Khả sát điều kiên nuôi cấy vi khuẩn nitrobacter trong nồi lên men 10l

Tổng quan tài liệu
1. Giới thiệu vi khuẩn Nitrobacter
2. Ứng dụng vi khuẩn Nitrobacter
2.1 Chu trình nitơ trong nước
2.1.1 Quá trình amôn hóa
2.1.2 Quá trình nitrat hóa
2.4 Quá trình phản nitrat hóa
2.2 Vấn đề ô nhiễm môi trường nước
2.2.1. Nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường ao nuôi(bỏ)
2.2.1.1 Nguồn gây ô nhiễm NH
3
và NO
2
trong ao nuôi(bỏ)
2.2.1.2 Quá trình phân giải urê
2.2.1.3 Quá trình amon hóa protein
2.2.1.4 Các chất thải khác trong ao nuôi
2.2.2 Tác hại của NH
3
, NO
2
trong ao nuôi(trong môi trường nước)
2.3. Ứng dụng vi khuẩn nitrat hóa
3. Công nghệ lên men
2.1. Khái niệm về lên men
2.2. Nguyên lý chung
2.3. Các phương pháp lên men
2.3.1 Lên men bề mặt
2.3.2. Lên men chìm
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn
4.1. Yếu tố dinh dưỡng.

4.1.1 Nguồn cacbon
4.1.2 Nguồn thức ăn nitơ
4.1.3 Chất khoáng
4.2 Yếu tố môi trường
4.2.1 Nhiệt độ
4.2.2 pH
4.2.3 Oxi
4.3 Nguồn gốc chủng
4.4 Tỉ lệ giống
4.5 Thiết bị lên men
4.6 Tốc độ khuấy
4.7 Lưu lượng thông khí
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1 Chủng giống
2.1.2 Môi trường
2.1.2.1 Môi trường Winogradsky
2.1.2.2 Môi trường Hottinger
2.1.3 Hóa chất
2.1.3.1 Nước muối sinh lý
2.1.3.2 Thuốc thử Griess I
2.1.3.3 Thuốc thử Griess II
2.1.3.4 Thuốc nhuộm Gram
2.1.4 Dụng cụ
2.1.5 Thiết bị
2.2Phương pháp nghiên cứu(in hoa)
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Nitrobacter sp.
2.2.2 Phương pháp làm tiêu bản quan sát hình thái vi khuẩn và khuẩn lạc(đổi vào
mục2.1.1)
2.2.3 Phương pháp xác định thời gian thế hệ của vi khuẩn(bỏ)

2.2.4 Phương pháp kiểm tra vô trùng
2.2.5 Phương pháp kiểm tra độ sống
2.2.6. Phương pháp kiểm tra OD canh cấy trong quá trình lên men.
2.2.7 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng của vi khuẩn trong điều kiện
nuôi cấy tĩnh.
2.2.8 Xác định các điều kiện thích hợp cho lên men vi khuẩn Nitrobacter sp.
2.2.9 Phương pháp kiểm tra khả năng Nitrate hóa của vi khuẩn Nitrobacter sp.(bỏ)
2.2.10 Phương pháp xử lý số liệu
Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Hình thái tế bào, khuẩn lạc và tính chất nuôi cấy của chủng Nitrobacter sp.
3.1.1. Tế bào
3.1.2 Khuẩn lạc và tính chất nuôi cấy
3.1.3 Thời gian thế hệ của vi khuẩn Nitrobacter sp.(bỏ)
3.2 Kết quả định tính vi khuẩn Nitrobacter sp
3.3 Kết quả khảo sát sự sinh trưởng của Nitrobacter sp. trong nồi lên men 10L
3.3.1 Kết quả nuôi cấy Nitrobacter sp trên môi trường Winogradsky.
3.3.1.1 Loạt 1 (W 1)
3.3.2.2 Loạt 2 (W2)
3.3.2 Kết quả nuôi cấy Nitrobacter trên môi trường Hottinger
3.3.2.1 Loạt 1 (H1)( .(bỏ)
3.3.2.2 Loạt 2 (H2) .(bỏ)
3.3.3 Đường cong sinh trưởng cùa vi khuẩn Nitrobacter sp.
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1.1 Các đặc tính sinh học.(bỏ)
1.2 Các thông số nuôi cấy vi khuẩn Nitrobacter sp. trên nồi lên men 10 lít.(bỏ)
2. Kiến nghị

PHẦN 1
TỔNG QUAN

TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu vi khuẩn Nitrobacter
Vi khuẩn Nitrobater thuộc nhóm vi khuẩn Nitrat hóa. Những vi khuẩn thuộc
nhóm này có tế bào đa hình dạng: hình que, hình bầu dục, hình cầu hoặc dạng
xoắn. Chúng là vi khuẩn gram âm, có thể di động với những tiên mao ở đầu cực
hoặc ở bên hông hoặc không di động. Hầu hết những loài thuộc nhóm vi khuẩn
nitrat hóa là những loài hiếu khí. Một số vi khuẩn thuộc trường hợp ngoại lệ có thể
phát triển bằng cách hô hấp yếm khí. Nhiều nghiên cứu cho thấy một số vi khuẩn
thuộc nhóm nitrat hóa có khả năng oxi hóa nitrit thành nitrat, những vi khuẩn này
dinh dưỡng bằng cách oxi hóa hợp chất vô cơ, trong đó quan trọng nhất là oxi hóa
hợp chất nitrit thành nitrat. Năng lượng tạo ra trong quá trình oxi hóa được sử dụng
để cung cấp cho quá trình cố định CO
2
trong chu trình Calvin. Đặc biệt những
Nitrobacter do sở hữu loại enzyme ribulose 1,5 diphosphate carboxylase nên quá
trình cố định CO
2
diễn ra mạnh mẽ hơn. Nhóm Nitrobacter gồm những loài vi
khuẩn ôn đới(bỏ) (ưa nhiệt độ trung bình), biên độ nhiệt từ 5-40
0
C, nhiệt dộ tối ưu
kảng 28 và biên độ pH từ 5,8- 8,5 với giá trị tối thích 7,6-7,8 [15].
Vi khuẩn nitrat hóa phân bố rộng khắp, trong đất, nước ngọt, nước lợ, nước biển,
hệ thống nước thải và trên bề mặt những tảng đá xây dựng lâu năm [21].
Do có khả năng oxi hóa các hợp chất vô cơ đặc biệt là oxi hóa nitrit thành nitrat
để thu năng lượng, nhóm vi khuẩn nitrat có vai trò quan trọng trong vòng tuần
hoàn nitơ, chúng sử dụng hệ enzyme đặc hiệu để thực hiện quá trình chuyển hóa
theo phương trình tổng quát như sau:
NO
2

+ O
2
→

NO
3
Một số giống vi khuẩn vi khuẩn nitrat hóa thường gặp như: Nitrobacter,
Nitrospina, Nitrococcus, Nitrospira,…
• Giống Nitrobacter
Tế bào Nitrobacter có nhiều hình dạng khác nhau, hình que, hình quả lê, hình
bầu dục… Chúng là những vi khuẩn gram âm, hiếu khí bắt buộc, không di động
hoặc di động bằng tiên mao ở đầu cực hoặc ở bên hông tế bào. Biên độ nhiệt phát
triển từ 5-40
0
C, pH thích hợp 6,5- 8,5 [15].
Về mặt dinh dưỡng, nitrit là nguồn năng lượng chính, năng lượng tạo ra trong
phản ứng nitrit thành nitrat được sử dụng cho quá trình cố định CO
2
của

tế bào.
Khi có măt cả nitrit và các hợp chất hữu cơ, tế bào thường có sự đổi pha trong quá
trình phát triển. Trước tiên, nitrit được sử dụng và sau đó là giai đoạn ức chế khi
chất hữu cơ bị oxi hóa. Tuy nhiên, sự phát triển nhờ hợp chất hữu cơ thường diễn
ra chậm hơn [14].
Do phần lớn năng lượng được sử dụng cho quá trình cố định CO
2
nên phần sử
dụng cho quá trình sinh sản rất thấp dẫn đến thời gian thể hệ của vi khuẩn
Nitrobacter khá dài, chúng cần có thời gian tích lũy đủ năng lượng để nhân đôi.

Dưới điều kiện tối ưu, cứ 13 giờ Nitrobacter mới phân chia một lần và trong điều
kiện thực tế, khoảng thời gian này kéo dài 15-24 giờ [15]. Tất cả các loài thuộc
giống Nitrobacter đều không có bào tử. Một số loài được biêt đến như N.vulgaris,
N.hambugensis, N.winogradskyi…
1.2Ứng dụng vi khuẩn Nitrobacter
1.2.1 Chu trình nitơ trong nước
Chu trình nitơ về cơ bản cũng giống như các chu trình khí khác, được sinh vật
sản xuất hấp thụ và đồng hóa rồi được chu chuyển qua các nhóm tiêu thụ, cuối cùng
bị sinh vật phân hủy trả lại cho môi trường. Chu trình nitơ bao gồm nhiều công đoạn
theo từng bước: cố định đạm, amon hóa, nitrit hóa, nitrat hóa và phản nitrat hóa [2].
Chu trình nitơ trong ao nuôi là quá trình các chất thải của cá và các chất mùn hữu
cơ khác được chuyển hóa từ NH
3
hoặc NH
4
thành nitrit và nitrat. Sau đó, nitrat được
chuyển thành nitơ tự do (ở dạng khí) nhờ hoạt động của thực vật và các vi khuẩn
phản nitrat hóa. Hoạt động cuả nhóm vi khuẩn nitrat hóa là quan trọng nhất của chu
trình nitơ [14]. Nếu quá trình này không được duy trì, cá và các vi sinh vật khác cư
trú trong ao sẽ gần như không thể sống. Nguyên nhân là do NH
3
có tính độc cao
ngay cả ở nồng độ rất thấp (NH
4
không có hại nhưng ở pH cao nó nhanh chóng
chuyển thành NH
3
). Nitrit cũng gây độc cho cá và các vi sinh vật khác, tuy nhiên
độc tính của nó thấp hơn nhiều so với NH
3

. Vì vậy, việc xây dựng vòng tuần hoàn
nitơ trong ao nuôi thủy sản là rất quan trọng [24].
Hình 1: Chu trình nitơ trong nước
1.3 2.1.1 Quá trình amôn hóa
Vi sinh vật dị dưỡng sử dụng chất hữu cơ của quá trình mùn hóa như một nguồn
cacbon của chúng và qua đó, nitơ trong các hợp chất hữu cơ chứa nitơ từ thực vật
hay động vật được chuyển thành NH
3
. Quá trình này còn được gọi là quá trình
khoáng hóa, là kết quả của quá trình chuyển hóa thức ăn [14].
2.1.2 Quá trình nitrat hóa
Nitrat hóa là quá trình oxi hóa acmoniac và muối amon để hình thành axit nitro
và axit nitric, qua đó vi sinh vật thu năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của
mình. Nitrat hóa xảy ra theo 2 giai đoạn do 2 nhóm vi khuẩn khác nhau thực hiện
[1].
Vi khuẩn nitrit hóa như Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosospira phân hủy
acmoniac thành chất ít độc hơn là nitrit [16]. Trong suốt quá trình này, vi khuẩn
nitrit hóa lấy các phân tử hidro của acmoniac như một nguồn năng lượng [17]. Sau
đó các phân tử oxi kết hợp với các phân tử nitơ không còn hydro để tạo thành dạng
NO theo phản ứng:
2NH
3
+ 3O
2
→ 2HNO
2
+ H
2
O + 158Cal
Quá trình này xảy ra theo nhiều giai đoạn trung gian khác nhau và rất phức tạp.

Có giả thuyết cho rằng sản phẩm trung gian có thể là Hydroxilmin (NH
2
OH), nhưng
giả thuyết này không tồn tại lâu. Sau này người ta cho rằng sản phẩm trung gian có
thể là HNO. Trong mỗi giai đoạn đều tạo ra một năng lượng nhất định. Năng lượng
này được vi khuẩn sử dụng trong quá trình phát triển của chúng [9].
Giai đoạn nitrat hóa được thực hiện bởi một nhóm vi khuẩn khác, điển hình là các
loài thuộc giống Nitrobacter, các giống khác có thể gặp như Nitrococus, Nitrosystis,
Nitrospira.Chúng sử dụng enzyme nitrit oxidase xúc tác cho quá trình chuyển hóa
nitrit thành nitrat theo phản ứng:
2HNO
2
→ HNO
3
+48Cal
Dạng nitrat tạo ra có thể được thực vật sử dụng như một nguồn dinh dưỡng hoặc
có thể bị bẻ gãy liên kết tạo thành khí N
2
nhờ hoạt động của một vài loài vi khuẩn kị
khí [10].
Cả hai quá trình trên đều dẫn tới giải phóng năng lượng. Vi khuẩn nitrat hóa sẽ sử
dụng năng lượng này để tiến hành phản ứng khử CO
2
thành hợp chất hữu cơ, song
song với các phản ứng oxi hóa NH
3
và HNO
2
. Quá trình có thể theo phản ứng sau
[15]:

CO
2
+ 4H
+
+ X Cal → HCHO + H
2
O
2.4 Quá trình phản nitrat hóa
Phản nitrat hóa là quá trình chuyển hóa nitrit thành N
2
đồng thời oxi hóa các chất
hữu cơ như đường, rượu, axit hữu cơ thành CO
2
và H
2
O [11]. Năng lượng sinh ra
khi oxi hóa cơ chất được vi sinh vật sử dụng trong các hoạt động sống của chúng.
Trong chu trình nitơ, sự phản nitrat hóa giúp cân bằng các hợp chất ni tơ bằng cách
chuyển ni tơ đã bị cố định vào trong sinh quyển. phần lớn vi khuẩn phản nitrat hóa
là vi khuẩn dị dưỡng, chúng sử dụng cacbon hữu cơ, hydro, hydrosunfit như một
chất nhường điện tử và nitrat là chất nhận điện tử. Chất nhường điện tử bị oxi hóa
thành CO
2
, H
2
O hoặc sunfat, đồng thời nitrat bị khử thành N
2
theo phản ứng:
6NO + 5CH
3

OH → 3N
2
+ 5CO
2
+ 7H
2
O + 6OH
-

Quá trình phản nitrat có thể xảy ra trong điều kiện kị khí lẫn hiếu khí, nhưng đặc
biệt mạnh trong điều kiện kị khí [11]. Do vậy, quả trình này thường gặp trong đất
yếm khí và trong đáy sâu của các hồ, biển…không có oxi hoặc giàu các chất hữu cơ
đang phân hủy. Các vi sinh vật thực hiện quá trình này phân bố rất rộng rãi trong tự
nhiên. Phần lớn chúng thuộc loại dị dưỡng hóa năng hữu cơ, kị khí tùy nghi gồm
một số giống như: Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus, Clostridium,
Micrococcus… [13].
2.2 Vấn đề ô nhiễm môi trường nước
Môi trường ao nuôi là yếu tố quan trọng quyết định năng suất nuôi trồng thủy
sản. Hiện nay, việc làm sạch và giữ sạch môi trường ao nuôi vẫn còn nhiều bất cập
khiến người nuôi tôm gặp rất nhiều rủi ro. Phần bùn ao,nơi các chất thải tích tụ
trong quá trình nuôi là môi trường lý tưởng cho các vi trùng và kí sinh trùng gây
bệnh phát triển. Mỗi năm, lượng bùn tích tụ ở đáy a nuôi tôm thâm canh hình thành
lớp bùn dày 10-15cm, là một khối lượng lớn chất khô giàu hữu cơ, bao gồm sinh
khối vi sinh vật, xác động thực vật thủy sinh. Khi các chất hữu cơ này phân hủy sẽ
làm giảm lượng oxi hòa tan và sinh các chất độc hại cho thủy sản như NH
3
, CH
4
,
H

2
S… [18]
Kết quả phân tích chỉ tiêu hóa lý của bùn ao nuôi tôm công nghiệp tại một số địa
phương của Viện Công nghệ môi trường đã cho thấy tổng chất hữu cơ của bùn ao
công nghiệp khá cao, đặc biệt trong ẫu bùn ao nuôi tôm của các tỉnh phía nam, nơi
có thời gian nuôi công nghiệp vài năm nay. Bên cạnh đó, số lượng vi sinh vật hoại
sinh hiếu khí tổng số không nhiều ở hầu hết các mẫu phân tích. Đây là hậu quả của
việc sử dụng không hợp lý các thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn [19]
2.2.1. Nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường ao nuôi
2.2.1.1 Nguồn gây ô nhiễm NH
3
và NO
2
trong ao nuôi
Trong nước và trong đất luôn tồn tại nhều xác động thực vật, xác động thực vật
chứa rất nhiều hợp chất hữu cơ có mặt nitơ.Các hợp chất hữu cơ thường không được
sử dụng trong quá trình trao đổi chất ở thực vật, thực vật chỉ sử dụng các hợp chất
vô cơ ở dạng hòa tan. Do đó,các hợp chất hữu cơ được thải vào môi trường nước
nếu không được vi sinh vật phân giải thành các hợp chất vô cơ hòa tan sẽ không
được thực vật sử dụng. Như vậy, vi sinh vật vừa có khả năng làm sạch môi trường ô
nhiễm bởi các hợp chất chứa ni tơ, vừa như một tác nhân trung gian chuyển hóa các
hợp chất khó tiêu thành các hợp chất dễ tiêu cho thực vật sử dụng. Các hợp chất hữu
cơ trong nước còn bị phân hủy bởi các động vật khác [21].
2.2.1.2 Quá trình phân giải urê
Urê là sản phẩm quá trình trao đổi chất của người và động vật. Urê chủ yếu có
trong nước tiểu, ngoài ra ure còn được đưa vào môi trường nước từ việc sử dụng
phân bón hóa học. Urê không được sử dụng trực tiếp bởi thực vật mà chúng còn
được chuyển hóa thành NH
3
hay muối amon nhờ các vi sinh vật có trong đất và

nước. Vi khuẩn tham gia quá trình chuyển hóa gồm Sarcuna hanseni, Bacillus
freudenreichui, Sporocinaurea…. Cơ chế chuyển hóa của chúng rất đơn giản, được
tiến hành dưới tác động của enzyme urease:
CO
2
+ H
2
O → CO + NH
3
→ (NH
4
)
2
CO
3
Tuy nhiên, muối amon cacbonat là hợp chất không bền nên rất dễ chuyển hóa
nếu không được hấp thụ ngay [5]:
(NH
4
)
2
CO
3
→

NH
3
+CO
2
+H

2
O
2.2.1.3 Quá trình amon hóa protein
Quá trình này còn được gọi là qua trình lên men thối, phân hủy protein thành
NH
3
và một số sản phẩm trung gian khác nhờ sự tham gia của các vi sinh vật.
2.2.1.4 Các chất thải khác trong ao nuôi
Không phải tất cả các chất hữu cơ trong ao nuôi đều tham gia vào vòng tuần hoàn
nitơ. Việc hiểu rõ hơn các chất trong nước có chứa nitơ là rất quan trọng để có thể
kiểm soát và bổ sung các hợp chất nitơ, giúp ổn định hàm lượng nitrat ở mức thấp
hoặc giảm đến mức thấp nhất hàm lượng NH
3
, NO
2
[27].
Tất cả các loài động thực vật đều chứa protein và axit béo, lượng nitơ chứa trong
các hợp chất đó thay đổi theo từng cơ quan, bộ phận. Tuy nhiên, đường, các
hydratcacbon và hầu hết các loại axit béo là những chất không chứa nitơ, vì vậy
chúng không thể trực tiếp tham gia chu trình nitơ trong ao nuôi [24].
2.2.2 Tác hại của NH
3
, NO
2
trong ao nuôi
NH
3
và NH
4
là sản phẩm sinh ra từ quá trình amôn hóa được gọi chung là amôn,

trong đó NH
3
là thành phần chính gây hại cho tôm, cá. Các nghiên cứu cho thấy,
nồng độ NH
3
trong nước phụ thuộc vào nhiệt độ và pH. Ở pH =7, thành phần chủ
yếu của amôn là NH
3
, ở pH=8, chủ yếu là NH
4
[22].
Sự có mặt của amôn trong nước ảnh hưởng rât nhiều đến sức sống của tôm cá
ngay ở nồng độ thấp. Ở nồng độ 0,01 mg/l gây độc cho cá qua đường máu. Ở nồng
độ thấp dưới 0,01 mg/l cũng gây kích thích lên mang cá. Ở nồng độ 0,2 -0,5 mg/l
gây độc cấp tính [8]. Nếu cá tiếp xúc lâu dài với nồng độ amon cao sẽ dẫn đến da
và mang phát triển quá mức bình thường. Sự phát triển quá mức này khiến những
phiến mang thứ cấp của cá bị sưng và sẫm lại, hạn chế nước chảy vào các tơ mang
dẫn đến hậu quả là sự hô hấp của cá gặp khó khăn, gây stress cũng như tạo điều kiện
tốt cho các vi khuẩn và kí sinh trùng phát triển mạnh. Những vi sinh vật này gây ảnh
hưởng mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và
phát tiển của cá như: gây tổn hại đến các mô, đặc biệt là mang và thận, làm mất cân
bằng sinh lý, sinh trưởng yếu, giảm sức đề kháng dẫn đến bệnh tật và chết. Do đó,
nồng độ amôn cao là dấu hiệu phổ biến báo hiệu vi khuẩn gây bệnh mang cá xuất
hiện [18].
Nitrit cũng gây độc cho cá nhưng ở mức độ thấp hơn. Ở nồng độ 0,5 mg/l NO
2
có
thể làm giảm sự phát triển của cá, gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe và làm cá chết.
Nguyên nhân là do NO
2

gắn kết với hemoglobin tạo thành dạng methemoglobin.
Hemoglobin vận chuyển O
2
đến các cơ quan trong cơ thể mà methemoglobin không
làm được. Do vậy, nồng độ nitrit cao sẽ gây ngạt cho cá ngay cả khi có đầy đủ O
2
trong nước. Nếu lượng methemoglobin xuất hiện nhiều trong máu, thay vì màu đỏ,
máu sẽ có màu nâu gọi là “bệnh máu nâu” [6].
Để khắc phục tình trạng trên, có thể bổ sung muối vào ao nuôi để tăng nồng độ
clorit trong nước. Nồng độ clorit phải lớn hơn ít nhất 6 lần so với nồng độ nitrit. Sự
có mặt clorit trong nước sẽ ngăn cản sự hấp thu nitrit của cá, làm giảm nguy cơ cá bị
bệnh. Tuy nhiên, việc thêm muối clorit vào ao hồ không có nghĩa là đã loại trừ được
lượng nitrit có trong hồ, chúng vẫn là một mối đe dọa cho cá. Ngoài ra, lượng muối
thêm vào sẽ ảnh hưởng đến các loài thủy sinh sống trong ao [21].
Sự có mặt của NO
3
trong ao không ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của cá.
Tuy nhiên trong điều kiện thiếu oxi, NO
3
sẽ tham gia quá trình phản nitrat ở giai
đoạn đầu, hợp chất nitrozo tạo thành từ sản phẩm NO
2
sẽ gây bệnh ung thư cho cá
[8].
2.3. Ứng dụng vi khuẩn nitrat hóa
Để giảm thiểu những bất lợi trong nuôi trồng thủy sản do sử sụng hóa chất và ô
nhiễm môi trường ao nuôi. Việc nghiên cứu và sử dụng chế phẩm sinh học trong
quá trình nuôi tôm đang phát triển mạnh. Theo Cục Bảo vệ nguồn lợi thủy sản, hiện
đã có hơn 200 thương hiệu chế phẩm sinh học và vitamin đang bán trên thị trường
nước ta. Trong các chế phẩm vi sinh, vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter được

sử dụng khá nhiều, chúng có vai trò quan trọng trong việc làm sạch môi trường ao
nuôi [18].
Nhiều chế phẩm chúa Nitrosomonas và Nitrobacter kết hợp một số vi sinh vật
khác với các công dụng hấp thụ tức thì NH
3,
H
2
S ở đáy ao, phân hủy nhanh các chất
hữu cơ do thức ăn dư thừa, chất thải tạo các chất vô cơ giúp tảo phát triển, can bằng
hệ vi sin vật ao nuôi, khống chế vi sinh vật gây bệnh, cân bằng pH… Một số chế
phẩm đang được bán trên thị trường Việt Nam và có hiệu quả xử lý tốt như: Pond
clean, Aqua clear, Bios “biến đục thành trong”, Clean-QA, NB 25 for fish….[29].
2. Công nghệ lên men
2.1. Khái niệm về lên men
L.Pasteur gọi sự lên men là sự sống thiếu không khí (kị khí, thiếu oxi).
Tuy nhiên, thuật ngữ lên men đến nay được hiểu là tất cả các quá trình biến đổi
do vi sinh vật thực hiện trong quá trình yếm khí hay hiếu khí. Lên men là sự
tích lũy các sản phẩm trao đổi chất hữu ích cho con người trong quá trình nuôi
cấy vi sinh vật.
Việc nuôi cấy vi sinh vật với qui mô lớn từ khoảng 10 lít đến hàn ngàn
lit được gọi là lên men công nghiệp (industrial fermentation)
Công nghiệp lên men đã hình thành từ cuối thế kỷ XIX và phát triển
mạnh vào nửa cuối thế kỷ XX với hàng lọat thương phẩm.
2.2. Nguyên lý chung
Quá trình lên men công nghiệp đều được thực hiện trong nồi lên men
Fermentor hay còn gọi là Bioreactor và trải qua 3 công đoạn chính:
Trước lên men (Upstream): Xử lý, chế biến, phối trộn và khử trùng nguyên liệu
đầu.
Lên men (Fermentation): Trong bioreactor thông khí , trong dịch lên men diễn
ra quá trình truyền khối, truyền nhiệt, tăng sinh khối tế bào và điều chỉnh hoạt

tính sinh học để tạo nhiều sản phẩm.
Sau lên men (Downsteam): tách tế bào bằng li tâm hay lọc, phá vỡ tế bào để
giải phóng các chất nội bào, tủa, tinh sạch các chất, thực hiện các phản ứng bổ
sung tạo đúng sản phẩm tinh chế, sấy, thương phẩm ở dạng hoàn chỉnh được
bảo quản, tận dụng phế phụ phẩm.
Quá trình lên men trong Fermenter được chia thành 2 pha:
Pha1:Pha sinh trưởng
Pha 2: Pha tich tụ các sản phẩm trao đổi chất.
Pha 1: Bắt đầu từ khâu nhân giống đến quá trình nuôi cấy ở thùng lên men cho
tới khi sinh khối ngừng phát triển và bắt đầu tích tụ nhiều các sản phẩm lên
men.
Trong pha này chủ yếu sinh tổng hợp protein và xây dựng tế bào. Các tế
bào trong pha này rất trẻ nên sinh trưởng nhanh và sinh khối tăng nhanh.
Môi trường dinh dưỡng trong pha này giàu nguồn cacbon, nitơ và
photpho vô cơ.
Sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật ở pha này không có hoặc bắt đầu
tích tụ với một lượng nhỏ sau đó tăng dần lên, cùng với sự phát triển của giống
đến khi ổn định thì chuyển sang pha thứ 2.
Pha 2: Bắt đầu khi vi sinh vật phát triển chậm lại, các sản phẩm trao đổi chất
được tích tụ chủ yếu trong giai đoạn này. Ở pha này môi trường dinh dưỡng cạn
dần, sinh khối tế bào cũng giảm dần, ngược lại lượng sản phẩm trao đổi chất
tích lũy ngày càng tăng.
Cuối pha lượng sinh khối giảm do tế bào bắt đầu tự phân, quá trình tích
tụ sản phẩm bắt đầu chậm lại, một số sản phẩm bị vi sinh vật sử dụng làm
nguồn dinh dưỡng. Vì thế trong thực tế sản xuất thường kết thúc quy trình lên
men vào trước thời điểm cuối pha 2 nhằm hạn chế việc vi sinh vật sử dụng sản
phẩm, hạn chế phần hiệu suất lên men, tránh tình trạng tế bào tự phân làm tăng
độ nhớt gây khó khăn cho việc tách lọc sau này.
Ngoài ra môi trường dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng rất lớn đến việc
chuyển từ pha 1 sang pha 2. Sự thay đổi về thành phần môi trương sẽ dẫn đến

sự thay đổi về hình thái và hoạt lực của giống, hiện tượng này không chỉ gặp
trong sản xuất mà trong cả điều kiện thực nghiệm. Như vậy cần có môi trường
nuôi cấy là một thể toàn vẹn thống nhất trong đó vi sinh vật và môi trường có
mối quan hệ tương hỗ lẫn nhau.
Một số yêu cầu khi nghiên cứu quá trình lên men như sau:
-Chọn các điều kiện tối ưu của giống vi sinh vật trong pha thứ nhất để có
thể rút ngắn được giai đoạn này.
-Xác định các điều kiện chuyển tiếp từ pha thứ nhất sang pha thứ hai
-Tìm các nguyên nhân làm giảm hàm lượng các sản phẩm được tạo
thành sau khi đã đạt đến mức tối đa.
Một quá trình lên men cổ điển được tiến hành theo các bước sau:
Hình 2: Sơ đồ mô tả quá trình lên men
2.3. Các phương pháp lên men
2.3.1 Lên men bề mặt
Lên men bề mặt là nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt rắn xốp như cám,
gạo, ngô, tấm, bột… và môi trường lỏng (dịch thể ) như nước đường hóa, nước
bã rượu, rỉ đường… phối hợp với một số muối khoáng. Đối với nấm mốc, xạ
khuẩn thường dùng môi trường ở thể rắn còn đối với vi khuẩn thường dùng môi
trường ở thể lỏng.
Vi sinh vật phát triển hấp thụ những chất dinh dưỡng của môi trường và
sử dụng oxy phân tử của không khí để hô hấp. Vì vậy lên men bề mặt:
-Phải có bề mặt thoáng rộng
-Lớp môi trường không quá sâu (2-5cm)
-Độ ẩm khoảng 60%
Chế tạo môi trường
Khử trùng môi
trường
Nhân giống
(cấp 1, cấp
2…)

Giống
vi sinh
vật
Thu hồi sản phẩm
Lên men
Kiểm tra các
thông số và
sản phẩm
Vi sinh vật sử dụng oxy phân tử của không khí để hô hấp tạo ra CO2, hơi
nước và nhiệt lượng tỏa ra làm:
-Nhiệt độ môi trường xung quanh tăng
-CO2 tăng
-Môi trường khô dần
Vì vậy cần:
-Tăng độ thoáng khí và duy trì độ ẩm
-Giảm CO2
Hiện nay lên men bề mặt đã được cải tiến nhiều, thay khay và buồng
nuôi cấy bằng thùng quay có trục kéo, thùng bể có thổi khí liên tục và điều
khiển nhiệt độ, độ ẩm. Cải tiến này làm tăng năng suất của quá trình lên men rất
nhiều, nhưng vẫn có nhược điểm như:
-Tốn nhiều diện tích mặt bằng
-Khó cơ khí hóa và đồng bộ hóa toàn bộ quy trình
-Chi phí nhân công, điện nước cao.
2.3.2. Lên men chìm
Trong lên men chìm, vi sinh vật được nuôi cấy ở môi trường lỏng và
phát triển theo chiều sâu của môi trường.
Lên men chìm được tiến hành trong hệ thống lên men sinh học tự động
(fermentor) dùng cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí. Trong fermentor chứa
môi trường dinh dưỡng có các cánh khuấy và sục khí để cung cấp oxy cho vi
sinh vật phát triển.

Quá trình nhân giống cho dịch lên men được tiến hành qua các cấp.
Nhân giống cấp 1 trong bình tam giác, nhân giống cấp 2 trong bình có dung tích
lớn hơn và nhân giống cấp 3 trong các nồi lên men nhỏ và tỉ lệ nhân giống phải
có tỉ lệ từ 1- 10%.
Trong môi trường lỏng vi sinh vật phát triển theo đường cong sinh
trưởng. Đầu tiên chúng làm quen với môi trường, lướn lên về kích thước ở pha
tiền phát. Ở pha logarit số lượng vi sinh vật tăng nhanh, sản phẩm trao đổi chất
được hình thành, chất dinh dưỡng giam nhanh, hiện tượng tỏa nhiệt làm cho
môi trường nóng lên, bọt khí nổi trên bề mặt. Nếu bọt khí quá nhiều và tràn ra
ngoài thì phải dùng các chất phá bọt, như các chất phá bọt tổng hợp, dầu thực
vật hay mỡ cá voi để tránh bị nhiễm trùng và làm hỏng quy trình lên men.
Ngoài ra do vi sinh vật có khả năng làm thay đổi pH môi trường nên
thường phải cho thêm vào môi trường lên men 2-3% CaCO
3
để điều chỉnh pH
hoặc thêm ure hay NH
4
OH để điều chỉnh pH.
Thời gian lên men thường vào khoảng 30 -72 giờ hoặc có khi dài hơn
tùy thuộc vào pha thứ nhất, nếu pha thứ nhất có số lượng tế bào đủ, hoạt lực lên
men cao thì thời gian của pha này ngắn và pha thứ hai bắt đầu được sớm hơn,
như thế quá trình lên men sẽ kết thúc sớm hơn.
Trong quy trình lên men bề sâu, nếu là nuôi cấy hiếu khí phải sục khí
liên tục, nếu là kị khí thì thỉnh thoảng mới khuấy trộn.
So sánh hai phương pháp lên men bề mặt và lên men chìm thấy phương
pháp lên men chìm có nhiều ưu điểm hơn như:
- Môi trường dinh dưỡng có thể đáp ứng đầy đủ nhu cầu sinh lý của từng
giống vi sinh vật.
- Hiệu suất lên men cao, thu sản phẩm lớn trong cùng một thể tĩh kên
men, dễ cơ khí hóa, ít tốn nhân công và dện tích bê mặt nhỏ nên sản phẩm sẽ có

giá thành hạ hơn.
- Thời gian ngắn
Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhược điểm là đòi hỏi kĩ thuật cao,
cần khuấy và sục khí liên tục, khí được nén và thổi từ bên ngoài vào nên dễ bị
nhiễm trùng toàn bộ. Đối với lên men bề mặt, nếu nhiễm có thể loại bỏ từng
phần.
4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn
3.1. Yếu tố dinh dưỡng.
3.1.1 Nguồn cacbon
Trong tế bào vi sinh vật, cacbon có mặt trong protein, enzyme, axit nucleic
cũng như trong tất cả các sản phẩm trao đổi chất. Trên thế giới, vi sinh vật là giới
duy nhất có khả năng đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau. Chúng sử dụng tất
cả các nguồn các bon khác nhau để tiến hành quá trình trao đổi chất, sinh trưởng
và phát triển. Vi sinh vật trong tự nhiên và trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo sẽ sử
dụng các nguồn cacbon có cấu tạo đơn giản và có mức oxi hóa thấp [14].
Vi khuẩn phân giải ni tơ thuộc nhóm tự dưỡng hóa năng. Trong quá trình
chuyển hóa ni tơ từ dạng amon thành nitrat, phần lớn năng lượng được tạo ra
trong các phản ứng oxi hóa được dùng để cố định CO
2
trong không khí thành các
hợp chất cacbon cơ bản. Đặc điểm này cho thấy vi khuẩn phân giải nitơ phụ thuộc
vào nguồn cacbon có trong môi trường và hầu như các hợp chất cacbon hữu cơ
không cần thiết phải bổ sung trong quá trình nuôi cấy [21].
3.1.2 Nguồn thức ăn nitơ
Nitơ tự do có cấu trúc bền vững và rất trơ về mặt hóa học, vì vậy đa số các vi
sinhh vật không thể đồng hóa N
2
trong không khí. Tuy nhiên có những vi sinh vật
có thể chuyển hóa N
2

thành NH
3
nhờ hoạt động xúc tác của một hệ thống enzyme
có tên là nitrogenase. Các vi sinh vật này được gọi là vi sinh vật cố định nitơ [14].
Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật là NH
3
và NH
4
. Đôi khi có những
loại vi sinh vật không phát triển được trên môi trường chứa amôn thì nguyên nhân
là ở độ chua sinh lý do các muối này tạo ra. Urê là nguồn thức ăn trung tính về
mặt sinh lý, khi bị phân giải bởi enzyme urease, ure bị phân giải thành NH
3
và
CO
2
. Phần NH
3
được vi sinh vật sử dụng mà không làm chua môi trường như các
muối amôn. Vi khuẩn thuộc nhóm Nitrosomonas có khả năng oxi hóa nhóm amôn
thành nitrit để cung cấp năng lượng cho quá trình cố định CO
2
, vì vậy trong môi
trường nuôi cấy, sự có mặt của NH
4
là rất cần thiết [14].
Muối nitrat là nguồn thức ăn thích hợp của vi khuẩn thuộc nhóm Nitrobacter. Sau
khi vi khuẩn sử dụng hết gốc axit, các ion kim loại còn lại (Na, Mg, K…)sẽ kiềm
hóa môi trường. Để tránh hiện tượng này, người ta thường sử dụng muối NH
4

NO
3
để cung cấp nguồn nitơ cho quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, gốc NH
4
thường bị hấp
thụ nhanh hơn rồi mới đến gốc NO
3
[21].
3.1.3 Chất khoáng
Ngoài nước, các chất hữu cơ, trong tế bào còn chứa nhiều chất khoáng, lượng
chất khoáng trong tế bào vi sinh vật thay đổi tùy loài, tùy từng giai đoạn và điều
kiện phát triển của vi sinh vật. Mỗi nguyên tố đều có tác dụng nhất định đối với sự
sinh trưởng phát triển của tế bào vi sinh vật mà các nguyên tố khác không thể thay
thế được. Các nguyên tố đa lượng gồm có: P, K, Ca, Mg, S…, các nguyên tố vi
lượng gồm có: Mn, Cu, Co, B…
3.2 Yếu tố môi trường
3.2.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng quan trọng nhất đến quá trình sinh trưởng, phát triển
của vi khuẩn. Trong thực tế, các vi sinh vật phát triển trong những điều kiện nhiệt
độ thay đổi liên tục chúng phải thích nghi theo các hướng khác nhau.
Tác động của nhiệt độ lên tế bào vi sinh vật khá phức tạp, nếu biên độ nhiệt ngoài
tác động mạnh, các enzyme sẽ biến tính, khi đó, các phản ứng sinh hóa sẽ không
xảy ra.6. Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng rất mạnh đến môi trường, làm thay đổi
hoạt tính hóa lý của môi trường. Sự thay đổi này tác động mạnh đến quá trình vận
chuyển vật chất của tế bào. Nếu nhiệt độ tăng nhanh và đột ngột, vi khuẩn sẽ chết,
nhiệt độ thấp không làm chết vi sinh vật mà sẽ làm hạn chế quá trình trao đổi chất
của tế bào [13].
Đối với nhóm vi khuẩn nitrat hóa, nhiệt độ tối thích cho quá trình sinh trưởng,
phát triển là từ 25-30
0

C. Theo nhiều nghiên cứu, ở 18
0
C tỉ lệ sinh trưởng giảm 50%
và giảm 70% nếu nhiệt độ giảm xuống 13-14
0
C. Khi nhiệt độ môi trường ở mức
4
0
C, mọi hoạt động của vi khuẩn nitrat sẽ ngừng hẳn và chúng sẽ chết nếu nhiệt độ
giảm xuống 0
0
C hoặc vượt quá 49
0
C [21].
3.2.2 pH
pH của môi trường có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng và phát triển của
vi sinh vật. Các ion H
+
và OH
-
là hai ion hoạt động nhất trong số các ion, những
biến đổi dù nhỏ trong nồng độ của chúng cũng có những ảnh hưởng mạnh mẽ. Vậy
việc xác định pH phù hợp trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật là rất quan
trọng.Các giá trị ph cần cho vi khuẩn tương ứng với các giá trị pH cần cho hoạt
động của các enzym. Vi khuẩn nitrit và nitrat hóa rất nhạy cảm với điều kiện pH
thấp, sự sinh trưởng của chúng diễn ra ở điều kiện dinh dưỡng và môi trường kiềm
trong khoảng pH từ 7,5-8,0. Trong môi trường lỏng, sự sinh trưởng hạn chế ở pH
dưới 6,5 đối với vi khuẩn nitrit hóa và ngừng hoạt động khi pH thấp dưới 5,5 [14].
Vì vi khuẩn nitrat hóa là những loài tự dưỡng hóa học, lấy năng lượng từ quá
trình oxi hóa amôn thành nitrit, nên khi quá trình oxi hóa amoniac bị hạn chế bởi pH

sẽ dẫn đến giảm mạnh tỉ lệ sinh trưởng của vi khuẩn nitrat hóa như Nitrosomonas và
Nitrobacter [14].
3.2.3 Oxi
Oxi là một yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh
vạt hiếu khí. Vi sinh vật chỉ sử dụng oxi hòa tan trong môi trường lỏng trong khi
lượng oxi hòa tan trong nước thường rất ít và tế bào sử dụng oxi để hô hấp luôn làm
giảm lượng oxi trong môi trường. Vì thế khi nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí phải cung
cấp oxi một cách đều đặn. Thiếu oxi ở một khu vực nào đó trong môi trường sẽ phá
vỡ sự trao đổi chất trong tế bào, phải cung cấp sao cho tốc độ hòa tan của oxi bằng
tốc độ sử dụng oxi của vi sinh vật [14].
Đối với nhiều vi sinh vật, sự tăng thông khí đến giới hạn nhất định sẽ làm tăng
tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm tàng, nâng cao lượng sinh khối.Tuy nhiên, khi
hàm lượng oxi hòa tan quá cao lại có tác dụng kìm hãm quá trình sinh trưởng của vi
sinh vật. Khi đó, hiệu suất nuôi cấy và thu sản phẩm sẽ giảm [8].
1.4Nguồn gốc chủng
Nguồn gốc chủng phải rõ ràng, giống phải thuần chủng, đảm bảo các đặc tính
sinh học, đáp ứng được yêu cầu của quá trình lên men, tránh bị tạp nhiễm bởi các
loài vi sinh vật khác làm ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình lên men.
1.5Tỉ lệ giống
Yêu cầu quan trọng của giai đoạn nhân giống là đảm bảo cung cấp lượng giống
cần thiết vừa đủ. Nếu lượng giống cấy vào ít sẽ làm cho thời gian lên men kéo dài
và dễ bị nhiễm, còn nếu lượng giống quá nhiều, mật độ vi sinh vật quá dày, vi sinh
vật sẽ nhanh chóng sử dụng hết chất dinh dưỡng trong môi trường và quá trình lên
men chuyển sang pha thứ 3 sớm vì vậy không tích lũy được các sản phẩm cần
thiết, làm giảm hiệu suất quá trình lên men. Thông thường lượng giống đưa vào
quá trình lên men chiếm khoảng 1-10% tổng thể tích dịch lên men.
1.6Thiết bị lên men
Trong công nghệ lên men vi sinh vật, thiết bị lên men là một yếu tố vô cùng
quan trọng. Trong quá trình nuôi cấy, vi sinh vật sống trong điều kiện vô trùng
tuyệt đối nhưng vẫn được cung cấp đầy đủ oxy hòa tan và môi trường nuôi cấy cho

vi sinh vật hô hấp. Trong lên men công nghiệp, thiết bị lên men gọi là Fermentor
(nòi lên men), đây là thiết bị lên men có dung tích từ chục đến hàng ngàn lít, được
làm bằng thép không gỉ, có hệ thống đo lường và điều chỉnh nhiệt độ, pH, oxy hòa
tan.
Thiết bị lên men phải được vô trùng trước khi đưa vào sử dụng, Thường nồi lên
men được thanh trùng bằng hơi nóng với áp suất 1atm, 121
0
C trong 45 phút. Đòng
thời tất cả các hệ thống ống dẫn, khớp nối, van, phin lọc và tất cả các thiết bị phụ
trợ khác cũng phải được khử trùng nghiêm ngặt. Không khí thường được khử trùng
sư bộ sau đó qua màng lọc vô trùng hay màng siêu lọc.
Fermentor có hệ thống Panel điều khiển các thông số trong quá trình nuôi cấy,
cánh khuấy trộn, thổi khí bề mặt và sục khí. Fermentor có bọ phận điều khiển, các
thành phần cảm biến để giám sát nhiều thông số như nhiệt độ, pH, oxy hòa tan…
và điều chỉnh các giá trị cho phép.
1.7Tốc độ khuấy
Trong các hệ thống lên men có các cánh khuấy đảo để tăng cường sự tiếp xúc
giữa tế bào vi sinh vật với môi trường dinh dưỡng đồng thời ngăn cản sự kết lắng
của các tế bào vi sinh vật. Nhờ sự khuấy đảo mà vi sinh vật phân bố đều khắp rong
môi trường dinh dưỡng, làm tăng quá trình trao đổi chất của vi sinh vật, từ đó tăng
hiệu suất của quá trình lên men.
Khi các cánh khuấy trộn sẽ làm tăng khả năng hòa tan của oxi trong không khí
đưa vào môi trường nuôi cấy, giúp vi sinh vật sử dụng dễ dàng hơn.
Khuấy trộn đều môi trường nuoi cấy là điều kiện cần thiết để đảm bảo cung cấp
đầy đủ các chất dinh dưỡng, và hạn chế chất độc trong quá trình chuyển hóa lên
men. Khuấy trộn có thể làm ảnh hưởng đến tỉ lệ trao đổi oxi trong môi trường lên
men và làm tăng nhiệt độ do sự ma sát. Sự khuấy trộn quá mức sẽ làm ảnh hưởng
đến tế bào vi sinh vật, do đó cần điều chỉnh hợp lý để không ảnh hưởng xấu đến tế
bào vi sinh vật.
Nitrobacter sp. là vi khuẩn hiếu khí ví vậy trong thời gian nuôi cấy cần điều

chỉnh tốc độ khuấy thích hợp để cung cấp đủ oxi cho vi khuẩn. Đồng thời trong
quá trình phát triển của Nitrobacter sp., mật độ tế bào thay đổi qua các pha nên cần
điều chỉnh tốc độ khuấy phù hợp cho vi khuẩn phát triển tốt nhất.
1.8 Lưu lượng thông khí
Lưu lượng thông khí là lượng oxi cung cấp vào nồi lên men. Tùy thuộc vào vi
sinh vật khác nhau và giai đoạn lên men khác nhau mà cần cường độ thông khí
khác nhau.
PHẦN 2
VẬT LIỆU
VÀ
PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1 Chủng giống
Chủng giống Nitrobacter sp. do phòng thí nghiệm vi sinh, khoa sinh học,
trường đại học Đà Lạt cung cấp.
2.1.2 Môi trường
2.1.2.1 Môi trường Winogradsky
Thành phần
NaNO
2
1g
K
2
HPO
4
0,5g
MgSO
4
.7H

2
O 0,3g
Na
2
CO
3
1g
NaCl 0,5g
FeSO
4
0,1g
Nước cất vừa đủ 1000ml
Agar 18g
2.1.2.2 Môi trường Hottinger
Thành phần
Pepton 1,5g
NaCl 3g
Glucose 1g
Na
2
HPO
4
2g
Na
2
SO
3
0,5g
Nước cất vừa đủ 1000ml
Agar 20g

2.1.3 Hóa chất
2.1.3.1 Nước muối sinh lý
NaCl 8,5g
Nước cất vừa đủ 1000ml
2.1.3.2 Thuốc thử Griess I
Axit sunfanilic 0,5g
Axit axetic 150ml
2.1.3.3 Thuốc thử Griess II
Napthylamin 05g
Axit axetic 150ml
Nước cất 50ml
2.1.3.4 Thuốc nhuộm Gram
• Tím gentian
Tím gentian 1g
Cồn 96
0
10ml
Phenol 5g
Nước cất 100ml
• Dung dịch Lugol
Iodine tinh thể 1g
KI 2g
Nước cất 200ml
• Fucshin
Cồn 96
0
10ml
Fucshin kiềm 0,3g
Phenol 5g
Nước cất 95ml

2.1.4 Dụng cụ
Đĩa petri
Ống nghiệm
Bình tam giác
Cốc đong, ống đong
Que cấy vô trùng, đèn cồn, pipete, lam kính
2.1.5 Thiết bị
Tủ cấy vô trùng Laminar- Aura V130 Ehret.
Tủ lạnh HITACHI
Tủ ấm Memmert
Tủ sấy Memmert
Nồi lên men 10lít - Chemap Fermenter
Nồi hấp thanh trùng Hyrayama