CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 10 ppt

203
thường người ta có thể khuếch đại những đoạn có độ lớn cho đến 10 kb
nhưng khi độ dài càng lớn thì hiệu quả phản ứng càng thấp và càng khó
khăn hơn để thu được kết quả. Có thể khuếch đại một đoạn rất dài (cho
đến 40 kb) nhưng người ta phải sử dụng phương pháp đặc biệt hơn.
- Kích thước của primer
Đoạn mồi nên dài bao nhiêu? Nếu đoạn mồi ngắn quá thi nó sẽ gắn
vào những vị trí không mong muốn, nhu vậy những đoạn không mong
muốn được khuếch đại lên. Chẳng hạn, DNA tổng số của người được sử
dụng với hai mồi có độ dài 8 nucleotide. Kết quả được chỉ ra ở hình 9.13.
Nhiều đoạn khác nhau được khuếch đại, vì người ta tính toán trung bình
cứ 65 536 bp (= 8
4
) có một ví trí gắn cho mồi. Tổng số có khoảng 46 000
vị trí trong hệ gen người có 3 000 000 kb. Vì vậy rất khó tin là một cặp
mồi tạo nên một sản phẩm PCR đồng nhất với khuôn mẫu là DNA người.

Hình 9.14 Nhiệt độ có tác dụng quan trọng lên phản ứng lai giữa primer và
DNA khuôn
Khi sử dụng mồi có 17 nucleotide, với trình tự này thì cứ 17 179 869
184 bp có 1 vị trí gắn (= 4
17
). Số này lớn hơn 5 lần base trong tổng số hệ
gen người, vì vậy người ta chờ đợi nhiều nhất là có một vị trí gắn. Với một
cặp mồi có độ dài 17 nucleotide thì có thể một sản phẩm khuếch đại duy
nhất xuất hiện (Hình 9.13).


204

Độ dài của mồi ảnh hưởng đến sự gắn với DNA khuôn nhanh hay
chậm, ở mồi dài thì quá trình này chậm hơn. Hiệu quả của phản ứng PCR
là số lượng bản sao được tạo ra trong một thí nghiệm, sẽ giảm khi mồi dài,
vì với thời gian cho phép trong chu kỳ phản ứng không xảy ra phản ứng
lai đầy đủ. Trong thực tế không có mồi nào dài hơn 30 nucleotide được sử
dụng.
Quan trọng nhất là nhiệt độ gắn vì nó ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của
phản ứng. Nếu nhiệt độ cao quá, không xảy ra sự gắn kết, mồi và khuôn
đứng riêng lẽ (Hình 9.14a). Nếu nhiệt độ quá thấp những thể lai không đặc
hiệu bền vững, trong đó không phải tất cả các cặp base bắt cặp chính xác
(Hình 9.14b). Trong trường hợp này những chú ý về độ dài của mồi không
có ý nghĩa, vì từ đó chỉ xuất hiện những thể lai chính xác giữa mồi và
khuôn. Khi các base bắt cặp không tương ứng thì số lượng vị trí lai với
mồi tăng lên nhiều và dẫn đến nhân lên những đoạn không mong muốn.
Nhiệt độ lai lý tưởng một mặt phải thấp để xảy ra phản ứng lai giữa
mồi và sợi khuôn, mặt khác phải cao để không tạo nên thể lai không đặc
hiệu Người ta có thể xác định nhiệt độ dựa trên nhiệt độ phân ly (T
m
) của
thể lai giữa mồi và khuôn. Ở nhiệt độ T
m
thể lai hoàn toàn phân ly, ở nhiệt
độ thấp hơn T
m
1-2 độ có thể tạo nên thể lai chính xác giữa mồi và khuôn,
không tồn tại thể lai không đặc hiệu. Người ta biết được T
m
bằng thực
nghiệm, nhưng phần lớn tính theo công thức:
T

m
= (4 x G + C ) + (2 x A + T )
0
C
Trong đó G + C là số lượng nucleotide G và C trong trình tự mồi
A + T là số lượng A và T.
Để xác định nhiệt độ lai cho phản ứng PCR người ta tính T
m
cho hai
mồi và để nhiệt độ thấp hơn T
m
1-2 độ. Các mồi nên thiết kế để cả hai có
cùng T
m
. Nếu không như vậy thì nhiệt độ lai đối với mồi này thì cao
nhưng với mồi kia thì thấp.
Cách tính Tm cho một primer

1.2. Phân tích sản phẩm PCR
Sau khi tiến hành PCR, có nhiều phương pháp để phân tích sản phẩm
PCR, quan trọng là các phương pháp sau
- Điện di
- Phân tích trình tự sản phẩm PCR
- Phân tích tạo dòng sản phẩm PCR


205
Phần lớn việc kiểm tra kết quả thí nghiệm PCR thực hiện bằng cách
lấy một phần sản phẩm PCR cho chạy điện di. Sau khi nhuộm màu với
ethidiumbromide nhận ra một vạch. Nếu sản phẩm thu được ít thì chứng

minh bằng phản ứng lai Southern blot. Nếu thiếu vạch mong đợi và xuất
hiện nhiều vạch khác thì thí nghiệm phải làm lại.
Trong một số trường hợp, điện di không những khẳng định được phản
ứng PCR đạt kết quả hay không mà từ đó còn thu được những thông tin
khác. Ví dụ có thể khẳng định, trong đoạn DNA được khuếch đại có tồn
tại những vị trí cắt của enzym giới hạn hay không. Nhằm mục đích này
sản phẩm PCR được xử lý bằng một enzym giới hạn và sau đó cho chạy
điện di. Và người ta có thể khẳng định dựa trên độ dài của sản phẩm PCR,
rằng DNA khuôn ở trong vùng khuếch đại có chứa một đoạn chèn hoặc
loại bỏ đi một đoạn không (hình 9.15). Trong cả hai trường hợp đề cập
đến một dạng biến đổi của phân tích RFLP ở phản ứng PCR. So với với
phương pháp nguyên thuỷ nó có ưu điểm là cần rất ít nguyên liệu ban đầu.


Hình 9.15 Thông qua điện di sản phẩm PCR, thu được thông tin về phân
tử DNA khuôn
Giếng 1. Chỉ sản phẩm PCR không cắt
Giếng 2. Sản phẩm được cắt bằng một enzyme ở vị trí R
Giếng 3. DNA khuôn trong vùng nhân có chứa đoạn DNA đưa vào
Khi địện di không cung cấp đủ thông tin thì bước tiếp theo là xác định
trình tự sản phẩm PCR. Nhằm mục đích này người ta tạo dòng sản phẩm
PCR và sau đó sử dụng phương pháp xác định trình tự thông thường hoặc
xác định trực tiếp trình tự sản phẩm PCR.
2. Ứng dụng PCR trong tách dòng các đoạn DNA
Khi muốn có thêm những thông tin về sản phẩm PCR thì người ta gắn


206
những đoạn này vào trong một vector và nghiên cứu bằng một phương
pháp tiêu chuẩn ưa thích để phân tích DNA tạo dòng. Tuy nhiên ở đây có

những khó khăn.
Vấn đề đầu tiên gặp phải là đầu cuối của sản phẩm PCR. Những đoạn xuất
hiện bằng phản ứng PCR có đầu bằng có thể gắn đầu bằng vào một vector
hoặc nối thêm linker hoặc adapter để tạo đầu dính.

Hình 9.16 Khuếch đại DNA được tạo dòng trong vector
Trong thực tế, Taq polymerase gắn với đầu cuối của sợi mới tạo thành
thường ở một nucleotide bổ sung thêm, phần lớn là một adenosin. Sản
phẩm PCR mạch kép không có đầu dính, mà ở mỗi đầu cuối 3’ có một
nucleotide (Hình 9.17). Người ta có thể cắt ra nucleotide bổ sung này bằng
một exonuclease và tạo ra những phân tử có đầu bằng. Phương pháp này
hạn chế sự cắt tiếp tục của exonuclease và những đầu cuối bị ảnh hưởng.

Hình 9.17 Polynucleotide được tổng hợp từ Taq polymerase thường mang đầu
cuối 3’ một adenosine.
Để giải quyết khó khăn này người ta sử dụng một vector tạo dòng đặc
biệt hơn với nucleotide T đứng đối diện, có thể được gắn kết với DNA
được khuếch đại (Hình 9.18). Để tạo ra một vector thông thường người ta


207
tạo ra một vector với những đầu cuối cắt bằng enzyme giới hạn và sau đó
xử lý nó với Taq polymerase và chỉ bổ sung thêm ATP. Vì hỗn hợp này
không chứa mồi, nên Taq polymerase chỉ gắn 1 nucleotide T vào đầu bằng
của vector đã được cắt ra. Một vector có đầu cuối những T như vậy được
gắn với sản phẩm PCR.

Hình 9.18. Tạo dòng sản phẩm PCR trong vector với nucleotide ở đầu cuối
Phương pháp thứ hai được sử dụng nhiều hơn là thiết kế mồi có chứa
vị trí cắt giới hạn. Sau phản ứng PCR người ta xử lý những phân tử mới

tạo ra bằng một enzyme giới hạn. DNA trong trình tự mồi được cắt và ở
đây xuất hiện những đầu dính, có thể đưa chúng có hiệu quả vào một
vector tạo dòng bình thường (Hình 9.19). Phương pháp này không hạn chế
trong mọi trường hợp, trong đó các đoạn mồi trùm lên một vị trí cắt giới
hạn đã có trong DNA khuôn. Người ta có thể gắn những trình tự nhận biết
của enzyme như là những đoạn ngắn vào đầu 5’ của mồi (Hinh 9.20).
Những đoạn này không lai với khuôn nhưng được sao chép trong phản
ứng PCR, như vậy sản phẩm PCR mang ở mỗi đầu cuối một vị trí cắt của
enzyme giới hạn.
Những khó khăn do sự khiếm khuyết của Taq polymerase: Tất cả
những DNA polymerase có lỗi trong khi tổng hợp, nghĩa là thỉnh thoảng
nó có thể gắn một nucleotide sai vào sợi DNA đang tổng hợp. Tuy nhiên
phần lớn DNA-polymerase sửa chữa được những lỗi này, trong đó nó


208
quay lại để cắt nucleotide đã được gắn vào sai và gắn vào nucleotide đúng.
Đặc tính có “chức năng sửa chữa” phụ thuộc vào hoạt tính của
exonuclease theo hướng 3’ 5’ của polymerase.

Hình 9.19. Tạo sản phẩm PCR có đầu dính nhờ sử dụng primer, trong đó có vị
trí enzyme cắt giới hạn

Hình 9.20. Primer PCR với vị trí cắt ở đầu 5’ được kéo dài
Taq polymerase thiếu chức năng sửa chữa này, nghĩa là chúng không
thể sửa được lỗi. DNA được tổng hợp từ enzyme này không phải luôn
luôn là bản sao chính xác của phân tử khuôn. Lỗi gặp phải theo ước đoán
là khoảng 1 nucleotide trong 9000, thể hiện lỗi ít, nhưng sau 30 chu kỳ
phản ứng thì lỗi lên đến 300 bp. Vì ở phản ứng PCR nhiều bản sao thường
xuyên xuất hiện từ bản sao nên lỗi do PCR-polymerase gây ra tăng dần và

những bản sao xuất hiện về cuối PCR mang những nucleotide được gắn
vào sai từ những chu kỳ trước là những lỗi mới thêm vào trong những chu
kỳ tổng hợp cuối.


209

Hình 9.21 Tần suất lỗi cao của Taq polymerase khi tạo dòng sản phẩm PCR
Trong nhiều lĩnh vực ứng dụng những lỗi tổng hợp này không phải là
vấn đề lớn. Đặc biệt hơn sự phân tích trình tự trực tiếp sản phẩm PCR
cung cấp những trình tự chính xác mặc dù có lỗi do Taq polymerase gây
ra, vì theo phân bố thống kê những base được gắn sai nhưng nhiều phân tử
khác xuất hiện trên mỗi một đoạn với một lỗi ở một vị trí nhất định có
trình tự ở vị trí này là chính xác. Trong trường hợp này sự mắc lỗi là
không có ý nghĩa.
Mặt khác sẽ như thế nào nếu sản phẩm PCR được tạo dòng. Mỗi một
dòng chứa nhiều bản sao của một đoạn duy nhất được khuếch đại trong
phản ứng PCR và DNA tạo dòng không nhất thiết có cùng trình tự như
phân tử khuôn mà người ta cho vào để khuếch đại (Hình 9.21). Điều này
dẫn đến sự không chắc chắn ở tất cả các thí nghiệm với sản phẩm PCR tạo
dòng. Vì vậy nếu có thể thì nghiên cứu DNA được khuếch đại trực tiếp và
không tạo dòng.


210
PCR vào lập bản đồ di truyền
PCR
(random amplified polymorphic DNA analysis-RAPD). Trong
phương pháp RAPD, PCR được thực hiện với các primer chọ
.

triển như đa hình các đoạn cắt giới hạn (restriction fragment lenght
polymorphism, RFLP), vi vệ tinh (microsatellite) hay còn gọi là sự lặp lại
các đoạn nucleotid
(amplified fragment lenght polymorphism,
AFLP). Các kỹ thuật này được xây dựng trên cơ sở PCR có triển vọng rất
lớn trong nghiên cứu da dạng di truyền (genetic diversity), địn
.
4. Nguyên tắc và cơ sở di truyền của phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị
(MAS-marker aided-selection) dựa vào PCR
Một chỉ thị di truyền cần có hai yêu cầu cơ bản: thứ nhất là phải có sự
khác biệt giữa cơ thể bố và cơ thể mẹ và thứ hai là nó phải được truyền lại
chính xác cho thể hệ sau. Người ta phân ra các kiểu chỉ thị di truyền sau:
4.1. Chỉ thị hình thái
Về mặt nguyên tắc, một tính trạng nào đó do một locus kiểm soát mà
sự biểu hiện của nó không bị ảnh hưởng bởi tác động của môi trường, có
thể dùng làm một chỉ thị hình thái cho quá trình chọn lọc.
4.2. Chỉ thị phân tử: Chỉ thị phân tử là đặc điểm ở khía cạnh hóa học hay
cấu trúc phân tử được di truyền lại cho thế hệ sau giống các nhân tố di
truyền Mendel nhưng lại có thể định lượng được. Có hai loại chỉ thị phân
tử cơ bản:
Chỉ thị isozyme: isozyme là những dạng enzyme có cùng một phản
ứng hóa học như nhau nhưng lại bị ức chế bởi những phân tử khác nhau.
Về mặt di truyền có thể chia isozyme làm hai dạng: isozyme đơn gene và
isozyme đa gene.
Chỉ thị phân tử DNA: Chỉ thị phân tử DNA rất phong phú, do sự đa
dạng của DNA, tính ổn định và sự không lệ thuộc của chúng vào các yếu
tố môi trường. Các chỉ thị di truyền phân tử được sử dụng để xác định mối
quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở
cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa
giữa loài. Chúng cũng có thể được dùng để chọn tổ hợp lai. Kiểu chỉ thị

này được sử dụng rất có hiệu quả để lập bản đồ phân tử cho những cây


211
trồng có phương thức sinh sản sinh dưỡng hay sinh sản vô tính khó khăn.
Chỉ thị phân tử được chia ra làm hai nhóm lớn:
- Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP
- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR.
Cho đến nay có rất nhiều chỉ thị phân tử được phát triển dựa trên cơ sở
nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như: AFLP (Amplified fragment length
polymorphism), RAPD (Random amplified polymorphism DNA), SSR
(Simple sequence repeats), STS (sequence tagged site) …
Chọn lọc nhờ chỉ thị dựa vào PCR
Tính biến dị di truyền giữa các giống trong một loài cây có thể được
phát hiện do sự sai khác về chiều dài của đoạn DNA đích được nhân bản
nhờ PCR khi sử dụng cùng một cặp primer. Đó là do sự thay thế base ở
các điểm liên kết primer hoặc do sắp xếp lại trật tự DNA trong vùng chứa
các điểm đó. Những sự thay đổi như thế được phản ảnh ở tính đa dạng về
chiều dài của các đoạn DNA được nhân bản (amplicon length
polymorphism) – ALP.
Các primer được dùng trong phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị dựa
trên PCR thường căn cứ vào các điểm có trật tự nucleotide đã được xác
định, gọi là chỉ thị điểm trật tự được đánh dấu - STS (sequence tagged
site).
Chỉ thị STS đang được sử dụng rất phổ biến trong lập bản đồ
geneome. STS là một đoạn DNA ngắn khoảng 60-1000 bp và có thể phát
hiện được bằng kỹ thuật PCR. Nó cho phép xác định những vị trí được
đánh dấu bằng cách sử dụng các trình tự nucleotide biết trước của DNA
trong geneome. Hai đoạn mồi được thiết kế dựa trên các trình tự
nucleotide đã biết giúp ta xác định được vùng DNA cần tìm. Các đoạn mồi

STS thường chứa khoảng 20 nucleotide nên có tính đặc hiệu cao với PCR.
Một lượng lớn STS có thể được tạo ra nhờ sử dụng kỹ thuật RFLP và các
dòng cDNA làm mẫu dò. Mỗi một STS được xác định tại một điểm trên
bản đồ như là mốc trong genome. Dựa trên các kết quả phân tích về chỉ thị
STS, RAPD, có thể xây dựng được các bản đồ di truyền liên kết ở một
giống cây trồng nào đó. Nhờ vậy việc tìm kiếm các gene kiểm soát hoặc
liên quan chặt chẽ đến một tính trạng di truyền nào đó có thể được tiến
hành một cách dễ dàng.
- Chỉ thị AFLP cho phép phát hiện được tính đa dạng về chiều dài các
đoạn DNA được nhân bản chọn lọc. Kỹ thuật này được đánh giá là nhanh
chóng và có hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng của cây trồng như
lúa, lạc, …
- Chỉ thị SSR: SSR là một đoạn DNA có sự lặp lại của một trật tự
nucleotide đơn giản nào đó. Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong
mỗi đơn vị lặp lại và số đơn vị lặp lại mà độ dài của SSR được nhân bản
sẽ được phát hiện sau quá trình điện di. Chỉ thị SSR đã được dùng để chọn
lọc tính kháng bệnh khảm do virus của cây đậu tương, một số tính trạng có
quan hệ chặt chẽ với năng suất ở lúa hoặc xác lập mối quan hệ thân thuộc


212
giữa các giống cây trồng ở cà chua, lúa, đậu tương, mía, …
- Chỉ thị RAPD cho phép phát hiện tính đa hình của các đoạn DNA
được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một mồi đơn (thường chứa 10-
12 nucleotide, tối thiểu là 4 bp) chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Chỉ thị
RADP thường được dùng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc
giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể phục vụ cho công tác lai tạo
hoặc phân loại. Chúng cũng được sử dụng để xác định những gene kiểm
soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng như tính
trạng chất lượng, tính kháng virus, …

V. Một số kỹ thuật khác và ứng dụng của chúng trong chọn
giống thực vật trên thế giới và ở Việt Nam
Trong những năm qua, các phương pháp biến nạp gene ở thực vật bậc
cao đã có rất nhiều tiến bộ. Hiện nay các phòng thí nghiệm công nghệ
gene đang bắt tay vào việc cải thiện có ý nghĩa cho một số loại cây trồng
nhờ các công cụ của sinh học tế bào và sinh học phân tử. Trong một vài
trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô và bông) các phương pháp biến
nạp gene bị giới hạn bởi genotype. Một số các cây trồng quan trọng cần
thiết cho nhu cầu sử dụng của người dân ở các nước đang phát triển ít
được chú ý.
. Một số
cây trồng quan trọng đã được biến nạp gene, một vài vấn đề kỹ thuật vẫn
đang còn tồn tại, nhưng chúng đang dần dần được giải quyết. Để có kết
quả cần phải thay đổi dần dần sang một phạm vi khác, như là phát hiện và
tạo dòng các gene mang các tính trạng đa gene (multigeneic traits). Một
điều không thể quên là vấn đề nhận thức của xã hội và dự báo nguy cơ tác
động xấu đến môi trường do các sản phẩm có nguồn gốc từ công nghệ tái
tổ hợp DNA mang lại. Hiện nay công nghệ biến nạp gene đang được quan
tâm hơn thông qua các quỹ tài trợ của các cơ quan quốc tế như là chương
trình Rockefeller Foundation (Mỹ), và vấn đề đang được thảo luận nhiều
là cần thiết xác định phương thức tốt nhất để chuyển các lợi ích do công
nghệ biến nạp gene mang lại đến các nước đang phát triển.
1983. Điều này cho
phép nhận xét rằng mới chỉ hơn hai thập niên, các công cụ của công nghệ
DNA tái tổ hợp và sinh học tế bào đã giúp ích rất nhiều cho các nhà tạo
giống thực vật. Việc lựa chọn phương thức sử dụng các cây trồng thu được
từ công nghệ DNA tái tổ hợp có thể cung cấp thêm nguồn tài nguyên mới
cho công nghiệp và người tiêu dùng, như vậy có thể mở rộng cơ sở kinh tế
ở cả các nước công nghiệp lẫn các nước đang phát triển.

213
Câu hỏi ôn tập

1. Nêu nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene.
2. Trình bày các phương pháp chuyển gene vào cây trồng.
3. Ứng dụng của kỹ thuật RFLP trong chọn giống thực vật.
4. PCR là gì? Các giai đoạn của phản ứng PCR.
5. Ứng dụng PCR trong tách dòng các đoạn DNA.

Tài liệu tham khảo

1. Nguyễn Hoàng Lộc. 1998. Bài giảng Công nghệ gene thực vật. Đại
học Khoa học Huế.
2. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989)
Molecular Cloning (A laboratory manual). Cold
Spring Habor Laboratory. USA.
3. Newton CR and Graham A. 1994. PCR. BIOS Scientific Publishers
Limited.
4. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB
Khoa học và Kỹ thuật.
5. Wiser MF. 2002. Lecture notes for method in cell. Spring

TRANG WEB :
/>ular_Genetics.html


/>engineered-food/

/>d.htm

/>bin/abstract/112506342/ABSTRACT (Giải mã Bộ gen cây lúa)
a_gov/biotechnology/


TỪ KHOÁ :


214
- Kỹ thuật di truyền : Genetic engineering
- Gen chỉ thị : Marker gene / Chỉ thị phân tử : Molecular maker
- (phương pháp) Vi tiêm : Microinjection
- Công nghệ tế bào thực vật : Plant cell biotechnology
- Đa hình độ dài phân đoạn cắt hạn chế : Restriction fragment length
polymorphism (RFLP)
- Phản ứng dây chuyền của polymerase : Polymerase chain reaction
(PCR)
- Công nghệ sinh học nông nghiệp : Agricultural Biotechnology
- Thực vật biến đổi gene : Genetically modified organisms (GMO
plants)