NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH




ĐẶNG THỊ MAI PHƯƠNG






NGHIÊN CỨU SỰ TỔNG HỢP CẢM ỨNG PECTINASE
Ở MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS



Chuyên ngành: Vi Sinh Vật Học
Mã số: 60 42 40



LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC




NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS-TS: PHẠM THỊ ÁNH HỒNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2010
THƯ
VIỆN

Lời cảm ơn

Để có được kết quả của luận văn này, em xin gởi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc
đến:
PGS-TS PHẠM THỊ ÁNH HỒNG
Đã đưa ra phương hướng, mục tiêu cũng như hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em trong suốt quá
trình thực hiện luận văn này.
Em xin gởi lời cảm ơn đến:
Anh TRẦN QUỐC TUẤN
Đã luôn động viên và hỗ trợ em rấ
t nhiều trong công việc.
Em vô cùng biết ơn các Thầy Cô khoa Sinh, trường Đại Học Sư Phạm tp Hồ Chí Minh, đặc biệt là
TS. TRẦN THỊ THANH THỦY, đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và dành cho em sự giúp đỡ quý
báu trong quá trình thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn lớp cao học vi sinh K18 đã cùng tôi học tập,
động viên và có những trợ giúp cần thiết đúng lúc cho tôi.
Cuối cùng, con xin gởi lời biế
t ơn vô hạn đến Ba Mẹ đã yêu thương và luôn ủng hộ con tiếp bước trên

con đường học vấn của mình.
















Tôi xin cam đoan các số liệu được trình bày trong phần kết quả
của luận văn này là do chính bản thân tôi thực hiện không sao chép
của người khác.


Đặng Thị Mai Phương
MỞ ĐẦU


Đã từ lâu enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học và nghiện
cứu khoa học. Việc nghiên cứu và sử dụng các chế phẩm enzym có ý nghĩa rất lớn vì nó thúc đẩy các quy
trình sản xuất, rút ngắn thời gian sản xuất, tối ưu hóa chất lượng sản phẩm, làm tăng hiệu xuất chế
biến,…Vì vậy nâng cao hiệu quả kinh tế cho người sử dụng.

Hiện nay ng
ười ta khai thác nhiều enzym từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản
xuất. So với nguồn khai thác enzym từ động vật và thực vật, nguồn enzym từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm
như hoạt tính enzym cao, thời gian tổng hợp enzym từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản
xuất rẻ tiền, có thể sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp.
Trong số các enzym thì pectinase có ứng d
ụng khá rộng rãi chỉ sau amylase và protease. Trong ứng
dụng, pectinase được chia làm hai nhóm chính là: pectinase acid và pectinase kiềm. Pectinase acid chủ
yếu được thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong li trích và chế biến các loại nước ép trái cây, rượu và tạo
ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được li trích chủ yếu từ vi khuẩn và dùng trong chế biến các cây
có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải và lên men trà, cà phê.
Nhằm đa dạng hoá nguồn cung cấp enzym pectinase từ vi sinh vật và nâng cao hiệu quả sinh tổng h
ợp
pectinase, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng pectinase của một số chủng
Bacillus ”.
Mục tiêu của đề tài:
- Nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp pectinase của một số chủng Bacillus
- Nâng cao hiệu quả hoạt động của chế phẩm enzym pectinase từ các chủng Bacillus được chọn.

Nội dung của đề tài bao gồm:
- Xác định đường kính vòng phân giả
i pectin của enzym pectinase từ sáu chủng Bacillus. Từ đó chọn
lọc một hoặc hai chủng có vòng phân giải lớn nhất
- Nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được trên những môi trường nuôi cấy khác nhau
(không có chất cảm ứng và có chất cảm ứng) để thu nhận enzym pectinase.
- Xác định và so sánh hoạt tính enzym pectinase trong canh trường vừa thu nhận được trong điều kiện
có và không có chất cảm ứng.

- Khảo sát loại nguyên liệu cảm ứng thích hợp nhất cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao.
- Kháo sát nồng độ chất cảm ứng tối ưu cho việc sinh tổng hợp enzym pectinase cao nhất.

- Từ các nghiên cứu trên, chọn loại nguyên liệu cảm ứng và thời gian nuôi cấy tối ưu cho việc sinh tổng
hợp enzym pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn.
- Khảo sát các điều kiện nuôi cấy khác(nhiệt độ, pH, nguồn nitơ) ảnh hưởng đến sinh tổng hợp
pectinase ở các chủng vi khuẩn được chọn.
- Tối ưu hoá các điều kiện nuôi cấy (nhiệ
t độ, pH, nguồn nitơ) bằng quy hoạch thực nghiệm nhằm thu
được sản lượng pectinase cao.
- Nuôi cấy thử nghiệm các chủng vi khuẩn Bacillus được chọn trên môi trường tối ưu hóa để kiểm tra
mô hình tối ưu.
- Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của enzym pectinase như: pH, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, thời
gian phân hủy cơ chất và xác
định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại lên sự hoạt động của enzym.
- Tách chiết, thu nhận xác định hoạt tính, xác định hiệu xuất thu nhận, hiệu suất hoạt tính các chế phẩm
enzym pectinase từ canh trường nuôi cấy các chủng vi khuẩn Bacillus chọn lọc được.

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ENZYM PECTINASE
1.1.1. Giới thiệu chung
Lịch sử nghiên cứu pectinase bắt đầu từ khi người ta hiểu biết về cấu trúc pectin và cơ chế phân cắt
pectin của những enzym này. [44]
Trong nhiều thập niên gần đây việc sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở nên phổ biến. Nhiều vi
sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đều có khả năng sản xuất enzym pectinase. Người ta cũng đã
chứng minh rằng: pectinase là một enzym cảm ứng có thể được sản xuất từ nhiều nguồn cacbon khác nhau
(Aguilar, 1987; Maldonado, 1989; Frieddrich, 1994; Nair, 1995; Nair, 1997). [44]
Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử người ta đã đẩy mạnh nghiên cứu việc tạo dòng và biểu
hiện gen của enzym pectinase trong các tế bào chủ khác nhau (Whitehead, 1995; Surgey, 1996; Dalbogre,
1997; Yakoby, 2000); Tuy nhiên, tế bào chủ được sử dụng nhiều nhất vẫn là Saccharomyces (Gognies,
1999; Gognies, 2001) [44]
Enzym pectinase là một nhóm enzym thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm tạo thành là acid

galacturonic, galactose, methanol… Đ
ây là nhóm enzym thứ ba được ứng dụng rộng rãi sau amylase và
protease. [9]
Enzym pectinase được tìm thấy ở thực vật bậc cao và vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao, pectinase có
nhiều trong lá, củ khoai tây, trong chanh, cà chua, cỏ ba lá. Trong các loại cỏ khác thường chỉ có enzym
pectinesterase.[16]
Nhiệt độ tối ưu của enzym pectinase thường khoảng 45-55
0
C[52]
1.1.2. Các nghiên cứu trong và ngoài nước
 Nghiên cứu trong nước
Đã có nhiều đề tài nghiên cứu trong nước về enzym pectinase, các hướng nghiên cứu tập trung về
cảm ứng, thu nhận, khảo sát các đặc tính, tinh sạch, cố định, và ứng dụng enzym pectinase trên đối tượng
chủ yếu là vi nấm, đặc biệt từ Aspergillus.
 Nghiên cứu ngoài nước
Pectinase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới với nhiều khía cạnh rất đa dạng, trong đó điều
hoà sinh tổng hợp enzym pectinase cũng được nghiên cứu và đựơc đăng trên nhiều tạp chí.
Việc nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase được tiến hành nhiều trên đối tượng khác
nhau như: Fusarium oxysporum (Guevara, 1997), Aspergillus japonicus (Maria, 2000), Botrytis cinerea
(Wubben, 2000), Rhizopus stolonifer (Blandino, 2001), Aspergillus awamori (Blandino, 2001),
Penicillium viridicatum (Dênis, 2002), Trichoderma reesei (Lisbeth, 2003), …Tuy nhiên đối tượng được
nghiên cứu nhi
ều nhất vẫn là Aspergillus niger (Aguillar, 1987; Maldonado, 1989; Solis-Pereira, 1993;
Taragano, 1997; Caltisho, 2000). [18], [21], [22], [24], [27], [32], [34], [37], [45], [48]
Ngày nay cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ gen, đa số các chủng vi sinh vật
dùng trong nuôi cấy thu nhận enzym pectinase đều là những chủng đột biến (Antier, 1993; Octavio, 1999;
Bai, 2004). Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành nhằm làm tăng sinh tổng hợp enzym pectinase của
các chủng vi sinh vật như: Couri và công sự (1995) đã nghiên cứu “ Sự thao tác gen trên chủng
Aspergillus nhằm làm tăng sự sinh tổng hợp các enzym phân giải pectin “ hay Solis( 1997)
đã “ Cải thiện

việc sản xuất pectinase dùng các thể lai giữa các chủng Aspergillus” . [20], [23], [39], [46]
Qua nghiên cứu các tác giả đều nhận thấy rằng các nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy
khác nhau sẽ gây ra ảnh hưởng khác nhau đến sự sinh tổng hợp enzym pectinase (Leone, 1987; Solis-
Pereira, 1993; Lisbeth, 2003). Enzym pectinase được tổng hợp cảm ứng mạnh trên môi trường có bổ sung
pectin hay acid polygalacturonic và sự tổng hợp này bị hạn chế khi môi trường giàu acid galacturonic
hoặc glucose (Asguilar, 1987; Taragano, 1997, Guevara, 1997). [18], [27], [31], [32], [45], [48]
Theo thời gian ngu
ồn cacbon sử dụng trong nuôi cấy nghiên cứu sự tổng hợp cảm ứng enzym
pectinase cũng thay đổi. Vào những năm 90 các tác giả chủ yếu sử dụng các nguồn cabon tinh khiết và bổ
sung riêng lẻ từng nguồn cacbon vào môi trường nuôi cấy (Aguillar, 1987; Leone, 1987). Năm 2000,
trong công trình nghiên cứu ”Ảnh hưởng các nguồn cacbon khác nhau đến sự sinh tổng hợp pectinase của
Aspergillus japonicus 586”, Maria và cộng sự đã kết hợp nhiều nguồn cacbon vào cùng một môi trường
nuôi cấy như
: pectin và glucose, pectin và glycerol,...gần đây các nghiên cứu đều hướng tới sử dụng các
phế liệu, các chất thải công nông nghiệp để làm nguồn cơ chất sinh tổng hợp cảm ứng enzym pectinase
(Castilho, 2000; Blandino, 2001; Denis, 2002) [8],[21], [22], [24], [31], [37]
1.1.3. Cơ chất của enzym pectinase
Pectin là cơ chất của enzym pectinase. Pectinase rất phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt trong giới
thực vật.
Về phương diện hoá học, pectin là polisaccharid dị thể mạch thẳng, mạch chính của phân tử do các
acid galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết - 1,4 glucosid tạo nên. Các mạch bên của phân tử pectin
gồm có rhamnose, arabinose, galactose và xylose. Các nhóm carboxyl
*
của acid galacturonic có thể được
ester hoá một phần bằng các nhóm methyl và được trung hòa một phần hay hoàn toàn bằng các ion Na
+
,
K
+
hoặc NH

4
+
, hay bị decacboxyl hoá …[30]
Công thức nguyên của acid galacturonic: C
6
H
10
O
7

Công thức cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo phân tử pectin được giới thiệu ở hình
1.1.









Hình 1.1:
Cấu tạo của acid -galacturonic và khung cấu tạo của pectin
Dựa vào loại biến đổi của khung sườn chính mà pectin được phân loại thành protopectin, acid
pectic, acid pectinic, và pectin ( Be Miller, 1986). [30]
 Protopectin
Đây là dạng pectin nguyên thuỷ. Khi thuỷ phân giới hạn protopectin sẽ tạo ra pectin hay acid
pectinic. Đôi khi, protopectin còn là một thuật ngữ dùng để mô tả các hợp chất không tan trong nước được
tìm thấy trong các mô thực vật ( Kilara, 1982). [30]
Protopectin là thành phần quan trọng của các chất gian bào, làm nhiệm vụ liên kết giữa các tế bào

thự
c vật với nhau. Dưới tác dụng của acid (dung dịch HCl 0.03%), enzym protopectinase hay khi đun sôi,
protopectin chuyển hoá thành pectin hoà tan. [16]
 Acid pectic ( acid polygalacturonic)
Acid pectic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl không đáng kể. Dạng
muối của acid pectic gọi là pectat.
 Acid pectinic
Acid pectinic là các galacturonan có chứa hàm lượng các nhóm methoxyl cao. Dạng muối của
acid pectinic gọi là pectinat ( Kilara, 1982). Acid pectinic khi tồn tại riêng lẻ có một đặc tính rất độc đáo là
hình thành dạng geo với đường và acid, hoặc với một số hợp chất khác như muối canxi( nếu hàm lượng
methyl vừa đủ thấp)[30]
 Pectin
Pectin là tên chung để chỉ một hỗn hợp g
ồm nhiều thành phần khác nhau mà trong đó acid pectic
là thành phần chủ yếu. [30]
Bảng 1.1
: Hàm lượng pectin trong các loại trái cây [55]
Trái cây
Hàm lượng pectin
(% trọng lượng tươi)
Táo 0,71-0,84
Chuối 0,59-1,28
Cà rốt 1,17-2,29
Nho 0,09-0,28
Bưởi 3,30-4,50
Chanh 2,80-2,99
Cam 2,34-2,38
Mơ 0,71-1,32

1.1.4. Phân loại[30]
Dựa vào đặc điểm của cơ chất và cơ chế phân cắt, enzym pectinase được chia thành 3 nhóm chính:
- Pectinesterase
- Các emzim khử mạch polymer
- Protopectinase
Sơ đồ 1.1
: Sơ đồ phân loại enzym pectinase[30]














1.1.5. Cơ chế hoạt động của enzym pectinase
 Trung tâm hoạt động của enzym pectinase
Enzym polygalacturonase(pectinase) chứa một vùng có 8-10 vòng xoắn kép β quay về phía phải;
trong đó 2 vòng sẽ tạo một khe liên kết với cơ chất. người ta nghiên cứu thấy rằng trung tâm hoạt động
của enzym này có chứa 2 axit amin Aspartic và Lysine. Người ta cũng thấy rằng có một Histidine nằm
gần trung tâm hoạt động sẽ ảnh h
ưởng đấn khả năng xúc tác của enzym. [53]
1.1.5.1. Pectinesterase(PE)
Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử ester hoá nhóm methoxyl

của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid
galacturonic nằm bên cạnh acid galacturonic không bị este hoá. [30]




Pectinase
Pectinesterase

Emzim khử polymer
Protopectinase

PMG PG
PE PE PE
Hydrolase Lyase
PMGL PGL
Endo
-
PMG
Exo
-
PMG
Endo
-
PG
Exo
-
PG
Endo
-

PMGL
Endo
-
PGL
Exo
-
PGL
Exo
-
PMGL
Hình 1.2: Cơ chế hoạt động của enzym pectinesterase(PE) [13]
1.1.5.2. Protopectinase
Protopectinase hoà tan protopectin, tạo thành các pectin hoà tan có mức độ polymer hoá cao. [30]
1.1.5.3. Các enzym khử mạch polymer
Chia làm 2 tiểu nhóm:
a. Enzym thủy phân liên kết glycoside( Hydrolase)
 Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin
có mức độ ester hoá cao. Polymethylgalacturonase gồm 2 loại:
- Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-glycosid của pectin.







Hình 1.3
: Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)[13]

-Exo-PMG: phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-glycosid của pectin từ đầu không khử của mạch pectin

Hình 1.4
: Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG)[13]

 Polygalacturonase(PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic (acid
polygalacturonic), gồm 2 loại:
- Endo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên
liên kết α-1-4-glycosid trong phân tử acid pectic


Endo-PMG
COOCH
3
COOCH
3
COOCH
3
Exo-PMG
COOCH
3

Hình 1.5
: Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG)[13]
- Exo-PG: còn gọi là poly(1,4-α-D-galacturonide) glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt
liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử.






Hình 1.6:
Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase (Exo-PG)[13]

b. Enzym cắt (Lyase):
Năm 1960, P.Abersheim, lần đầu tiên đưa ra thông báo về phân hủy phân tử pectin không bằng con
đường thủy phân. Enzym tham gia vào quá trình đó gọi là pectate lyase.
Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin( pectate lyase) được đưa ra như sau: các
pectate lyase sẽ đóng góp tối thiểu ba nhóm cấu trúc xúc tác: P+: vô hiệu hóa lực hút của nhóm
cacboxylic; B: là một căn cứ tách các proton từ C-5, và A: thực hiện công việc cuối cùng là chuyển giao
các proton đến các oxy glycosidic,
để lại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5.[69]





COOH

COOH

Endo-PG
COOH

COOH

COOH

Exo-PG
COOH









Hình 1.7
: Cơ chế hoạt động của các enzym lyase phân cắt pectin [69]
Các enzym lyase phân cắt pectin bao gồm:
 Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với
pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại:
- Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-
glycosid của pectin.
- Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin.
 Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic. Có 2 loại:
- Endo- PGL: còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4-
glycosid của acid pectic.

- Exo- PGL: còn gọ
i là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1-4-
glycosid của acid pectic từ đầu không khử.
1.1.6. Ứng dụng pectinase
Trong lĩnh vực ứng dụng, pectinase được chia làm 2 nhóm chính là : pectinase acid và peatinase
kiềm. Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, được dùng trong ly trích và chế biến các loại trái cây,
rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào. Pectinase kiềm được ly trích chủ yếu từ vi khuẩn được dùng trong
chế biến các loài cây có sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nướ
c thải, lên men trà, cà phê. [30]
Bảng 1.2
: Một vài ví dụ về pectinase acid và pectinase kiềm của vi sinh vật
Vi sinh vật Loại pectinase
Aspergillug niger CH4 Endo-pectinase
Exo-pectinase
Penicillium frequentans
Endo-PG
Sclerotium rolfsii
Endo-PG
Pectinases acid

Rhizoctonia solani
Endo-PG
Rhizoctonia solani
Endo-PG
Mucor pusilus PG PG
Clostridium thermosaccharolyticum
Polygalacturonate hydrolase
Bacillus sp. RKG PGL
Bacillus sp. NT-33 PG
Bacillus polymxa

PG
Bacillus pumilis
PATE
Amuloca sp.
Pectate lyase
Bacillus sp. P-4-N PG
Penicillium italicum
PMGL
Bacillus sp. DT7 PMGL PMGL
Pectinases kiềm

Bacillus subtilis
PAL
(Nguồn: Kashyap et al., 2001)
1.1.6.1. Ứng dụng trong công ngiệp nước ép trái cây và rượu vang
Pectinase được dùng rộng rãi trong công nghiệp nước ép trái cây và rượu vang. Pectinase được bổ
sung nhằm làm tăng hiệu suất li trích nước ép và làm trong nước ép trái cây. Trong công nghiệp nước ép
trái cây, người ta thường tạo ra hai loại nước ép là nước ép trong và nước ép đục (hay purée). Phương
pháp tạo nước ép trong thường dùng để tạo nước ép táo, lê, nho, dâu,… Phương pháp tạo nước ép đục
được dùng để sản xuất nước ép các loại citrus như
cam, chanh, bưởi và nước ép xoài, mơ, ổi, đu đủ, thơm
chuối,..

Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất nước ép trái cây[30]

















 Nước ép trong:
Trong quá trình sản xuất nước ép trong, enzym pectinase được bổ sung hai lần (xem sơ đồ 1.2):
+ Lần một: pectinase có tác dụng làm lỏng lẻo cấu trúc màng tế bào thực vật, giúp làm trong
hiệu quả li trích nước ép.
+ Lần hai: pectinase được bổ sung cùng với một số enzym khác (nếu cần thiết) nhằm làm
trong nước ép trái cây.
 Nước ép đục hay purée:
Quá trình sản xuấ

t nước ép đục chỉ cần bổ sung enzym pectinase một lần đầu tiên (xem sơ đồ 1.2)
nhằm làm tăng hiệu quả trích li nước ép. Để ổn định độ đục của nước ép, sau khi ép người ta xử lí nhiệt
dịch ép để làm bất hoạt enzym. [30]
1.1.6.2. Dùng làm mềm mô thực vật (Maceration) và cô lập protoplast
Trong chu trình sinh sản của thực vật, người ta không thể dùng phương pháp thao tác gen truyền
thống để đưa nhiều tổ hợ
p các đặc tính mong muốn vào tế bào. Ngày nay, người ta sử dụng một phương
pháp hiệu quả với thực vật bậc cao là dung hợp các protoplast( tế bào trần) cô lập từ tế bào soma(tế bào
sinh dưỡng) trong điều kiện invitro và sau đó phát triển nó thành thực vật lai. Đây có thể là một công cụ
Trái cây
Nghiền
Ép
Ly tâm
Ly tâm
Lọc
Cô đặc
Nước ép trái cây
Bổ sung pectinase
lần một
Bổ sung pectinase
lần một
Bổ sung các
enzym khác
hữu hiệu để làm tăng sự đa dạng gen và tổ hợp các đặc điểm không có trong tự nhiên
(Gleba, 1978)
Đầu tiên, người ta làm mềm mô thực vật bằng cách sử lí với enzym pectinase, sau đó tiếp tục xử lí
với enzym cellulase để chuyển mô này thành protoplast. Nồng độ của enzym là pectinase 0,5%(W/V) và
cellulase 5%(W/V), chỉnh pH 5,6 bằng HCl 2N
(Tanabe, 1968; Bock, 1983).[ 30]
1.1.6.3. Xử lí nước thải có chứa pectin

Nước thải từ công nghiệp chế biến các loại citrus rất giàu pectin. Lượ
ng citrus này chỉ bị vi sinh vật
phân hủy trong quá trình xử lí bùn (Tanabe và cộng sự, 1986). Năm 1987, Tanabe và cộng sự đã thử
nghiệm một quy trình xử lí nước thải mới bằng cách sử dụng những vi sinh vật ưa kiềm. Chủng Bacillus
sp. (GIR 621) được phân lập từ đất của họ có khả năng sản xuất ra enzym endopectat lyase ngoại bào
trong môi trường kiềm pH 10,0. Người ta chứng minh rằng chủng vi khuẩn này có khả năng loại b
ỏ hữu
hiệu pectin ra khỏi nước thải.
Erwinia carotovora cũng có khả năng tiết endopectat lyase, cũng có tác dụng xử lí nước thải giàu
pectin( Tanabe, 1986), tuy nhiên do chúng có khả năng gây bệnh thực vật nên người ta chỉ xử lí gián tiếp
bằng enzym phân giải pectin được sản xuất ra từ vi khuẩn này.
1.1.6.4. Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy
Việc làm giấy là một quá trình lọc liên tục các huyền phù và những phần mịn c
ủa sợi, các chất độn
vô cơ như đất sét, CaCO
3
để tạo thành các phiến giấy. Vì vậy quá trình lọc sẽ ngày càng bị hạn chế do
việc thoát nước qua các phiến lọc sẽ ngày càng giảm. Để giải quyết vấn đề này, người ta dùng các khung
lọc có kích thước đủ lớn, tuy nhiên những lỗ này cũng làm cho những phần mịn và những chất độn đi qua.
Trong công nghiệp làm giấy hiện đại người ta thêm một số chất trợ giúp thẩm tích vào bột giấy để

giữ những phần mịn và những chất độn trong các phiến giấy và làm tăng tốc độ thoát nước. Ngày nay,
công nghiệp giấy và bột giặt đã bắt đầu đùng enzym pectinase để giải quyết những vấn đề trên trong quá
trình sản xuất. [30]
Do enzym pectinase kiềm của Bacillus sp. và Erwinia carotovora có tác dụng làm mềm hóa mạnh
nên nó được dùng để giầm sợi libe của cây Misumata( Tanabe và Kobayashi, 1987). Những sợi libe đã
được giầm này đượ
c dùng để sản xuất giấy Nhật như giấy Washi, giấy Wagami, ..( Horikoshi, 1990). Hiệu
quả khi giầm bột giấy với vi khuẩn cao tương tự như phương pháp nấu với tro-soda thông thường. [43]
1.1.6.5. Ứng dụng trong quá trình trích li dầu thực vật

Trước đây, dầu từ hạt cây cải dầu (Canola), phôi dừa , hạt hoa hướng dương, hạt cọ, quả ôliu được
sản xuất theo kiểu truyền thống bằ
ng cách li trích dung môi hữu cơ. Dung môi thường được sử dụng là
hexan, một chất có khả năng gây ra ung thư. Ngày nay người ta sử dụng các enzym phân hủy vách tế bào
thực vật, trong đó hệ enzym pectinase , để li trích dầu thực vật theo phương pháp li trích với nước. Các
enzym này có tác dụng làm hóa lỏng các thành phần cấu trúc vách tế bào của cây có chứa dầu.
Gần đây enzym phân hủy vách tế bào đã được dùng trong quá trình li trích dầu ôliu. Các enzym
này được thêm vào trong quá trình nghiền hạt ôliu, do đó dầu được phóng thích ra dễ dàng trong quá trình
tiếp theo(West, 1996). Ví vậy, việc xử lí enzym làm tăng sản lượng của dầu ôliu. Sự tăng sản lượng này
phụ thuộ
c vào pH, nhiệt độ, và liều lượng enzym được dùng. [30]
1.1.6.6. Ứng dụng trong lên men trà và cà phê
Pectinase đóng vai trò quan trọng trong lên men trà, cà phê. Trong quá trình lên men cà phê, người
ta dùng các vi sinh vật phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhầy khỏi hạt cà phê( ba phần tư lớp vỏ nhầy này
là pectin). Enzym thương mại được phun vào hạt với liều lượng 2-10 g/tấn ở 15-20
0
C. Khi được xử lí với
enzym pectinase, giai đọan lên men của quá trình chế biến cà phê được thúc đẩy và giảm từ 40-80 giờ còn
khoảng 20 giờ. Do việc xử lí cá phê với enzym thương mại thì đắt và không kinh tế nên người ta dùng lớp
vỏ nhầy của cà phê thải ra để nuôi vi khuẩn sinh enzym pectinase. Canh trường sau khi lên men được lọc
và sau đó phun vào hạt ( Amorim, 1997; Carr,1985; Godfray, 1985).
Pectinase nấm mốc được dùng trong chế biến trà. Việc xử lí enzym thúc đẩy quá trình lên men mặc
dù liều lượng của enzym phả
i được đều chỉnh cẩn thận để tránh tổn hại đến lá trà. Việc thêm enzym
pectinase cũng cải thiện tính tạo bọt của bột trà bằng cách phân hủy pectin trà (Carr, 1985). [30]
1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS
1.2.1. Vị trí phân loại [51]
Cohn (1872) phân loại Bacillus như sau:
Bacillus thuộc Giới : Bacteria
Nghành : Firmicutes

Lớp : Bacilli
Bộ : Bacillales



Họ : Bacillaceae
Giống : Bacillus













Hình 1.8
: Đặc điểm hình thái của Bacillus[51]
1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo của vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là nhóm vi khuẩn gram dương, có hình que( trực khuẩn). Chúng có khả năng
hình thành nội bào tử có hình oval hoặc hình cầu. [51]
Bảng 1.3
: Đặc điểm các nhóm vi khuẩn Bacillus theo khoá phân loại của Priest [47]
Nhóm
% G +
C

Đặc điểm
bào tử
Đặc điểm sinh lí, sinh hoá Đại diện
I 38-54
Phình, hình
oval
Kỵ khí không nghiêm ngặt,
không lên men đường sinh axit
B. polymyxa
II 33-45
Không
phình, hình
oval
Hiếu khí hoặc hiếu khí không
nghiêm ngặt, không lên men
đường sinh axit
B. subtilis
III 39-55
Phình, hình
oval

Hiếu khí nghiêm ngặt, không
lên men đường sinh axit
B. brevis
IV 36-42
Phình, hình
cầu

Hiếu khí nghiêm ngặt, một số
lên men đường sinh axit

B. sphaericus
V

39-69
Phình hoặc
không, oval
Nhiệt độ thích hợp để phát
triển: 50
0
C
Themophiles
VI 52-60 Chịu nhiệt, chịu axit
AlicycloBacillua
1.2.3. Đặc điểm sinh thái của Bacillus
 Sự phân bố của vi khuẩn Bacillus
Phần lớn vi khuẩn Bacillus cư trú trong đất. Một số sống hoại sinh, chúng tiết ra những enzym thuỷ
phân cellulose, tinh bột, glucan, pectin và protein. Đại đa số vi khuẩn này thuộc nhóm B. subtilis ( B.
cereus, B. licheniformis, B. megaterium, B. pumilus, B. subtilis) và nhóm B. sphaericus. Số lượng vi
khuẩn Bacillus quyết định độ phì của đất. Thông thường, đất trồng trọt chứa khoảng 10- 100 triệu cfu/1g.
Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang, vi khuẩn Bacillus rất hiếm. Ngoài những vi khuẩn
kể trên, trong đất giàu dinh dưỡng còn có các loài: B. alvei. B. macerans, B. polymyxa. Sự có mặt của vi
khuẩn sinh bào tử gắn liền với tính chất đặc trưng của chúng. Ví dụ: trong đất kiềm, có nhiều vi khuẩn ưa
kiềm, vi khuẩn ưa nhiệt chiếm ưu thế ở những vùng đất có nhiệt độ cao.[49]
Nước và bùn cửa sông có mặt bào tử và tế bào Bacillus, phần lớn là Bacillus nhóm II, đặc biệt B. firmus,
và B. lentus thường đượ
c phân lập từ nước chứa nhiều natri clorua. Tuy nhiên, số lượng vi khuẩn loại này
thường rất ít, nhất là những nơi có nồng độ muối khá cao.
Bacillus có mặt ở đại dương tiêu biểu B. firmus, B. licheniformis, B. subtilis và B. marinus.
 Bacillus ưu nhiệt, ưa lạnh, ưa kiềm, ưa axit
Một trong những đặc điểm hấp dẫn và lôi cuốn sự chú ý đến vi khuẩn Bacillus trong lĩnh vực công

nghệ sinh họ
c là khả năng chịu nhiệt, chịu lạnh, chịu axit, chịu kiềm của chúng. Ngay từ đầu thế kỉ, nhiều
Bacillus ưu nhiệt đã được mô tả và phân loại. Theo Gordon[42], Bacillus ưu nhiệt có tên B. coagulans, B.
stearothermophilus, B. brevis, B. kaustophilus, B. thermodenitrificans. Từ lâu, enzym Bacillus đặc biệt là
-amylase của Bacillus ưa nhiệt được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm và công
nghiệp dệt [3]. Enzym của Bacillus ưu nhiệt thường chịu được nhiêt độ cao hơn enzym của Bacillus ưu
nhiệt trung bình (trừ -amylase chịu nhiệt của B. licheniformis). Nhiều enzym chịu nhiệt đã được đưa ra
thị trường như: protease trung tính, lipaza, pullulanaza. Người ta cũng tách được dòng gen tổng hợp -
amylase của B. stearothermophilus và biểu hiện tính trạng di truyền trong vi khuẩn ưu nhiệt trung bình
giúp giải quyết nhiều vấn đề trong lên men công nghiệp. Bởi thế Bacillus
ưu nhiệt là đối tượng nghiên
cứu trong nhiều lĩnh vực: sản phẩm công nghệ, tách dòng gen, nguồn gen có lợi.
Đối lập với Bacillus ưu nhiệt, Bacillus ưa lạnh ít được quan tâm hơn. Nhiệt độ để phát triển thích
hợp của Bacillus ưa lạnh là: 0-15
0
C, cao nhất: 20
0
C.
Bacillus có khả năng phát triển trong môi trường có pH cao (8-9) được gọi là Bacillus ưa kiềm. Đối
với Bacillus ưa kiềm bắt buộc, pH thích hợp: 10 hoặc cao hơn. Chúng không phát triển trong môi trường
có pH trung tính. Ứng dụng chính của nhóm Bacillus ưa kiềm trong lĩnh vực công nghệ sinh học là sản
xuất enzym công nghiệp. Protease của B. licheniformis có những tính chất như: chịu nhiệt, chịu pH và
chịu tác nhân oxy hoá được ứng dụng trong công nghiệp sả
n xuất bột giặt, chất tẩy.
1.2.4. Đặc điểm sinh lí của Bacillus
Phần lớn Bacillus là những vi khuẩn dị đưỡng hoá năng, thu năng lượng do oxy hoá các hợp chất
hữu cơ. Một số vi khuẩn ưa nhiệt tự dưỡng không bắt buộc:
(B. schlegelli) có khả năng phát triển trong môi trường chỉ có CO
2
và CO là nguồn cacbon duy nhất. Một

số loài Bacillus (B. subtilis) có khả năng sử dụng các chất vô cơ, trong khi một số loài khác (B.
sphaericus, B. cereus) cần các hợp chất hữu cơ (vitamin, axit amin) cho sự sinh trưởng. Đặc biệt Bacillus
gây bệnh côn trùng (B. popilliae, B. lentimorbus) có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng không phát triển
trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: NA, NB. [19]
1.2.4.1. Quan hệ với oxy
Bacillus có khả năng phát triển và sinh bào tử trong điều kiện hiếu khí, trao
đổi năng lượng thông
qua quá trình lên men hoặc hô hấp hiếm khí.
Phần lớn Bacillus nhóm I kỵ khí không bắt buộc, lên men hầu hết các loại đường. Bacillus nhóm II
phần lớn hiếu khí, chỉ một vài loài lên men. B. licheniformis lên men glucoza, sản phẩm chính của quá
trình lên men glucoza là : butanediol, glycerol, ethanol, format, acetat, succinate, pyruvat và CO
2
. B.
cereus và B. thurigiensis cũng có khả năng lên men glucoza, tạo ra butanediol và acid. Riêng B. subtilis
rất bí ẩn, chúng là những vi khuẩn hiếu khí nghiêm ngặt nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi
trường thiếu oxy, sinh axetoin và 2,3-butaediol từ pyruvat bằng con đường axetolactat. Chúng cũng có thể
tái sinh NAD
-
từ phản ứng axetoin thành butanediol. Đến nay vẫn chưa giải thích lý do tại sao chúng
không phát triển mạnh trong điều kiện kỵ khí như B. cereus hoặc B. licheniformis.
Bacillus nhóm III và VI nhìn chung hiếu khí bắt buộc, không phát triển khi thiếu oxy, nhưng một vài
loài khử nitrat bằng phản ứng nitrat kỵ khí.
1.2.4.2. Chuyển hoá cacbon
Nhiều loài Bacillus tiết enzym ngoại bào chịu trách nhiệm chuyển hoá các hợp chất cao phân tử
trong môi trường (những chất không thể chuyển vào tế
bào vì quá lớn) thành các chất có trọng lượng phân
tử thấp làm nguồn cabon và năng lượng. Một số enzym ngoại bào phổ biến của Bacillus được tóm tắt ở
bảng 1.3. Amylase và protease có lẽ là hai nhóm enzym quan trọng nhất của chủng Bacillus.

Bảng 1.3: Một số enzym ngoại bào của Bacillus[38], [40]
Enzym Tên chủng Bacillus
-Amylase
B. amyloliquefaciens, B. caldolyticus, B. coagulans
B. licheniformis, B. macerans, B. stearothermophilus
B. subtilis, B. subtilis var. amylosacchariticus, Alkalophilic
Bacillus spp.
β-Amylase
B. megaterium, B. polymyxa, Alkalophilic Bacillus spp.
Cellulase
B. subtilis, B. brevis, B. firmus, B. polymyxa, B. pumilus
B. subtilis
Chitinase
B. circulans
Chitosanase
Bacillus sp. R-4
Pectate lyase
B. circulans, B. polymyxa, B. pumilus, B. sphaericus
B. stearothermophilus, B. subtilis, Alkalophilic Bacillus
spp.
Xylanase
B. amyloliquefaciens, B. firmus, B. polymyxa, B. subtilus
B. subtilis var. amylosacchariticus
Alkalophilic
protease

Alkalophilic Bacillus spp.

Serine-metal
protease
B. licheniformis, B. pumilus
Serine protease
B. licheniformis, B. pumilus, B. subtilis
B. subtilis var. amylosacchariticus


Metal protease

Metal protease
B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. licheniformis
B. megaterium, B. polymyxa, B. subtili,
B. subtilis var. amylosacchariticus
B. thermoproteolyticus, B. thuringiensis
Halophilic
protease
Bacillus sp.
Esterase
B. subtilis
Aminopeptidase
B. licheniformis, B. subtilis
Tổng hợp enzym ngoại bào của Bacillus được điều khiển bởi cơ chế kiểm tra phức tạp. Hệ thống 2
thành phần protein DegS/DegU kiểm tra tổng hợp enzym ngoại bào (-amylase, β- glucanase, cellulase,
xynalase và protease) của Bacillus subtilis và những loài khác đã được công bố[17], [26]. Đường phân tử
thấp trong môi trường có thể là sản phẩm của hoạt động enzym ngoại bào được chuyển vào tế bào B.
subtilis bằng những con đường khác nhau. CPTS (cabohidrat phosphotransferase system) là h
ệ thống
chính chuyển đường vào tế bào. CPTS gồm hai thành phần : protein nguyên sinh chất và protein đặc
trưng đường (sugar-specific protein) ở trong màng. Trong một số trường hợp khác, đường chuyển vào tế

bào dưới dạng đường photphat [28] . Những loại đường chuyển vào tế bào bằng CPTS: fructose, sucrose,
manitol. Những loại đường không chuyển vào tế bào bằng con đường CPTS: arabinose, glucose, glycerol,
maltose, sorbitol, xylose. Riêng đường mannose, raffinose và salicin chuyển vào tế bào chưa được nghiên
cứu chi tiết. B. sphaericus và một số loài nhóm III và IV hiếu khí nghiêm ngặt chúng không chuyển hoá
hidrat cacbon. Nhiều enzym tham gia quá trình chuyển hoá con đường Embden-Mayerhof không có trong
loài B. sphaericus. Thực tế B. sphaericus không thể chuyển hóa hoặc vận chuyển đường hexose hay
đường pentose, chúng sử dụng axetat và axit hữu cơ làm nguồn cacbon và năng lượng.
1.2.5. Một vài ứng dụng quan trọng của Bacillus
1.2.5.1. Độc tố diệt côn trùng
Một số Bacillus có khả năng tổng hợp thể vùi bào tử bên trong quá trình hình thành bào t
ử. Thể vùi
được cấu thành từ tiền độc tố protein (có tên -endotoxin đối với B. thuringiensis). Thể vùi có hình dạng
và kích thước khác nhau. Khi côn trùng ăn phải thể vùi(thường là bào tử), chúng được hòa tan và tiền độc
tố trở thành độc tố làm cho ấu trùng ngừng ăn và cuối cùng chết.
 Bacillus tổng hợp độc tố diệt côn trùng
B. popilliae là một trong những Bacillus sinh độc tố diệt côn trùng được nghiên cứu và ứng dụng
đầu
tiên [19]. Thực tế B. popilliae chỉ có thể phát triển và sinh bào tử trong ruột ấu trùng bị nhiễm, nhưng
người ta cho rằng loài vi khuẩn này tồn lưu liên tục trong đất.
B. sphaericus sinh độc tố kép gồm 2 polipeptid có tác dụng gây độc với ấu trùng của một số loài
muỗi [29] . Protein này được tổng hợp trong quá trình hình thành bào tử giống protein tiền độc tố của B.
thuringiensis.
Phần lớn các nghiên cứu đang tiến hành với các chủ
ng thuộc loài B. thuringiensis sinh protein thể
vùi trong quá trình hình thành bào tử. Thể vùi có hình dạng khác nhau(hình tháp, hình thoi, hình oval).
Ngay cả trong cùng một chủng, đôi khi cũng xuất hiện thể vùi dưới dạng khác nhau. Khi ở thể dinh
dưỡng, thể vùi nằm kề với bào tử, nhưng ở một vài chủng, chúng nằm ở màng ngoài của bào tử [33] .
Trong tất cả các trường hợp, khi tế bào bị tan, thể vùi và bào tử đều thoát ra ngoài. Phần lớn các chủng B.
thuringiensis phân lập được ngiên c
ứu về tác dụng gây bệnh với côn trùng bộ cánh vảy, nhưng một số tiền

độc tố cũng có tác dụng với bộ hai cánh, bộ cánh cứng và có thể cả giun tròn [35]. Bên cạnh đó, một vài
chủng B. thuringiensis tiết độc tố - exotoxin bản chất không phải protein. Độc tố này được thử nghiệm
với ruồi và không được ứng dụng rộng rãi như -endotoxin.
1.2.5.2. Kháng sinh polipeptid của Bacillus
Sự hình thành bào tử của Bacillus thường xảy ra đồng thời với quá trình sinh hóa khác như tổng hợp
protein tinh thể trong trường hợp B. sphaericus, B. thuringiensis hay tổng hợp một số chất kháng khuẩn
bản chất polipeptid (baxitraxin, tyroxidin, gramixidin, polymixin). Nhiều kháng sinh polipeptid được mô
tả chi tiết về tính chất hóa học và chức năng. Căn cứ vào thành phần cấu tạo và chức năng tác dụng mà
người ta chia kháng sinh polipeptid thành 3 lớp:
- Adeine: kháng sinh polipeptid mạch thẳng, ứ
c chế sinh tổng hợp màng tế bào vi khuẩn
- Baxitraxin:kháng sinh mạch vòng, có tác dụng ức chế sinh tổng hợp màng tế bào.
- Gramixidin, polymixin, tyroxidin: cấu trúc mạch thẳng hoặc vòng có tác dụng sửa đổi cấu tạo và chức
năng của màng [36]
Baxitraxin là nhóm quan trọng nhất. Baxitraxin là một loại kháng sinh bản chất polipeptid gồm 12
loại axit amin được tổng hợp từ loài vi khuẩn B. licheniformis và B. subtilis. Baxitraxin bao gồm các đơn
vị baxitraxin riêng rẽ có kí hiệu A, A1, B, C, D, E, F1, F2, F3, G, trong đ
ó baxitraxin A chiếm phần lớn
(37%)trong các chế phẩm được tạo ra bằng lên men các chủng B. licheniformis. Baxitraxin có công thức
tổng quát: C
66
H
103
O
16
N
17
S, trọng lượng phân tử 1420 Da.
Baxitraxin có hoạt tính sinh học đa dạng: kích thích phân giải tế bào, tạo tế bào trần, ngăn cản sự
đồng hóa các axit amin tổng hợp mucopeptid thành tế bào. Ngoài ra, baxitraxin còn ức chế hoạt động một

số enzym và ức chế sự phát triển của chủng B. licheniformis dưới một số điều kiện nhất định. Tuy nhiên
nồng độ kháng sinh đủ để ức chế B. licheniformis cao hơn nhiề
u nồng độ kháng sinh để ức chế vi sinh vật
nhạy cảm. Baxitraxin có hiệu lực chống các vi khuẩn Gram
+
như: Actinomyces, Clostridium,
Staphylococus, Haemophilus, Neisseria, Coorynebacterium, Diplococcus, Pneumococi nhưng không có
hiệu lực với các vi khuẩn Gram ưa khí trừ Gonococi và Menigococi [4]
Baxitraxin được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm để bảo quản thịt cá, trong y học
điều chế thuốc chữa bệnh, đặc biệt Zn-baxitraxin là một trong 7 loại kháng sinh được ứng dụng rộng rãi
trong chăn nuôi để kích thích tăng trọng và phòng chống bệnh.
1.3. SỰ CẢM Ứ
NG SINH TỔNG HỢP ENZYM
1.3.1. Hiện tượng cảm ứng
Hiện tượng cảm ứng là hiện tượng làm tăng sự tổng hợp enzym trong tế bào, khi bổ sung một chất
nào đó vào môi trường nuôi cấy thì thì sự tổng hợp enzym phân giải cơ chất đó sẽ tăng lên đáng kể. Hiện
tượng cảm ứng thường biểu hiện rất nhạy cảm ở vi sinh vật, hơn hẳ
n ở động vật, thực vật.[11]
1.3.2. Đặc điểm của sự cảm ứng
Hiện tượng của sự cảm ứng có tính đa hướng và tính hợp đồng. Đặc điểm này được thể hiện ở chỗ:
một chất cảm ứng có thể cùng một lúc gây ra sự tổng hợp cảm ứng của một vài enzym. Chẳng hạn chất
tổng hợp cảm ứng β- galactosidlactose (hoặc chất cả
m ứng tương tự của nó) ngoài khả năng gây ra sự tổng
hợp cảm ứng enzym β- galactosidase còn đồng thời gây ra sự tổng hợp cảm ứng của hai enzym khác nữa
là galactosid permease (có tác dụng chuyển cơ chất qua màng tế bào) và galactosid transferase. Cả 3 loại
enzym này được thực hiện có tính chất hợp đồng về số lượng.
Sự cảm ứng thường có tính chất dây chuyền. Trong một hệ thống bao gồm nhiều ph
ản ứng, cơ chất
đầu tiên của hệ thống có thể cảm ứng quá trình tổng hợp tất cả các enzym xúc tác cho quá trình chuyển
hóa nó. Điều này được thực hiện theo cơ chế sau: trước hết chất cảm ứng làm tăng quá trình tổng hợp

enzym tương ứng, sau đó sản phẩm của phản ứng này lại cảm ứng tổng hợp enzym thứ hai để phân giải
nó, tiếp theo sản ph
ẩm thứ hai lại cảm ứng tổng hợp cho enzym thứ ba.[11]
Hiện tượng cảm ứng thường có tính chất đặc hiệu, ví dụ: khi thêm DL serin vào môi trường nuôi
cấy E. coli thì enzym D-serindeaminase được tổng hợp tăng lên 200 lần, trong khi hàm lượng L-
serindeaminase chỉ tăng 4 lần, còn L-threonindeaminase thì không thay đổi. Nhưng khi thêm L- threonin
vào cũng môi trường ấy thì sự tổng hợp L- threonindeaminase lại chiếm ưu thế. [2]


1.3.3. Lịch sử nghiên cứu sự cảm ứng sinh t
ổng hợp enzym
Jacob, Monod và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu về sự điều hòa biểu hiện gen. Khi
tiến hành nghiên cứu trên operon Lac, họ đã chứng minh được rằng:
+ Sự điều hòa 3 enzym có liên quan trong chu trình lactose (được mã hóa trong operon Lac) xảy ra
ở mức độ biểu hiện gen chứ không phải bằng cách hoạt hóa tiền chất enzym.
+ Chất cảm ứng tác động vào chất kìm hãm sự phiên mã chứ không phải bằng cách hoạt hóa một
“protein c
ảm ứng”.
Sau đó, Gilber và Muller-Hill, những người đã cô lập được chất kìm hãm operon Lac, đã chứng
minh in vitro rằng chất kìm hãm này đã gắn vào một vị trí trên ADN đặc hiệu nằm gần promoter của
operon Lac.
Sau đó, Record và cộng sự đã chứng minh rằng sự liên kết giữa chất kìm hãm operon Lac với DNA
hoàn toàn là liên kết tĩnh điện.
Năm 1970, Riggs và cộng sự đã chứng minh rằng chất kìm hãm operon Lac nhận biết đích operator
c
ủa nó với một tốc độ nhanh hơn nhiều so với một phản ứng được điều khiển bằng sự truyền tin.
Berg và cộng sự đã phân tích định lượng. Họ đã đưa ra 3 cơ chế xác định làm thế nào chất ức chế
xác định vị trí operon của nó. Ba cơ chế đó là sự trượt, sự chuyển đổi hai giai đoạn, và sự di chuyển từ nơi
này qua nơi khác[41]
1.3.4. Mô hình cảm ứng operon Lac

1.3.4.1. Cấu trúc operon Lac
Dựa vào chức năng của các gen tham gia vào quá trình tổng hợp protein có thể phân thành các loại
gen như sau:
+ Gen
Promoter (P):
đứng trước gen
operator, là vị
trí liên kết
RNA
polymerase.
Promoter điều
khiển việc nhận
biết vị trí khởi
đầu phiên mã
của RNA
polymerase. Ở vi khuẩn, hai trình tự consensus quan trọng trong promoter là TATAAT ( ở vị trí -10) và
TTGACA ( ở vị trí -35).
Hình 1.9
: Cấu trúc của Operon Lac [66]
+ Gen điều hòa(i): gen này mã hóa cho một protein đặc biệt gọi là chất kìm hãm (repressor). Chất
kìm hãm có vai trò “đóng mở” gen operator. Do đó, gen điều hòa có thể kiểm tra quá trình sao chép gen
cấu trúc thông qua chất kìm hãm này.
Protein kìm hãm được tạo thành từ bốn chuỗi polypeptid (homotetramer).
Trên protein kìm hãm có hai vị trí liên kết: một gắn với một trình tự gồm 24 cặp base của operator trong
operon Lac và một gắn với chất cảm ứng lactose. Protein kìm hãm gắn với DNA chủ yếu bằng liên kế
t
tĩnh điện được tạo thành giữa các acid amin tích điện dương của protein (ví dụ; Lys, Arg, …) với khung
sườn deoxyribose-phosphat tích điện âm của DNA.
+ Gen operator (O): Ở cạnh nhóm gen cấu trúc, đảm bảo cho quá trình sao mã các gen cấu trúc
theo cơ chế ‘đóng mở” tựa công tắc của một dãy đèn. Quá trình sao chép chỉ có thể tiến hành khi gen

Promoter của
gen điều hòa(Pi)

Gen điều hòa(i)
Promoter của
gen cấu trúc(P
lac
)
Gen cấutrúc
Operator
Operon Lac