại trong đệm TE
(Tris-HCl, 10 mM, pH 8 có chứa 2 mM EDTA)

Protein được xác định theo phương pháp của Lowry [8],
dùng albumin huyết thanh bò làm chất chuẩn.

Hoạt độ SOD được xác định theo phương pháp Mc Cord
và Fredovich [11].

Điện di trên gel polyacrylamit được tiến hành theo
phương pháp của Laemmli [7].

Phổ băng SOD được xác định theo phương pháp của
Beauchamp và Fredovich [4].

Hoạt độ NOX được xác định theo phương pháp Poole
& Clairborne [15].

Hoạt độ catalase được xác định theo phương pháp của
Thibodeau và cộng sự [17] và Mottola và cộng sự [12].

Phản ứng RAPD-PCR

Hỗn hợp phản ứng RAPD (25l ) có chứa 0,2mM mỗi loại
dNTPs, 1l mồi (20 pmol) và 2,5 l10X đệm phản ứng (có
25mM MgCl
2
) và 2,5 đơn vị Taq ADN polymerase. Giai
đoạn biến tính được thực hiện ở 95
o
C trong 3 phút; tiếp
theo 45 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm các bước thay đổi nhiệt độ
và thời gian: 94
o
C-30 giây; 36
o
C- 45 giây;72
o
C-1 phút tiếp
theo là ử ở 72
o
C trong 7 phút. Sản phẩm RAPD được điện
di trên gel agarose 1%, nhuộm với ethidium bromide, soi
dưới đèn UV và chụp ảnh.

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. So sánh hoạt độ SOD, NOX, CAT của ốc Bradybaena

similaris thu thập từ Mã Đà (BSMĐ) và Cát Tiên (BSCT).

1.1 Hoạt độ SOD của ốc BSMĐ và BSCT

Hình 1: Hoạt độ SOD tổng số của ốc BSMĐ và BSCT.

A: Hoạt độ tính theo mg chất khô, B: Hoạt độ tính theo mg
protein.

Kết quả phân tích hoạt độ SOD của mẫu ốc ở hình 1 cho
thấy hoạt độ SOD của ốc B. similaris ở Mã Đà (BSMĐ) là
khoảng 22 đv/mg chất khô còn ở Cát Tiên (BSCT) là
khoảng 40 đv/mg chất khô và hoạt độ riêng (HĐR) tương
ứng là 1100 đv/mg protein và 2600 đv/mg protein. Như vậy
hoạt độ SOD của BSMĐ là cao hơn so với của BSCT là 1,8
lần.

Kết quả nghiên cứu phổ băng SOD (hình 2) cho thấy hai
mẫu ốc BSMĐ và BSCT đều có phổ băng như nhau với 1
băng rõ nét có Rf 0,13 và một vùng sáng có thể chứa vài
băng SOD với Rf nằm trong khoảng 0,23 - 0,25. Như vậy,
sự khác biệt về hoạt độ SOD của ốc BSMĐ và BSCT ở trên
không liên quan đến số lượng SOD của chúng có mặt trong
mẫu phân tích.

Hình 2: Phổ băng SOD của ốc BSMĐ và BSCT (A:
BSMĐ, B: BSCT)


SOD là nhóm enzym có cofactơ là ion kim loại [5,11]. Để

sơ bộ tìm hiểu ion kim loại có mặt trong SOD của ốc
Bradybaena similaris, chúng tôi đã tiến hành thẩm tích dịch
chiết mẫu trong đệm có chứa EDTA nhằm loại bỏ các ion
kim loại ra khỏi enzym của mẫu nghiên cứu, sau đó tiến
hành xác định hoạt độ SOD với sự bổ sung các ion kim loại
khác nhau. Kết quả thu được ở hình 3 cho thấy quá trình
thẩm tích đã không làm mất hoàn toàn hoạt độ SOD của
mẫu ốc BSMĐ cũng như BSCT. Tuy vậy, trong số 4 loại
ion kim loại hoá trị 2 (Ni
2+
, Mn
2+
, Fe
2+
, Zn
2+
) được bổ sung
vào hỗn hợp phản ứng thì chỉ Fe
2+
có khả năng làm tăng
một phần hoạt độ SOD (khoảng 5%) của BSMĐ cũng như
của BSCT. Việc bổ sung các ion kim loại khác có tác dụng
kìm hãm một phần hoạt độ SOD của BSMĐ và BSCT. Có
thể SOD của BSMĐ và BSCT đều cần Fe
2+
cho hoạt động
xúc tác của SOD và SOD của chúng có thể thuộc nhóm
FeSOD.

Hình 3: Ảnh hưởng của ion kim loại lên SOD của ốc

BSMĐ và BSCT


Kết quả phân tích độ bền của SOD trong mẫu ốc BSMĐ và
BSCT với nhiệt (hình 4) cho thấy SOD của cả hai mẫu
nghiên cứu đều không bền với nhiệt. Sau khi xử lý nhiệt ở
80
o
C trong 15 phút, hoạt độ SOD của cả hai mẫu ốc BSMĐ
và BSCT đều bị mất hoàn toàn và không có sự sai khác
đáng kể về mức độ bền với nhiệt giữa hai mẫu nghiên cứu.

Hình 4: Độ bền với nhiệt của SOD của ốc BSMĐ và BSCT


Hình 5: Hoạt độ NOX của ốc BSMĐ và BSCT
A: Hoạt độ tính mg chất khô, B: Hoạt độ tính theo mg
protein.