Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men rhodotorula sp trên môi trường bán rắn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÌNH DƯƠNG










KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN CNSH




ĐỀ TÀI:


KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM
MEN RHODOTOR ULA SP TRÊN
MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN

GVHD: Th.S NGUYỄN MINH KHANG
Th.S TRƯƠNG HUỲNH HUY




SVTH: NGUYỄN THANH TRÚC








BÌNH DƯƠNG – 2009
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội ngày càng phát triển kéo theo sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật. Công nghệ sinh học
đã và đang trở thành một trong những ngành được quan tâm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói
riêng. Công nghệ sinh học phát triển nhanh chóng đang tạo ra một cuộc cách mạng sinh học trong các ngành
nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất trong các ngành y dược, năng lượng
khai khoáng và bảo vệ môi trường.
Đối với Việt Nam, một đất nước nông nghiệp việc ứng dụng xử lý và tái chế các nguồn phế phụ phẩm từ
động vật và thực vật trong các ngành sản xuất nông nghiệp và công nghệ thực phẩm, biến đổi những nguồn
nguyên liệu rẻ tiền để tạo ra những sản phẩm có chất lượng cao, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường mang lại
hiệu quả kinh tế cho xã hội.
Vitamin A có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người và vật nuôi. Nguồn nguyên liệu thực vật và
vi sinh vật được xem là các nguồn cung cấp dồi dào sắc tố carotenoid nói chung và tiền vitamin A nói riêng. Và

một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp được sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta-caroten
đó là Rhodotorula sp.
Beta-caroten một hợp chất có hoạt tính sinh học cao có vai trò quan trọng đối với con người và động vật.
Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng tỷ lệ beta-caroten trong thức ăn gắn liền với việc giảm nguy cơ của
nhiều căn bệnh ung thư, trẻ hóa làn da, giảm tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch,… Với những lợi ích như vậy, ứng
dụng quá trình lên men bán rắn từ những phụ phẩm dồi dào và rẻ tiền của các ngành như công nghiệp thực
phẩm, nông nghiệp,… Đây cũng chính là mục tiêu của đề tài “Khảo sát điều kiện nuôi cấy nấm men
Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn”.
1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Lựa chọn ra môi trường bán rắn thích hợp nhất cho việc nuôi cấy nấm men đỏ Rhodotorula sp.
- Tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy.
- Thử nghiệm sản xuất và kiểm tra hàm lượng beta-caroten trong chế phẩm từ nấm men đỏ Rhodotorula sp
trên môi trường tối ưu.
1.3 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI
Khảo sát những điều kiện tối ưu cho sự phát triển của nấm men đỏ Rhodotorula sp trên môi trường bán
rắn thông qua việc tận dụng các nguồn nguyên vật liệu phụ phẩm rẻ tiền từ các ngành nông nghiệp, công
nghiệp, công nghiệp thực phẩm,… để thu được lượng sinh khối cao nhất.
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN
2.1.1 Tổng quan về nấm men [2], [6], [7], [12]
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản vô tính theo lối
nảy chồi. Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi
(Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm (Basidiomycota).
Nấm men phân bố hết sức rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực phẩm, rau quả,… Đặc biệt
chúng hiện diện nhiều ở các môi trường chứa đường, pH thấp: đất trồng nho và cây ăn quả.
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin và lipid. Vì vậy chúng được
sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến rượu trắng, rượu vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người và gia
súc, làm nở bột mì, gây hương nước chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên
nhiên, sản xuất riboflavin (vitamin B2), Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm men có

thể gây bệnh (Candida, Mycoderma).
2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men [3], [7]
· Hình dạng nấm men [7]
Nấm men thường có cấu tạo đơn bào. Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi tùy theo loài, ngoài ra
một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh, điều kiện nuôi cấy. Nói chung nấm men thường
có hình trứng, bầu dục (Saccharomyces serevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình oval hoặc elip, hình ống
(Pychia), hình trụ, hình quả chanh, hình tam giác,…và một số hình dạng đặc biệt. Hình dạng của nấm men hầu
như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy.
Ngoài ra một số loài nấm men có tế bào hình que nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty hoặc khuẩn
ty giả, thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon.
· Kích thước tế bào nấm men [7]
Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài, hay tuổi sinh lý. Nói chung
thường to hơn tế bào vi khuẩn từ 5 ÷ 10 lần. Kích thước trung bình của tế bào nấm men.
· Chiều dài: 9 ÷ 10 μm.
· Chiều rộng: 2 ÷ 7 μm.
Các loài nấm men đơn bào trong công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 μm. x 5- 10 μm.
2.1.3 Dinh dưỡng nấm men
· Thành phần hóa học của tế bào nấm men [12]
Thành phần cơ bản và chủ yếu là nước (nước liên kết và nước tự do) - khoảng 75% khối lượng chung.
Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau (%):
- Chất hữu cơ: 5 – 10
- Cacbon: 25 – 50
- Nitơ: 4.8 – 12
- Protein ( N x 6.25): 30 – 75
- Lipid: 2 – 5
Chất khô của tế bào nấm men gồm có 23 – 28 % là chất hữu cơ và 5 – 7 % chất tro.
Chất hữu cơ gồm có (%): Protein 13 -14 %, glucogen 6 – 8 %, xenluloza 1,8 -2 %, chất béo 0,5 – 2 %.
· Dinh dưỡng nấm men [12]
Dinh dưỡng nấm men thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng. Đó là dinh dưỡng ngoại bào và dinh dưỡng
nội bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên

ngoài. Khi tế bào ở trạng thái đối với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất
dự trữ nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được sử dụng – dinh dưỡng nội bào.
Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục vụ cho sinh trưởng hoặc
là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào.
· Dinh dưỡng cacbon [12], [4]
Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm men bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác nhau như đường, rượu,
acid hữu cơ, acid amin,…. Hầu hết các loài nấm men đều không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase
và cellulase. Vì vậy, nấm men không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose.
Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm men sử dụng đặc biệt là đường glucose
thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các loài nấm men. Glucose được coi như nguồn
carbon vạn năng đối với vi sinh vật.
Tỷ số đường sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài nấm men. Đối với các nguồn carbon khác như rượu
và acid hữu cơ thì đặc điểm này là giống nhau ở tất cả các loài nấm men. Các loài Saccharomyces lên men rượu
vang sử dụng glucose, fructose, maltose, saccharose và galactose, với rafinose chỉ sử dụng được một phần. Với
lactose, melibiose, dextrin, pentose và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được.
Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men
sinh trưởng tốt sẽ được ưu tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế tiếp các nguồn carbon trong canh trường được
gọi là tính đa dưỡng của nấm men. Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết.
Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất như nhau. Các loài khác
nhau (dù là một giống) sẽ đồng hóa các nguồn dinh dưỡng khác nhau.
Những disaccharide (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ
thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men. Các acid hữu cơ cũng chiếm một vị trí quan trọng trong
trao đổi chất của nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men. Chúng cũng có thể
là nguồn dinh dưỡng carbon và năng lượng duy nhất.
Các acid béo có mạch carbon tương đối dài (từ 6 ÷ 10) nấm men chỉ sử dụng ở nồng độ trong môi trường
rất thấp (0,02 ÷ 0,05 %). Ở nồng độ cao sẽ ức chế nấm men phát triển. Acid béo có từ C12 ÷ C17 carbon trong
phân tử được sử dụng tùy thuộc vào từng chủng loại nấm men.
· Dinh dưỡng nitơ [12], [4]
Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi
trường.

Thông thường, nitơ của tế bào nấm men thường vào khoảng 7 ÷ 10 %, đôi khi lên tới 12% vật chất khô.
Để tạo thành 10 tỷ tế bào nấm men chi phí nitơ trong điều kiện kị khí là 66 ÷ 67 mgN, trong điều kiện hiếu khí
là 37 ÷ 53 mgN. Tuy nhiên hàm lượng nitơ trong nấm men phụ thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện hiếu
khí và số lượng các chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường đối với từng chủng nấm men.
Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và pyrimidin, protein và
một số vitamin.
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng như hữu cơ. Đó là
các muối amoni sunfat, amoni phosphat rồi đến các muối amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat và amoni
sucxinat. Trong môi trường có muối amoni đặc biệt là sunfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid
còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng do vậy có thể làm môi trường acid hóa, giảm pH.
Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptid, các nucleic, Trong thực tế người ta
hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc, ) làm nguồn nitơ hữu cơ.
Xếp theo thứ tự nấm men tiêu hóa tốt nhất là các muối amon, tiếp theo là các acid amin, sử dụng pepton
kém và hoàn toàn không sử dụng được protein. Trong quá trình nuôi cấy nấm men các acid amin vừa là nguồn
nitơ vừa là nguồn carbon dinh dưỡng. Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành các acid
amin mới như là chất cho nhóm amin (NH
2
-).
· Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ [12], [4]
Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men thì phospho được quan
tâm trước hết, sau đó là kali, magiê và lưu huỳnh,….
Phospho: tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các nucleoproteic, acid nucleic,
polyphosphate, phospholipid,…. Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác
nhau, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng. Nấm men sử dụng rất tốt
nguồn phospho vô cơ là orthophosphate. Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau khi được hoạt hóa
sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp.
Khi không đủ phospho trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi đáng kể liên quan tới sự
phá vỡ nhu cầu sử dụng hydratcacbon và nitơ. Nhu cầu sinh lý về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào
khoảng 10 ÷ 13 mgP.
Người ta thường dùng KH

2
PO
4
, K
2
HPO
4
hoặc dung dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P và K.
Trong dịch đường hóa từ tinh bột thường đủ P đáp ứng nhu cầu của nấm men, rỉ đường củ cải cũng như rỉ
đường mía thường thiếu P, vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường acid orthophosphoric hoặc supephosphat.
Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm phụ (-SH) của một số
enzyme CoA. Bởi vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp
được protein. Những chất chứa lưu huỳnh như acid amin (cystine, cysteine, metionine), vitamin (tiamin, biotin)
và một số hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men. Trong môi trường nuôi cấy
nấm men thường có (NH
4
)
2
SO
4
làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh. Trong môi trường với hàm lượng lưu
huỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men. Nhưng ở nồng độ 1mg/l lưu huỳnh đã kìm hãm quá trình này. Do
vậy, khi sử dụng các nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, cần phải
thận trọng.
· Các ion K
+
, Ca
2+,
Mg
2+

cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men. Thông thường ion K
+
được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, ion Ca
2+,
Mg
2+
thường có mặt trong nước sinh hoạt,
tuy nhiên khi hàm lượng ion Ca
2+,
Mg
2+
quá cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion này (làm mềm nước).
Giúp cho quá trình nuôi cấy vi sinh vật hiệu quả hơn.
· Dinh dưỡng các chất sinh trưởng [12], [4]
Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin và pyrimidin. Những nhân tố sinh trưởng
cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (B8), biotin (B7 hay H), acid pantotenic
(B3), tiamin (B1), pyridoxine (B6), acid nicotinic (B5 hay PP). Đối với nấm men có sắc tố đỏ cần các chất sinh
trưởng là tiamin, ngoài ra còn có acid paraaminobenzic.
Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có thể dùng dịch men tự
phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme
và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp bionin). Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ở
quy mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai tây,…làm nguồn
vitamin bổ sung vào môi trường.
2 NẤM MEN RHODOTORULA SP
2.2.1 Phân loại [20]
Theo phân loại Harison (1927) nấm men Rhodotorula sp thuộc:
· Giới: Nấm (fungi)
· Ngành: Basidiomycota
· Lớp: Urediniomycetes
· Bộ: Sporidiales

· Họ: Sporidiobolaceae
· Giống: Rhodotorula
Hình 2.1. Nấm men Rhodotorula sp [20], [21]
Hình 2.2. Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [19]
Nấm men Rhodotorula sp còn được gọi là nấm men sinh sắc
tố carotenoid (carotengensis), là một trong rất ít các chi nấm men
có khả năng tổng hợp tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene,
torularhodin.
Năm 1921, A. Harden là người đầu tiên phân lập được loài Rhodotorula mucilaginose, tiếp sau đó năm
1928 Harison và nhiều nhà khoa học khác đã phân lập được 34 loài, trong đó phổ biến nhất là 3 loài
Rhodotorula glutinus, Rh. Mucilaginosa và Rhodotorula gracilis. Năm 2000, Krutzman và Fell cho rằng giống
nấm men Rhodotorula sp gồm 45 loài, theo mô tả của tác giả cho rằng loài Rh. mucilaginosa trước đó có tên gọi
là Rh. rubra, loài này tạo ra enzyme urease, không đồng hoá nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc
nhiệt độ 40
o
C và loài Rh. rubra thực ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh. glutinis, tên gọi Rh. ruba ở một số tài
liệu hiện nay không còn nữa và được thay thế bằng tên mới là Rh. mucilaginosa. [10] [11]
Riêng tác giả người Nhật Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố carotenoide để chia giống nấm
men Rhodotorula sp thành hai giống phụ là: Rhodotorula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 610nm) và Flavotorrula
(hấp thụ tối đa ở bước sóng 450nm).
Theo Lodder (1971), Koneman E.W. và Robert (1983), thì Rhodotorula sp thuộc cơ thể đơn bào, nhóm
nấm men không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ty hay sợi khuẩn ty giả và là nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng
nhiệt độ hoạt động từ 20 - 40
0
C.Chúng phân bố rộng rãi ở khắp nơi: trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây:
táo, dưa hấu, dâu tây, dâm bụt,…
Khi quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm men Rhodotorula sp có dạng hình tròn, oval, elip đến dạng thon
dài hoặc gậy. Kích thước tế bào dao động trong khoảng 2 ÷ 5 μm chiều rộng, 2,5 – 10 μm chiều dài tùy thuộc
vào điều kiện nuôi cấy và độ tuổi.
Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi ghồ ghề, mịn và nhớt. Mép

khuẩn lạc không có răng cưa. Khuẩn lạc có màu từ kem, hồng đến đỏ san hô cũng có khi có màu vàng và đỏ
cam. Kích thước khuẩn lạc tuỳ môi trường, có thể đạt từ 1 – 10 mm. Quan sát dưới kính hiển vi không hình
thành sợi nấm, một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi.[4]
2.2.2 Hình dạng và kích thước [3], [4], [12]
Rhodotorula sp có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và loài khác nhau. Gồm
hình trứng, hình dài, hình elip, hình cầu, tròn và hình gậy. Rhodotorula sp có khuẩn lạc trơn, không nhăn, có
màu từ kem đến vàng hoặc đỏ.
Sinh trưởng sinh dưỡng: khuẩn lạc màu cam đến màu đỏ, vàng, dạng bơ hoặc nhầy.
Tế bào hình cầu, gần cầu, elip, trứng hoặc trứng kéo dài, thường nảy chồi ở đỉnh. Có thể xuất hiện sợi giả
và sợi thật.
Bảng 2.1 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula sp nuôi cấy trên môi trường thạch malt từ các
nguồn phân lập khác nhau [4]
STT Loài Màu khuẩn lạc Hình dạng Nguồn phân lập
1 Rh. Acheniorum
Hồng Dài Quả dâu, lá lê
2
Rh. Araucariae Hồng Tròn cầu Gỗ cây bách tán
3
Rh. Aurantiaca Hồng hoặc đỏ Dài Không khí, bia,
đất
4
Rh. Bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy
5
Rh. Diffluens Kem Tròn cầu,
elip
6
Rh. Fujisanense Kem hoặc hồng Gậy Cây nho dại
7
Rh. Glutinis Hồng hoặc đỏ Tròn cầu
8

Rh. Graminis Hồng Tròn cầu
9
Rh. Ingeniosa Kem Tròn cầu
10
Rh. Javanica Kem Dài
11
Rh. Lactosa Vàng, hồng hoặc
đỏ
Tròn cầu Không khí
12
Rh. Marina Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Con tôm
13
Rh. Minuta Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí, biển
14
Rh. Mucilaginosa
(rubra)
Kem, hồng hoặc
đỏ
Dài Nước, không khí,
…
15
Rh. Muscorum Kem hoặc nâu Gậy
nhạt
16
Rh. Pallida Kem hoặc hồng Tròn cầu Nước biển, dưa
leo ngâm
17
Rh. Pilatii Kem Tròn cầu Cây tùng bách
18 Rh. Pilimanae
Hồng hoặc đỏ

Tròn cầu
Nước, đất
2.2.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula sp [11]
2.2.3.1 Cấu tạo
Các nghiên cứu cho thấy, nấm men Rhodotorula sp có hình thái và cấu tạo tế bào giống như các loài nấm
men khác, được cấu tạo từ các thành phần.
a. Thành tế bào
Được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đáng kể nhất là: glucan, manan, protein, lipit và một
số thành phần nhỏ như kitin.
· Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucoza. Đó là một polysacharit phân nhánh có liên kết β-1,3 và
β-1,6. Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành tế bào.
· Manan: là hợp chất cao phân tử của D-manoza, mỗi phân tử thường chứa 200 - 400 thành phần manoza.
Thường manan liên kết với protit theo tỷ lệ 2:1. Manan thường có mối liên kết α-1,6; α-1,3; β-1,3. Phân
tử lượng của chúng khoảng 5.10
4
.
· Protein: thường protein liên kết với các thành phần khác như là manan. Trong thành phần của chúng
chứa nhiều axit amin. Phân bố ở màng tế bào, gần sát bào tương.
· Kitin: nằm ở phần nẩy chồi. Chúng chiếm số lượng rất nhỏ khoảng 3%. Đầu là chất bền vững không bị
enzym phá hủy, vì thế chúng có tác dụng bảo vệ chồi còn non.
· Ngoài ra còn thấy trong thành tế bào có lipit ở dạng phospholipit, khoảng 1% - 10 %.
b. Màng nguyên chất
Màng nguyên sinh gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzym permerase.
Trong thời kì còn non màng nguyên sinh chất bám sát lấy thành tế bào làm cho khả năng trao đổi chất của
nấm men gặp khó khăn. Ngược lại ở thời kì tế bào già màng nguyên sinh chất co lại, tạo thành khoảng trống
giữa tế bào và chất nguyên sinh vì thế mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn. Hai hiện tượng
này được gọi là co nguyên sinh và trương nguyên sinh chất.
c. Nguyên sinh chất
Tế bào còn non thì nguyên sinh chất càng đồng nhất, càng về già càng mất tính đồng nhất do xuất hiện
nhiều không bào và hạt voluten. Thành phần bao gồm: nước, protit, lipit, gluxit, muối khoáng và enzym. Tế bào

chất luôn luôn chuyển động, thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào.
d. Nhân
Ở Rhodotorula sp đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu. Nó được bao bọc bởi lớp màng bên
trong là lớp dịch nhân. Nhân thường có hình bầu dục và hình cầu. Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấm
men có chứa protein và acid nucleic. Ở trạng thái lên men nhân tăng 20 - 30 lần so với ở trạng thái hô hấp.
e. Các thành phần khác
- Không bào: là nơi chứa đựng protease.
- Hạt không bào: thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào, nguồn năng lượng cho tế
bào, tham gia điều hoà các quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào.
- Ty thể: cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào.
- Riboxom: tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men.
- Volutin: không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những điều kiện đặc biệt như khi
nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phoshat vô cơ. Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C : N và
sự có mặt của S cũng như của vitamin. Volutin đóng vai trò quan trọng sau:
+ Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào.
+ Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào.
+ Làm nguồn năng lượng cho tế bào.
2.2.3.2 Sinh sản [3], [4], [11]
Đa số loài của nấm men Rhodotorula sp sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh. pilimanae, Rh. pilatii, Rh.
javaniti, Rh. ingniosa, Rh. diffluens và Rh. bogoriensis. Ngoài ra, Rhodotorula sp còn sinh sản theo kiểu phân
đôi nhưng giống Rhodotorula sp không có kiểu sinh sản theo hữu tính.
a. Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi
Đầu tiên hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính giữa. Tế bào mẹ bắt đầu phát
triển một chồi con. Hạch một phần chuyển vào chồi và một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển
sang chồi con. Khi chồi con gần bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập. Đây là phương pháp sinh sản
vô tính chủ yếu nhất ở nấm men.
b. Sinh sản bằng hình thức phân đôi
Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ dần tới khi đứt hẳn và
tạo thành hai tế bào con độc lập. Hai tế bào con này giống hệt nhau và đều mang một nửa vật chất di truyền của
tế bào mẹ.

Tốc độ sinh sản của Rhodotorula sp nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi thường từ 2 ÷ 6 giờ.
Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn giai đoạn: Giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát
triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong.
Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula sp trong khoảng 24 - 48 giờ nếu môi trường cung cấp đủ
các chất cần thiết.
2.2.4 Đặc điểm sinh hóa [19], [22]
Nấm men Rhodotorula sp có một số đặc tính sinh hoá sau:
· Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, me- α -D glucoide, saccharose và
nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây
dựng tế bào.
· Tạo ra ezyme urease.
· Đồng hoá DBB (Diazonium Blue B).
· Có chứa sắc tố carotenoid.
· Không tạo thành hợp chất loại tinh bột.
· Không tạo ra acid acetic.
· Không đồng hoá được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorula sp khác với các giống
nấm men Cryptococus, Candida.
· Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid.
Đặc điểm sinh lý:
· Lên men: -
· D-Glucuronate: +/-
· Myo-inositol: -
· Đồng hoá nitrat: +/-
· Cơ chất giống tinh bột : -
· Phản ứng DBB: +
· Hoạt hoá Ureaza: +
· Coenzym : Q9 hoặc Q10
· Xylose : -
Hình 2.3. Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp [19]
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trên nhiều các nguồn cơ

chất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch
thể, lên men bán rắn,… chỉ từ giống Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như:
nấm men, nấm mốc, vi khuẩn.
2.3 BETA CAROTENE (β-Carotene)
2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids
2.3.1.1 Tổng quan về Carotenoids
a. Định nghĩa [22]
Carotenoids là các sắc tố hữu cơ tự nhiên được tìm thấy trong thực vật và một số cơ thể sinh vật quang
hợp, thực vật, tảo, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
b. Lịch sử của carotenoids [17], [18], [19], [20]
Nghiên cứu sớm nhất về carotenoids là những ngày đầu của thế kỷ 19. Carotenoid đã được phân lập lần
đầu tiên trong lịch sử bởi Wackenroder vào năm 1831 (thu lập trên cà rốt) và nhiều phát hiện khác về
carotenoids đã được đặt tên trong suốt những năm 1800 dù cấu trúc của chúng vẫn chưa được biết.
Đến tận năm 1907 nhờ kinh nghiệm mà Willstatter và Mieg đã thiết lập được công thức của beta-caroten
C
10
H
56
và cấu trúc này đã được giải thích bởi Karrer trong năm 1930 -1931. Và trong năm 1919, Steenbock
đã đưa ra giả thiết là có thể có mối quan hệ giữa beta-caroten và vitamin A.
Năm 1837 Berzelius đã gọi sắc tố có màu vàng trong là cây là xanthophylls. Và thập niên 1950,
carotenoids đã được sinh tổng hợp để sử dụng như là một chất màu thực phẩm.
Trong năm 1954 Roche đã bắt đầu sản xuất thương mại carotenoids. Có rất nhiều nghiên cứu đã được thực
hiện trong những năm 1970 – 1980 để xác định sự phù hợp của beta-caroten để sử dụng trong thực phẩm và
hoạt động của nó trong cơ thể người. Và trong những năm đầu thập niên 80 beta-caroten được đề nghị có thể
hữu ích trong việc phòng chống ung thư và nó là một chất chống oxy hoá.
Ngày nay số lượng các carotenoids tìm thấy trong tự nhiên lên đấn 700 hợp chất với các màu sắc khác
nhau. Các carotenoids chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên như thực vật và vi sinh vật.
c. Danh pháp và cấu tạo [4]
Có hai cách gọi tên carotenoids:

+ Tên truyền thống: tên theo nguồn gốc mà loại carotenoid đó được trích chiết đầu tiên.
+ Tên hệ thống: tên theo công thức hóa học. Carotenoid được gọi tên theo dẫn xuất carotene với hai nhóm
cuối được ký hiệu bằng các ký tự Hy Lạp (theo trình tự alphabe).
Các tiếp đầu ngữ, tiếp vị ngữ được sử dụng để chỉ mức độ hydro hóa và sự hiện diện của các nhóm chức
thay thế.
Hình 2.4. Công thức cấu tạo của các carotenoids quan trọng [4]
Tất cả các carotenoid có thể được xem như là dẫn xuất của acrylic C
40
H
56
có trung tâm là chuỗi gồm
nhiều nối đôi liên hợp, do kết hợp với hydro (hydrogenation), khử hydro (dehydrogenation), hình thành vòng
(cyclization), thực hiện quá trình oxy hóa (oxidation) tạo nên.
Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl diphosphat (IPP), hợp chất này
sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Hai phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếp
tục khử hydro tạo thành phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene. Tiếp theo đó là sự tạo
vòng, sự khử hydro và sự oxi hóa, để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong tự nhiên, tuy nhiên có
một số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các
carotenoid khác nhau.
d. Phân loại
Carotenoids được chia làm 2 nhóm sắc tố chính:
+ Carotenes: gồm các hợp chất hydrocacbon carotenoid.
+ Xanthophylls: gồm các dẫn xuất carotene với nhóm chức có chứa oxy (hydroxy, keto, epoxy, methoxy,
các nhóm acid carboxylic).
Hình 2.5. Phân loại carotenoids [4]
Theo Bong và cộng sự (2004) các carotenoid chính có giống men nghiên cứu Rhodotorula sp hiện điện đủ
hai nhóm, trong đó torulene (I), beta-carotene (III) thuộc nhóm carotenes; torularhodin (II) thuộc xanthophylls.
e. Tính chất [4], [18], [19]
Carotenoid thường kết tinh ở dạng tinh thể. Tinh thể carotenoid có nhiều dạng khác nhau và kích thước

của chúng cũng rất khác nhau như dạng hình kim dài (lycopen, δ-carotene), hình khối lăng trụ đa diện
(α-carotene), dạng hình thoi (β-carotene), kết tinh vô định hình (γ-carotene).
Nhiệt độ nóng chảy cao, khoảng 130 – 220
0
C.
Độ hòa tan thay đổi tùy loại dung môi. Tinh thể carotenoid không tan trong nước, tan tốt trong các dung
môi như chloroform, dichloromethane. Hầu như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo và các dung môi không
phân cực.
Các carotenoid tự do tạo màu kem, vàng, cam, hồng, đỏ tùy theo loại hợp chất, nguồn nguyên liệu, điều
kiện nuôi trồng, thời tiết,… dạng caroteneoprotein tạo dãy màu từ xanh lá, tím, xanh dương và đen. Khi đun sôi
sẽ chuyển sang màu đỏ cam do protein bị biến tính, phức hợp với carotenoid bị phá huỷ, màu carotenoid trở lại
bình thường.
Do hệ thống nối đôi liên hợp nên carotenoid dễ bị oxy hóa mất màu, hoặc đồng phân hoá, hydro hóa tạo
màu khác. Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu là nhiệt độ, phản ứng oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp, ion
kim loại, ánh sáng, tác dụng của enzyme (peroxidase, lipxidase, lipperoxidase)…
2.3.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp Carotenoids trong sinh vật [4],[17],[20]
Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành 3 giai đoạn:
· Giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ).
· Giai đoạn tổng hợp các enzyme - giai đoạn này xảy ra trong tối.
· Giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng.
Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpenoids gồm 5 carbon ban đầu. Giai đoạn hai là hình thành các hợp
chất C40. Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ thống các carotenoid. Có nhiều hệ enzyme khác
nhau được sử dụng vào giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp các sterol và carotenoid, chúng có chung con
đường là thông qua farnesyl pyrophosphate. Giống Rhodotorula sp thông qua tổng hợp acid mevalonic tương tự
với con đường tổng hợp carotene của các vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid khác (Scharf và Simpson, 1968).
Hình 2.6. Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị [4]
Neuroaporen
Lycopene
Lycopene

Cyclase
β-caroten
β-caroten
hydroxylase
(crtZ)
Zeaxanthin
Phytoen
Phytoene
Dessaturas
BACTERIA, FUNGI
DMAP
GGPP
Synthase
(crtE, al-3)
GGPP
Phytoene
Synthase
PLANTS,ALGAE,
DMAP
QPP FPP
ζ -caroten
Desaturase
lycopene
Lycopene
Cyclase
β-caroten
β-caroten
hydroxylase
(crtR)
Zeaxanthin

Phytoen
(phytoffuene Phytoene
Desaturase
ζ-carote
GGPP
(PPPP)
Phytoene
Synthase
GGPP
Synthase
FPP
(Nerosporene)
γ-caroten
Hình 2.7. Con đường
tổng hợp carotenoid ở
thực vật và vi sinh vật.
[16]
Theo Hornero-Mendez
D. và Britton G. (2002 )
có ít nhất 700 loại
carotenoid đã được mô tả
theo 2 con đường sinh
tổng hợp đã được biết.
Phần lớn là c á c carotenoid do các loài thực vật và
vi sinh tổng hợp theo con đường C40. Như vậy có nhiều chứng cứ chắc
chắn rằng sự hình thành carotenoid trong nấm men
theo kiểu chuỗi từ nhiều tiền chất bão hòa. Tuy
nhiên kết quả về sự hình thành vòng chưa rõ Nhưng nhìn
c h u n g , quá trình sinh tổng hợp carotenoids trong sinh vật
đ ư ợ c thực hiện qua hai giai đoạn

· Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP)
· Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP.
2.3.2 Giới thiệu về β-Carotene
2.3.2.1 Giới thiệu về β-Carotene [19]
Định nghĩa
Beta-carotene là một phân tử cân đối được cấu tạo do 1 chuỗi prolene và 2 vòng β -ionone ở 2 đầu, khi
thuỷ phân cho 2 phân tử vitamin A. Chuỗi liên kết dài sẽ tạo ra màu cam cho beta-carotene.
Hình 2.8. Cấu trúc phân tử Betacaroten [18]
Hình 2.9. Cấu trúc phân tử Betacaroten trong không gian 3D [21]
2.3.2.2 Tính chất [4], [18]
Beta-carotene là đồng phân quan trọng của hydrocacbon carotene. Tên gọi khác: Natural Extracts
(carotenes), Natural β-carotene, carotenesnatural; CI Food Orange 5, mixed carotenes, INS No. 160a(ii); CI
(1975) No. 75130; CI (1975) No. 40800 (β-Carotene), : b,b-Carotene,
Phân nhóm: thuộc nhóm Carotenoid.
Công thức phân tử: C
40
H
56
(β-Carotene).
Khối lượng phân tử: M = 536,88 (β-Carotene).
Nhiệt độ nóng chảy: 183
0
C
Độ hoà tan: beta-carotene có độ hòa tan rất khác nhau như sau:
+ Tan tốt trong chloroform, benzen, CS
2
.
+ Tan trung bình trong ether, petroleum ether, dầu thực vật.
+ Tan hạn chế trong methanol, ethanol.
+ Không tan trong nước, acid, hợp chất alkane.

Tinh thể beta-carotene có dạng hình lăng trụ 6 mặt màu tím đậm nếu kết tinh từ dung môi
benzen-methanol, nếu kết tinh từ dung môi petroleum ether có dạng lá hình thoi gần như vuông, màu đỏ. Dung
dịch beta-carotene loãng có màu vàng. Beta-carotene có độ hấp thu cực đại trong chloroform tại bước sóng
497nm và 466nm. Vì có 2 vòng β- ionone ở 2 đầu nên β - carotene có hoạt tính provitamin A mạnh nhất.
Beta-caroten là một chất chống oxi hoá vì vậy mà nó có thể được dùng để chống lại một số bệnh ung thư
và căn bệnh khác. Beta-caroten là một chất tự nhiên hiện diện trong những trái cây và rau quả màu vàng xanh.
Trong cơ thể, beta-caroten nằm trong vitamin A và nó được sử dụng như là một chất bổ sung của vitamin A để
ngăn chăn hoặc điều trị những chứng thiếu hụt vitamin A.
Beta-carotene tự nhiên gồm hai dạng đồng phân. Một đồng phân quan trọng là 9 – cis beta – carotene,
đồng phân còn lại là all – trans beta – carotene. Các đồng phân này đều có công thức phân tử giống nhau nhưng
cách sắp xếp của chúng trong không gian ba chiều lại khác nhau. Các đồng phân như vậy thường có những đặc
tính sinh hóa học rất khác biệt. Hợp chất 9 – cis beta – carotene là thành phần chống oxi hóa chủ yếu của
beta-carotene. Trong khi đó, loại beta-carotene tổng hợp chỉ chứa loại đồng phân all – trans beta – carotene có
khả năng chống oxi hóa rất thấp.
2.3.2.3 Sinh tổng hợp β-Carotene [18]
Hiện nay, có hai chu trình sinh tổng hợp β-Carotene được biết đến nhiều nhất, cả hai chu trình này đều là
sự kết hợp đối xứng của các mạch cacbon.
· Chu trình sinh tổng hợp β-Carotene do Badische Anilin- & Soda-Fabrik đề xuất.
Ở chu trình này sự sinh tổng hợp β-Carotene được Badische Anilin- & Soda- Fabrik giải thích dựa trên sự
kết hợp của hai phân tử hữu cơ đều có mạch cacbon bằng 20: C20 + C20
Quá trình sinh tổng hợp β-Carotene được Badische Anilin- & Soda-Fabrik đề xuất.