CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 8 doc

153
lùn hay siêu lùn (extra dwarf).
Trong đó, các thể đột biến bán lùn thường gắn chặt với khả năng
chống đổ và kiểu cây cũng như thích nghi với chế độ phân đạm cao, nên
chúng có tiềm năng năng suất cao. Vì vậy, việc gây tạo các thể đột biến
bán lùn luôn là mục tiêu quan trọng trong chương trình chọn giống đột
biến lúa Nhiều nghiên cứu cho thấy hầu hết các giống hay dòng bán lùn
đều có chứa cùng một gen bán lùn bắt nguồn chủ yếu từ giống bán lùn địa
phương Đài Loan có tên Dee - geo - woo - gen (DGWG).
Điều đáng nói ở đây là, việc chấp nhận sử dụng rộng rãi cùng một gen
bán lùn như vậy có thể đưa lại hậu quả xói mòn di truyền, làm giảm tính
đa dạng di truyền vốn có ở cây lúa. Từ quan điểm này, nhu cầu về khai
thác sử dụng các nguồn đa dạng về tính bán lùn được nhấn mạnh (IAEA,
1982; Maluszynski và cs, 1986). Công cuộc tìm kiếm các gen bán lùn mới
không alen với gen sd-1 được tiếp diễn theo hai hướng: (1) thu thập bảo
tồn và đánh giá quỹ gen; và (2) phát hiện các gen bán lùn mới bằng
phương pháp đột biến.
6. Một số thành tựu của phương pháp chọn giống đột biến trên thế giới và
ở Việt Nam
Thành tựu chọn giống đột biến lúa trên thế giới
Gần đây, theo số liệu của FAO/IAEA, tính đến 12/1997, trên toàn thế
giới đã có 1847 giống đột biến, trong đó có 1357 giống cây trồng và 490
giống cây cảnh. Trong số 1357 giống cây trồng các loại thì riêng lúa có
333 giống, trong đó 67,6% được phát triển trực tiếp từ các thể đột biến và
32,4% qua lai tạo. Trong tốp 7 nước đứng đầu về số giống lúa đột biến,
Việt Nam xếp thứ bảy (Maluszynski và cs, 1998).
Thành tựu chọn giống đột biến lúa ở một số quốc gia tiêu biểu
ở Trung Quốc và Đài Loan, hai giống lúa lùn đầu tiên được tạo ra ở
Đài Loan năm 1957, một giống thông qua sử dụng trực tiếp thể đột biến
là Shuang Chiang 30 - 21 và giống LH1 qua chọn giống lai giữa thể đột

biến này với Taichung Native 1 (Hu, 1986). Trường hợp thành công nhất
trong số các giống đột biến với tính chín sớm nhờ cải tiến là Yuangfen
Zao, được phóng thích năm 1971. Từ năm 1985 đến nay, nó được xếp
vào một trong số ba giống lớn nhất ở Trung Quốc, được trồng trên 1
triệu hecta dọc theo Dương Tử Giang (Ukai, 1997) Một giống chín sớm
nổi tiếng khác là Zhefu 802 được trồng trên 1.400.000 ha năm 1989.
Trung Quốc luôn là nước đứng đầu về số lượng các giống lúa và cây
trồng đột biến.
Ở Nhật Bản, các dòng đột biến Sakai 64 và Fukei 53 được tạo ra đầu

154
tiên trong các năm 1958 và 1959, sau đó là Sakai 65 và Fukei 54. Từ năm
1966, Futsuhara và cs cho phóng thích giống lúa đột biến đầu tiên ở Nhật
là giống bán lùn Reimei bắt nguồn từ Fujiminori do chiếu xạ gamma.
Giống nổi tiếng này được trồng ở miền Bắc, trên diện tích 1.410.000ha
năm 1969. Hơn nữa, nó cũng được sử dụng làm bố mẹ rất thành công
trong các chương trình chọn giống lai. Theo Sato (1982, 1983), trong số 9
giống được tạo ra bằng cách này, đáng kể nhất là giống Akihikari
(=Reimei x Toyonisiki) được trồng tới 136.375 ha năm 1970, xếp hàng
thứ tư về diện tích trồng trọt ở Nhật.
Ấn Độ là quốc gia đứng hàng thứ nhì trong top 6 nước dẫn đầu về số
lượng giống cây trồng đột biến, và hàng thứ ba về số lượng giống lúa đột
biến. Mặc dù chưa có giống lúa đột biến nào đạt mức kỷ lục như Reimei,
Zhefu 802 nhưng sự thành công trong chọn giống lúa đột biến và lai tạo
giống năng suất cao ở nước này đạt được trong những năm 1970 đến nay
rất to lớn.
Gần đây, nhờ sự giúp đỡ tích cực của chương trình chọn giống đột
biến từ IAEA, sự nghiên cứu cải tiến giống lúa ở nhiều quốc gia châu Á và
Mỹ La tinh đã đạt được những tiến bộ đáng kể.
Ơ nước ta, những nỗ lực nghiên cứu theo hướng này, theo các tác giả

Lê Duy Thành và Trịnh Bá Hữu (1986), được bắt đầu từ 1966 ở Bộ môn
Di truyền, Trường Đại học Tổng hợp Hà Nội (nay là Đại học Khoa học Tự
nhiên thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội) và sau đó mở rộng sang các đơn vị
khác như: Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (nay là Viện Di truyền Nông
nghiệp), Trường Đại học Sư phạm Hà Nội I, Viện Cây Lương thực và
Thực phẩm, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa học -
Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam.
Một số công trình khoa học có giá trị trong lĩnh vực này đã góp phần
xác định tính quy luật của PSĐB ở giai đoạn tiền phôi, cơ chế phân tử của
quá trình đột biến, hiệu quả của các tác nhân gây đột biến lên tần sốvà các
phổ đột biến ở lúa cũng như nghên cứu và sử dụng PSĐB thực nghiệm
trong chọn giống lúa. Kết quả là, cho đến nay đã có hàng chục giống cây
trồng mới được tạo ra bằng phương pháp đột biến. Chẳng hạn, ở ngô có
DT6 và DT8; ở đậu tương có M103, V48, DT84, DT90, DT95 ; ở cây lạc
có V79, 4329, DT322, DT329
Đối với cây lúa, bằng phương pháp gây đột biến, nhiều giống mới đã
được tạo trong một thập kỷ qua. Chẳng hạn, bằng cách xử lý DMS các thể
tái tổ hợp thu được từ các tổ hợp lai (Xuân số 2 x 2765) và (NN8 x Xuân
số 2), GS.VS.Vũ Tuyên Hoàng và cs đã tạo ra các giống Xuân số 5 và
Xuân số 6. Các giống này được phóng thích năm 1991 (Trần Đình Long,

155
chủ biên - 1997).
Ở Viện Di truyền Nông nghiệp (DTNN), nhiều giống lúa mới được
chọn trực tiếp từ các thể đột biến hoặc qua lai tạo. Chẳng hạn, bằng chiếu
xạ tia γ vào hạt của giống lúa địa phương C4-63 đã tạo được các giống
DT10 và DT11 có chiều cao 90-100cm, năng suất cao, chống đổ tốt, chịu
rét. Các giống này được phóng thích năm 1990 và 1995 (Trần Duy Quý và
cs, 2000). Sau đó, DT10 được dùng làm mẹ để lai với CR203 và kết quả là
chọn tạo được giống DT13 (Bùi Huy Thuỷ và Trần Duy Quý, 1999). Bằng

phương pháp chiếu xạ tia γ 20 krad, các giống DT33 và CM1 đã được tạo
ra và phóng thích năm 1994 và 1999. Giống A20 được phóng thích năm
1993 là kết quả của xử lý NMU 0,015% và chọn giống lai giữa các thể đột
biến thu được (H20 x H30). Giống này có đặc tính thấp cây, kháng rầy,
chịu khô hạn và đất phèn. Nhờ sử dụng A20 làm mẹ trong chọn giống lai,
Bùi Huy Thuỷ và Trần Duy Quý đã chọn được các giống có triển vọng
DT16 và DT17. Kết hợp chiếu xạ tia γ và lai hữu tính, sau nhiều thế hệ
chọn lọc, Nguyễn Văn Bích và Trần Duy Quý đã tạo được các giống nếp
mới DT21 và DT22 cho năng suất cao, chất lượng tốt.
Bằng chứng sinh động và hiệu quả của việc chiếu xạ tia γ 15 krad vào
hạt nảy mầm ở thời điểm 69 giờ là sự biến mất tính cảm quang ở các
giống lúa Tám thơm Hải Hậu, Tài nguyên đục và Tép Hành. Nhờ vậy, các
thể đột biến tạo ra có thể trồng hai vụ trong năm. Cụ thể "Tám thơm đột
biến" (giống quốc gia năm 2000) hoàn toàn mất cảm quang, có TGST
ngắn hơn nhưng vẫn giữ được mùi thơm, chịu rét và cho năng suất tương
đương giống gốc. Hơn nữa, giống này có khả năng thích ứng rộng
(Nguyễn Minh Công và cs, 1999; Đỗ Hữu Ât và cs, 2000), "Tép hành đột
biến" (giống quốc gia năm 1999) có nhiều ưu điểm như mất cảm quang, TGST
và chiều cao cây đều rút ngắn gần 50% của giống gốc nhưng năng suất cao gấp
đôi "Tài nguyên đột biến" (giống quốc gia năm 1997) có nhiều ưu điểm nổi
bật so với Tài nguyên đục cũng được tạo ra bằng cách trên.
Tóm lại, tình hình nghiên cứu và chọn giống đột biến lúa ở nước ta
trong 10 năm qua đã đạt được những thành tựu to lớn. Việt Nam được
IAEA/FAO xếp vào một trong bảy quốc gia đứng đầu thế giới về số lượng
giống lúa đột biến và đứng thứ tư trong khu vực Châu á - Thái Bình
Dương (sau Trung Quốc, Nhật Bản và ấn Độ), với 40 giống bao gồm: lúa-
27, ngô-2, lạc-2. đậu tương-5, cà chua-2 và táo-2 (Trần Duy Quý, 1997).
Trong sự tiến bộ vượt bậc ấy, Viện DTNN đóng góp thật đáng kể, với 17
giống lúa và hơn 8 giống cây trồng khác được tạo ra bằng phương pháp
đột biến. Với kết quả đó, từ 1995 đến nay, nước ta trở thành thành viên

chính thức của Hiệp hội Chọn giống Đột biến ở Khu vực Châu Á mà Viện

156
DTNN là cơ quan đầu mối. Điều này khẳng định hướng đi đúng đắn và có
hiệu quả trong lĩnh vực khoa học này.

Tài liệu Tham khảo
Tiếng Việt
Nguyễn Văn Hiển (chủ biên, 2000): Chọn giống cây trồng. NXB Giáo
Dục, Hà Nội.
Trần Đình Long (chủ biên, 1997): Chọn giống cây trồng (Giáo trình cao
học nông nghiệp). NXB Nông Nghiệp, Hà Nội.
Trần Duy Quý (1997): Các phương pháp mới trong chọn tạo giống cây
trồng. NXB Nông Nghiệp.
Lê Duy Thành (2000): Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB KH &
KT, Hà Nội.
Tiếng Anh
Chopra, V.L. (Ed., 1989): Plant Breeding: Theory and Practice. Oxford &
IBH Publishing Co. PVT, Ltd.
Falconer D.S. and Mackay T.F.C. (1996): Introduction to Quantitative
Genetics. 4
th
edn. Longman Group, Harlow.
Hayward MD, N.O. Bosemark, I. Ramagosa, Coordinating ed. M.C.
Cerezo (1994): Plant Breeding: Principles and Prospects. 2
nd
ed.
Chapman & Hall, Inc., London.
Matsuo Y., Futsuhara F., Kikuchi F., Yamaguchi H. (Eds., 1997): Science
of The Rice Plant, Volume Three: Genetics. FAPRC, Tokyo, Japan.

Murray, D.R. (1991): Advanced Methods in Plant Breeding and
Biotechnology. C-A-B International Publisher, London.

157
Chương 8
Lai Tế bào Soma

I. Vấn đề lai ghép ở thực vật
Lai ghép hay là lai dinh dưỡng từ lâu đã được thực hiện ở thực vật và
có ý nghĩa trong thực tiễn trồng trọt các cây ăn trái, cây cảnh …Lai dinh
dưỡng bằng ghép là lai soma, nhưng thực chất thì cây lai dinh dưỡng là
một loại cơ thể khảm vừa mang các tế bào và mô của gốc ghép và cành
ghép. Giữa các tế bào của mô gốc ghép và cành ghép có thể có sự trao đổi
thông tin điều chỉnh sự trao đổi chất tạo cho cành ghép có một số tính chất
của gốc ghép, nhưng không xảy ra sự hợp nhân. Vì vậy các tính trạng
trung gian chỉ có ở thế hệ cành ghép, khi đem gieo các hạt của cành ghép
thì thế hệ sau không còn có tính trạng trung gian vì hạt được hình thành từ
hệ gene của cành ghép.
Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật có thành tế bào là lớp bao
ngoài cùng. Thành tế bào gồm cellulose, hemicellulose và pectin. Nếu
thành tế bào bị tách bỏ, tế bào thực vật chỉ còn lớp màng sinh chất bọc
ngoài gọi là tế bào trần hay protoplast. Khi các protoplast tiếp xúc nhau thì
chúng có thể hợp nhất lại làm một.
Vì tế bào thực vật có thành tế bào, nên trước đây trong môt thời gian
dài,người ta cho rằng kỹ thuật dung hợp protoplast chỉ giới hạn ở các tế
bào động vật. Mãi cho đến năm 1960, sau những nghiên cứu thành công
của Cocking với việc dung một hỗn hợp các enzyme để tách bỏ thành tế
bào thực vật, thì kỹ thuật dung hợp protoplast mới được áp dụng ở thực
vật. Tuy nhiên, nó chỉ thực sự phát triển mạnh mẽ và có xu hướng được
ứng dụng trong chọn giống chỉ sau khi các kết quả nghiên cứu về việc tái

sinh hoàn chỉnh cây thuốc lá từ protoplast của Takebe (1971) và việc tái
sinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa 2 loài N. tabacum và N.
langsdorffi của Carlson (1972).
II. Đại cương về lai tế bào soma và công nghệ tế bào thực vật
Tế bào thực vật khác biệt với tế bào động vật về nhiều đặc tính trong
đó có đặc tính là tế bào thực vật có thành cellulose bao quanh (cell wall)
sau đó đến màng nguyên sinh (membrane). Thành cellulose giữ cho tế bào
thực vật có hình dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành
có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô. Màng nguyên sinh
cho phép protoplast có thể hấp thu vào tế bào các đại phân tử (acid
nucleic, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể. Nếu để các

158
protoplast cạnh nhau, chúng có thể hòa làm một, đó là hiện tượng dung
hợp tế bào. Nếu các protoplast có nguồn gốc từ các tế bào soma thuộc các
giống, loài hoặc chi dung hợp lại thì có thể dẫn đến hiện tượng lai tế bào
soma.
Sự ra đời của kỹ thuật protoplast cho phép tạo ra những tái tổ hợp di
truyền giữa các đơn vị phân loại xa (loài hay chi) mà mà bằng phương
pháp lai hữu tính khó hoặc không thể đạt được. Trong quá trình dung hợp,
bên cạnh sự kết hợp của các genome nhân, còn có thể xảy ra sự hợp nhất
tế bào chất giữa các protoplast. Nhờ vậy, một số tính trạng do các gene
trong tế bào chất kiểm soát như tính bất thu, có thể chuyển từ cây này sang
cây khác nhờ kỹ thuật này.
III. Phương pháp tạo tế bào trần
Có một số phương pháp phân lập protoplast sau đây:
1. Phương pháp cơ học
Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất cùng
màng sinh chất tách khỏi vỏ cellulose. sử dụng kim nhọn và dao phẩu tích
để cắt các mô cùng lớp vỏ, sau đó ngâm vào môi trường nuôi cấy pha

loãng, tế bào chất sẽ phồng to và tách khỏi vỏ cellulose ra ngoài, tạo thành
các protoplast tự do. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. Sự phân lập
protoplast của thực vật bậc cao bằng phương pháp cơ học được Klercker
tiến hành đầu tiên vào năm 1892. Nói chung, các protoplast được phân lập
từ các tế bào không bào hóa cao của các mô dự trữ như chồi hành (bulbs)
và vảy hành (scales) của các loài thân hành, rễ củ cải, vỏ quả giữa của dưa
chuột và rễ củ cải đường.
2. Phương pháp sử dụng enzyme
Phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp
cơ học. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast.
Do vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose, nên sử
dụng enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase để phân hủy lớp vỏ tạo tế
bào trần. Tùy theo loại mô và cây được sử dụng, người ta thay đổi nồng độ
enzyme thích hợp. Protoplast thực chất là tế bào trần không có thành nên
có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây (lá,
rễ, hạt phấn …), callus, tế bào đơn,…
Để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy, phải
bổ sung những chất tăng áp lực vào dung dịch enzyme để duy trì thẩm
thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài.


159


Hình 8.1. Protoplast thuốc lá
IV. Liên kết và dung hợp tế bào trần
1. Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật
1.1. Xử lý bằng NaNO
3
Năm 1970, Power và cs. Đã dung NaNO

3
(0,25 M) kích thích dung
hợp hai protoplast. Carlson và cs. (1972) cũng dung phương pháp này để
sản xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên
phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO
3
không thích hợp với tế bào
bị không bào hoá mạnh như protoplast từ nhu mô lá.
1.2. Xử lý bằng PEG
Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylene glycol). Nồng độ
và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm
dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (<100) không thể tạo ra một
sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu
quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH/Ca
2+
có hiệu quả tăng tần
số dung hợp và khả năng sống sót của protoplast. PEG có hai tác dụng:
hoặc cung cấp cầu nối để Ca
2+
có thể liên kết các bề mặt màng với nhau
hoặc dẫn đến sự rối loạn điện tích bề mặt màng trong suốt quá trình rửa
giải.
1.3. Dung hợp bằng điện
Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp
bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện không gây
độc đối với tế bào như thường tìm thấy ở các protoplast hoặc các thể dị
nhân được xử lý bằng PEG.
Senda và cs. (1979) là những người đầu tiên nghiên cứu theo hướng
dung hợp bằng điện ở Rauwolfia. Sau đó Zimmermann và Scheurich

160
(1981) cũng đã chứng minh rằng các protoplast có thể dung hợp bằng điện
trường và đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi. Quá trình dung hợp
bao gồm hai bước: Đầu tiên các protoplast được đưa vào một ngăn dung
hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện
cực. Tiếp theo, sử dụng điện áp thấp và trường AC dao động nhanh, kích
thích các protoplast sắp xếp thành chuỗi tế bào giữa các điện cực. Phương
pháp này cho phép tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút.
Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực
hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao
tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc
của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý.
Quá trình bắt đầu từ lúc đưa các protoplast vào bên trong ngăn và chuyển
chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc
ít hơn.
Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia
trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma.



Hình 8.2 Dung hợp protoplast và cytoplast


161

Hình 8.3 Dung hợp tế bào
V. Nuôi cấy tế bào lai và tái sinh cây
1. Nuôi cấy protoplast
1.1. Thành phần dinh dưỡng
Môi trường nuôi cấy protoplast tương tự với môi trường nuôi cấy dịch

huyền phù và callus. Tuy nhiên, nồng độ của Fe, Zn và ammonium dùng
trong môi trường nuôi cấy mô ở thực vật có thể là quá cao đối với nuôi
cấy protoplast. Hầu hết muối của môi trường B5 (Gamborg và cs, 1968)
và MS (Murashige và Skoog, 1962) cải biến một ít là thích hợp. Tăng
nồng độ Ca trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình
thường là có lợi cho việc duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào (Torres
1989). Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3-5%, ở một số loài như
thuốc lá, sucrose được sử dụng ở nồng độ thấp hơn chỉ khoảng 1,5%.
Các vitamin dùng trong nuôi cấy protoplast cũng giống như trong môi
trường nuôi cấy mô tiêu chuẩn. Auxin và cytokinin sử dụng ở các tổ hợp
nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo vách tế bào và kích thích phân chia các
protoplast phân lập. Protoplast ngũ cốc đòi hỏi cung cấp 2,4-D riêng rẽ
hoặc tốt hơn là phải phối hợp với cytokinin. Tuy nhiên 2,4-D cũng như
các auxin khác (NAAA, IAA) được sử dụng riêng rẽ thường làm mất tiềm
năng phát sinh hình thái ở các callus có nguồn gốc protoplast. Các
cytokinin thường được sử dụng là BAP, kinetin, 2-iP hoặc zeatin. Mặc dù
tổ hợp hai loại hormone trên thay đổi tùy từng loài, nhưng nói chung trong
nuôi cấy protoplast thì tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho phân chia tế
bào, trong khi các protoplast có nguồn gốc từ những tế bào phân hóa cao

162
lại cần tỷ lệ kinetin/auxin cao để tái sinh cây.
1.2. Áp lực thẩm thấu của môi trường
Trong quá trình phân lập và nuôi cấy, các protoplast cần được duy trì
cân bằng áp lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào cho tới khi tái sinh
được vách tế bào vững chắc. Trong cả hai trường hợp chênh lệch áp lực
thẩm thấu giữa môi trường và nội bào theo hướng môi trường nhược
trương hoặc ưu trương sẽ dẫn đến tình trạng protoplast bị vỡ hoặc teo lại.
Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu (thông thường là để tăng áp lực thẩm
thấu) trong môi trường nuôi cấy protoplast và trong hỗn hợp enzyme là

sorbitol, mannitol, glucose, hoặc sucrose. Các protoplast sẽ sinh trưởng ổn
định hơn trong trong dịch được tăng nhẹ áp lực thẩm thấu. Đối với các
protoplast thịt lá của ở ngũ cốc và đậu thì mannitol hoặc sorbitol là các
nhân tố ổn định áp lực thẩm thấu thích hợp hơn cả, trong khi sucrose lại
thích hợp hơn glucose hoặc mannitol trong nuôi cấy protoplast của khoai
tây, đậu hoa (sweet pea), tước mạch (brome grass) và sắn. Trong nuôi cấy
dịch huyền phù thuốc lá, galactose và fructose đã được sử dụng để điều
chỉnh áp lực thẩm thấu.
Các chất phân ly ion (KCl 335 mmol/L và MgSO
4
.7H
2
O 40 mmol/L)
cải thiện tốt khả năng sống sót của protoplast. Thông thường các dung
dịch enzyme được bổ sung các muối nhất định (CaCl
2
5-100 mmol/L)
song song với các nhân tố ổn định thẩm thấu không phân ly ion. Cocking
và Peberdy (1974) đã phát triển dung dịch rửa protoplast (cell-protoplast
washing, CPW) chứa muối và các nhân tố ổn định thẩm thấu thích hợp.
Dung dịch CPW có thể được dùng trong suốt quá trình ủ enzyme và rửa
protoplast. Thời gian ủ enzyme tùy thuộc vào nồng độ của nó trong dung
dịch và loại nguyên liệu được sử dụng.
1.3. Mật độ dàn trải protoplast
Mật độ protoplast tối ưu là từ 1×10
4
đến 1×10
5
/mL. Tuy nhiên, các thí
nghiệm lai soma (somatic hybridization) và phát sinh đột biến

(mutagenesis) cần tạo dòng tế bào riêng rẽ, do đó phải dàn trải protoplast ở
mật độ thấp hơn (100-500 protoplast/mL). Nuôi cấy ở mật độ thấp giúp dễ
dàng phân lập và xác định các khuẩn lạc lai khi có mặt của hệ thống chọn
lọc. Kao và Michayluk (1975) đã xây dựng môi trường nuôi cấy protoplast
(KM 8p) (Bảng 6.2) trong đó các protoplast được nuôi cấy riêng rẽ (ví dụ:
Vicia hajastana) có khả năng phân chia cho tới khi tạo thành callus. Môi
trường này còn kích thích phân chia nhanh hơn ở các protoplast thịt lá của
cỏ linh lăng (alfalfa), đậu (pea), khoai tây, và sản phẩm dung hợp
khai tây
+ cà chua (potato + tomato) được nuôi cấy dàn trải ở mật độ thấp. Các
protoplast nuôi cấy trên môi trường này được đặt trong tối vì môi trường

163
1.3.1. Kỹ thuật tầng nuôi dưỡng
Một hướng khác trong nuôi cấy protoplast ở mật độ thấp là kỹ thuật
tầng nuôi dưỡng (feeder layer technique). Raveh và cs (1973) đã chuẫn bị
tầng tế bào nuôi dưỡng bằng cách chiếu xạ tia X (2×103 R) lên các
protoplast dịch huyền phù tế bào của thuốc lá, khi đó sự phân chia của tế
bào bị ức chế nhưng vẫn cho phép chúng duy trì các hoạt động trao đổi
chất. Các protoplast bị chiếu xạ sẽ được rửa sạch ba lần và sau đó dàn trải
chúng trên môi trường có agar mềm (soft agar) ở mật độ 2,4
×10
4
/mL.
Nuôi cấy trải (plating) các protoplast không qua chiếu xạ ở mật độ thấp
(10-100 protoplast/mL) trên tầng nuôi dưỡng này.
1.3.2. Đồng nuôi cấy các protoplast
Các protoplast của 2 loài khác nhau được nuôi cấy chung (co-culture)
để kích thích sự sinh trưởng của chúng hoặc của tế bào lai. Nói chung,
phương pháp đồng nuôi cấy được sử dụng trong những thí nghiệm mà các

callus hình thành từ 2 loại protoplast có thể phân biệt hình thái được. Ví
dụ: Các tế bào lai phân lập một cách cơ học (mechanically isolated hybrid
cells) được nuôi cấy cùng với các protoplast phân lập từ chủng bạch tạng
(albino strain) sẽ phát triển thành các khuẩn lạc màu xanh là loại khuẩn lạc
dễ phân biệt với các khuẩn lạc không có màu xanh của
chủng bạch tạng.
1.3.3. Nuôi cấy vi giọt
Kỹ thuật nuôi cấy vi giọt (microdrop culture) đã thành công ở trường
hợp nuôi cấy các tế bào lai của
Thuốc lá + đậu tương (Nicotiana glauca +
Glycine max
) và Arabidopsis thaliana + Brassica campestris. Kỹ thuật
này cần đĩa nuôi cấy Cuprak được thiết kế đặc biệt gồm có một ngăn bên
ngoài nhỏ và một ngăn bên trong lớn hơn. Các protoplast riêng rẽ hoặc các
thể dị nhân trong giọt môi trường dinh dưỡng (khoảng 0,25-25 µL) được
chuyển bằng pipette Drummond vào mỗi ngăn bên trong của đĩa Cuprak.
Ngăn bên ngoài chứa đầy nước vô trùng để duy trì độ ẩm bên trong đĩa.
Sau khi đậy nắp, đĩa được quấn giấy parafilm, giữ ở điều kiện ánh sáng và
nhiệt độ tối thích. Tỷ lệ tế bào/dung tích môi trường nuôi cấy thích hợp
tương đương mật độ 2-4
×10
3
/mL. Nếu tăng kích thước giọt (~ 25 µL), tức
là giảm mật độ dàn trải sẽ cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn.
2. Tái sinh cây từ protoplast
2.1 Tạo vách tế bào
Quá trình hình thành vách tế bào có thể hoàn chỉnh trong vòng hai đến
một vài ngày mặc dù các protoplast trong nuôi cấy thường bắt đầu tái sinh
vách tế bào ngay sau khi phân lập một vài giờ. Vách tế bào được tạo thành

164
2.2. Phát triển callus/cây hoàn chỉnh
Ngay sau khi tạo vách tế bào chung quanh protoplast, các tế bào được
tái cấu trúc đã tăng kích thước và sau một tuần xuất hiện sự phân chia tế
bào đầu tiên. Sau 2-3 tuần, các khuẩn lạc tế bào có kích thước lớn
(macroscopic) được tạo thành và có thể cấy chuyển chúng lên môi trường
không có sự điều chỉnh áp lực thẩm thấu (osmotic-free) để phát triển
callus. Các callus này được cảm ứng để phân hóa cơ quan, hoặc tái sinh
cây hoàn chỉnh.

Hình 8.4 Protoplast sau khi dung hợp được tái sinh (màu sáng)
Kể từ khi các loài thuộc họ Solanaceae được phân lập và tái sinh cây
thành công đầu tiên ở cây thuốc lá (Takebe 1971), đến nay người ta đã
thành công ở nhiều họ khác nhau như các loài legume, các cây trồng ăn
quả và lấy sợi (fibre and pulp crops), các loài cây gỗ, và thậm chí các loài
ngũ cốc như Pennisetum, lúa và lúa mì.
VI. Chọn lọc các tế bào lai và xác định các dòng tế bào lai và
callus
1. Chọn lọc các thể lai soma
1.1. Phương pháp mẫn cảm với dược phẩm
Power và cs. (1976) ứng dụng sự mẫn cảm khác nhau của protoplast
phân lập từ Petunia parodii và P. hybrida đối với actinomycin D. Trên
môi trường MS (Murashige Skoog, 1962), các protoplast tế bào thịt lá của
P. hybrida phát triển mạnh tạo thành khối callus lớn, trong khi P. parodii
các protoplast tạo thành khuẩn lạc bé. Bổ sung actinomycine D vào môi
trường nuôi cấy có hiệu quả đối với khả năng tái sinh của protoplast P.
paraodii, nhưng ở hybrida các protoplast lại mất khả năng phân chia

165
Mặc dù môi trường nuôi có bổ sung dược phẩm, các thể dị nhân vẫn

có thể sinh trưởng và sau cùng phân hóa thành các cây lai soma.
1.2. Các đột biến khuyết dưỡng
Chọn lọc các thể lai soma nhờ sự bổ sung di truyền của các đột biến
khuyết dưỡng. Phương pháp này chỉ thích hợp khi các dòng lai mong
muốn sống sót trên môi trường tối thiểu. Mặc dù phương pháp này ứng
dụng cho thực vật bậc cao có một số khó khăn, nhưng Glimelius và cs
(1978) đã thành công trong việc chọn lọc một số lượng lớn các thể lai
soma bằng cách sử dụng các protoplast khuyết tật enzyme nitrate
reductase và các dòng đột biến thuốc lá kháng chlorate. Các protoplast của
hai đột biến khác nhau này đã được dung hợp và nuôi cấy trên môi trường
chứa nitrate. Trong thí nghiệm đối chứng, các protoplast bố mẹ không sinh
trưởng khi có mặt nitrate trong khi các sản phẩm dung hợp đã tái sinh cây
1.3. Chọn lọc bổ sung di truyền
Dùng phương thức chọn lọc bằng mắt để phân lập các tế bào lai phát
triển trên môi trường nuôi cấy có thành phần gây mẫn cảm đối với các
protoplast bố mẹ. Trong nghiên cứu của Cocking (1977), khi dung hợp
protoplast giữa dạng hoang dại của Petunia parodii với protoplast bạch
tạng albino phân lập từ nuôi cấy dịch huyền phù tế bào của P. hybrida, P.
inflata và P. parviflora trong các thí nghiệm riêng rẽ. Trong tất cả các tổ
hợp này, protoplast màu xanh của parodii bị đào thải ở giai đoạn khuẩn lạc
có kích thước nhỏ, trong khi các protoplast của các loại bố mẹ khác lại
phát triển thành các khuẩn lạc không màu. Trong khi đó, các thể lai sinh
sản thành các callus màu xanh và sau đó thành cây lai soma. Phương pháp
này cũng dùng để lai soma khác loài ở các chi Daucus, Datura và các chi
khác.
Hiện tượng bổ sung di truyền trong quá trình dinh dưỡng được dùng
rộng rãi và có hiệu quả để nhận biết các sản phẩm dung hợp, như sử dụng
các đột biến bạch tạng hay thiếu hụt diệp lục, các gen đánh dấu có liên
quan đến tính kháng các chất kháng sinh (Hamil, 1984) hoặc kháng chất
diệt cỏ (Evola, 1983).

Có trường hợp, khi được nuôi cấy trong môi trường thiếu hormon
ngoại sinh thì các tế bào lai có khả năng cho callus và tái sinh cây, còn các
tế bào của từng dạng bố mẹ lại không có khả năng ấy (Power, 1977;
Shenck, 1982).
1.4. Sử dụng các đột biến bach tạng có các gene không allele cho chọn lọc
bổ sung di truyền.
Melchers và Labib (1974) đã tiến hành thí nghiệm bằng cách sử dụng

166
protoplast của hai giống thuốc lá Nicotiana tabacum: giống s (sublathal)
không tổng hợp được diệp lục bình thường nên rất mẫn cảm với ánh sáng
cường độ cao. Giống v (virescent) cũng không tạo được lục lạp bình
thường, lá non trắng hoàn toàn và mẫn cảm với ánh sáng cường độ cao.
Hai giống này là hai dạng đột biến có thể bổ sung cho nhau khi lai tạo,
nghĩa là nuôi cấy ở ánh sáng 800 lux cho tới giai đoạn ra hoa, sau đó thụ
phấn chéo sẽ được cây lai F
1
có lá xanh bình thường và chịu ánh sáng cao.
2. Chọn lọc tế bào lai
Bình thường các tế bào lai được tạo thành trong quá trình dung hợp
protoplast từ hai loài xa nhau về quan hệ họ hàng. Cây tái sinh từ tế bào lai
như thế sẽ có hệ gene lục lạp (plastome) từ cả hai loài bố mẹ, nhưng hệ
gene chức năng chỉ của một loài do có sự đào thải một bộ nhiễm sắc thể.
Vì thế, cây có nguồn gốc từ những cây tái sinh đó sẽ là thể lai di truyền chỉ
cho các tính trạng tế bào chất.
Để chuyển gene tế bào chất một cách hiệu quả, các tế bào của loài cho
tế bào chất sẽ được chiếu xạ. Chiếu xạ bằng tia X hoặc γ từ 50-300 Gy có
hiệu quả từng phần hoặc bất hoạt hoàn toàn các tế bào cho. Xử lý theo
phương thức này ngăn chặn hoàn toàn sự phân chia của các tế bào không
dung hợp và có vai trò như một nhân tố chọn lọc để sàng lọc các tế bào lai.

Phương thức dung hợp dùng tia γ được ứng dụng thành công trong lai
khác loài, khác chi ở cả hai mức độ nhân và cơ quan tử (Nigrutin và cs,
1989). Tác động qua lại giữa nhân và tế bào chất có thể xuất hiện ngay cả
trong những sản phẩm dung hợp dùng tia γ khi chúng được xuất phát từ
những protoplast thuộc những loài hữu tính không tương hợp nhau. Sự
phân chia ở các sản phẩm dung hợp và các tế bào tiếp theo sau sẽ làm tăng
khuẩn lạc tế bào mà ở đó sự đào thải không định hướng nhiễm sắc thể đã
xuất hiện từ phần cho. Tuy nhiên, giới hạn đào thải phụ thuộc vào hệ gene
cho và các điều kiện nuôi cấy xác định.
3. Con lai do sự dung hợp nhân
Nhiều dạng con lai soma do kết quả của sự hợp nhất nhân (nuclear
hybrid) đã được tạo ra giữa loài cây trồng với loài hoang dại ở chi cải dầu.
Ví dụ lai giữa loài B. nigra chứa 1 bộ gene (B) với loài B. napus chứa 2 bộ
gene (AC). Bằng phương pháp dung hợp protoplast giữa hai loài này đã
tạo ra dạng con lai chứa 3 bộ gene (ABC)
Khi dung hợp protoplast giữa Eruca sativa với B. napus người ta đã
chuyển được gene kháng côn trùng và chịu khô có ở Eruca vào con lai.
Ở khoai tây (Solanum tuberosum), khả năng ứng dụng kỹ thuật dung
hợp protoplast là rất lớn. Khi dung hợp protoplast giuwz S. tuberosum

167
(4n) với loài S. brevidens (2n) không cho củ, người ta đã thu được dạng
con lai khác loài (6n) cho củ, hữu thụ và có khả năng lai được với S.
tuberosum. Con lai này nhận được các gene quý từ loài hoang dại là gene
kháng virus gây bệnh xoắn lá ở khoai tây trồng và gene kháng bệnh vi
khuẩn ở củ.
Cần lưu ý, mặc dù sự dung hợp protoplast giữa các cây thuộc các loài,
thậm chí các chi khác nhau xảy ra bình thường nhưng việc tái sinh cây có
thể không xảy ra hoặc con lai có sức sống thấp hoặc bất thụ. Trong nhiều
trường hợp, gần như toàn bộ hoặc một phần nhiễm sắc thể của một trong

hai dạng bố mẹ bị mất đi Con lai chỉ nhận được một số nhiễm sắc thể hay
một đoạn nhiễm sắc thể của một trong hai dạng bố mẹ, nhưng chúng lại
chứa những gene có ích cho mực đích chọn giống.
4. Con lai do sự dung hợp tế bào chất
Ty lạp thể chứa bộ gene tương đối nhỏ so với hệ gene trong nhân.
Chúng chứa lượng DNA mã hóa cho khoảng 10% polypeptid đảm bảo cho
chức năng của các cơ quan tử, 90% còn lại là do các gene nhân mã hóa và
được chuyển qua màng của các cơ quan tử. các cơ quan tử được phân bố
một cách ngẫu nhiên vào các tế bào con qua các thế hệ tế bào. Trong sinh
sản hữu tính, các cơ quan tử gần như chỉ được chuyển qua giao tử cái.
Trong khi đó nhờ sự dung hợp protoplast, có hiện tượng đóng góp như
nhau của các cơ quan tử có trong tế bào chất từ hai dạng bố mẹ. Sản phẩm
dung hợp có thể chứa nhân, ty thể và lạp thể từ cả hai dạng bố mẹ. Nhưng
nó cũng có thể chứa nhân của một dạng bố mẹ còn tế bào chất thì lại của
cả hai. Dạng con lai như vậy có tên là con lai tế bào chất hay cybrid
VI. Ưu thế của lai soma và một số thành tựu của kỹ thuật này
trên thế giới và ở Việt Nam
Trong hơn hai thập kỷ qua, người ta đã đạt được nhiều tiến bộ trong
kỹ thuật dung hợp protoplast, từ việc tách, dung hợp protoplast đến tái
sinh cây ở nhiều loài cây trồng. Dung hợp protoplast là con đường hiệu
quả để khắc phục nhiều khó khăn gặp phải trong quá trình lai hữu tính
khác loài hoặc khác chi. Kỹ thuật này cũng cho phép tạo ra những thể tái
tổ hợp gene ở những loài đa bội hoặc có cơ quan sinh sản hữu tính phát
triển kém.
Một số thành tựu của việc ứng dụng kỹ thuật dung hợp protoplast đối
với việc cải tiến giống cây trồng:
- Ở chi cải Brassica, nhờ dung hợp protoplast, đã tổng hợp được loài
Brassica napus từ hai loài B. oleracea và B. campestris.
- Ở thuốc lá, loài Nicotiana tabacum dễ lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh

168
đốm lửa và nấm đen, trong khi đó loài N. rustica chống được các bệnh
trên. Con lai hữu tính giữa hai loài này bất thụ, nhưng con lai soma giữa
chúng lại hữu thụ và có khả năng kháng các bệnh trên.
- Ở các cây họ cà, nhờ kỹ thuật dung hợp protoplast người ta đã tạo ra
được con lai giữa khoai tây với các loài khác của chi Solanum có tính
kháng bệnh cao, vốn không lai được với nhau bằng phương pháp hữu tính.
- Ở cây họ đậu, bằng kỹ thuật dung hợp protoplast người ta đã tạo ra
được con lai soma giữa cỏ ba lá (Trifolium repens) với cây Medi
(Medicagosativa) và sử dụng chúng trong việc sản xuất chất tanin từ lá.
Tương tự như vậy, con lai soma giữa đậu tương trồng với các loài hoang
dại, như giữa Glycine max với G. tomentella, cũng đã được tạo ra.
- Ở cây lúa, trong chương trình hợp tác giữa IRRI với Trường Đại học
Nottingham, nhờ sử dụng kỹ thuật protoplast người ta đã tạo được một số
giống lúa có tính bất dục tế bào chất nhưng lại có khả năng chống chịu sâu
bệnh và nhiệt độ thấp.
Riêng đối với lúa mì, mặc dầu người ta đã bỏ ra nhiều công sức nhưng
cho đến nay những kết quả thu được trong lĩnh vực này còn rất hạn chế.

Câu hỏi ôn tập
1. Nêu các phương pháp phân lập protoplast.
2. Hãy cho biết các ưu điểm của phương pháp dung hợp protoplast
bằng điện.
3. Trình bày các giai đoạn của quá trình tái sinh cây từ protoplast.
4. Hãy nêu các phương pháp được sử dụng trong chọn lọc các thể lai
soma.
5. Hãy cho biết một số thành tự về kỹ thuật dung hợp protoplast.

Tài liệu tham khảo
1. Nguyễn Như Hiền. 2002. Di truyền và công nghệ tế bào soma.

NXB Khoa học và Kỹ thuật.
2. Trần Đình Long. 1997. Chọn giống cây trồng. NXB Nông nghiệp.
3. Nguyễn Hoàng Lộc. 1998. Bài giảng nuôi cấy mô và tế bào thực
vật. Đại học Khoa học Huế.
4. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB
Khoa học và Kỹ thuật.


177
Chương 9
Kỹ thuật Di truyền trong Chọn giống
Thực vật
I. Mở đầu
bào thực vật là biến nạp và biểu hiện các gene ngoại lai trong tế bào thực
vật. Biến nạp của các tế bào vi khuẩn được thự
. Tuy
nhiên, việc cải biến di truyền ở thực vật bậc cao bằng cách đưa DNA
ngoại lai vào trong các tế bào của chúng là một quá trình rất phức tạp. Sử
dụng enzyme hạn chế (restriction endonucleases) để cắt phân tử DNA sợi
đôi thành những đoạn nhỏ riêng rẽ, phát triển kỹ thuật lai DNA-DNA và
các gene chỉ thị (marker genes) cho phép chọn lọc các tế bào
, động vật
và thực vật bậc cao. Những nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin di
truyền mới được biến nạp vào các thực vật eukaryote biểu hiện không chỉ
ở mức độ tế bào và sau đó mức độ cơ thể hoàn chỉnh mà còn có thể truyền
lại cho các thế hệ sau của chúng.
Ý nghĩa thực tiễn của quá trình biến nạp là tạo ra những tính trạng mới
hoặc cải tiến những tính trạng đã có. Về một số phương diện nào đó, kỹ
thuật này có ưu điểm hơn so với phương pháp chọn giống bằng lai hữu
tính. Nếu ở phương pháp lai hữu tính, để chuyển được một gene hay một

số gene từ một giống này, qua một giống khác người ta phải tiến hành một
quy trình lai trở lại tốn rất nhiều thời gian và công sức. Trong khi đó kỹ
thuật chuyển gene không những cho phép vượt qua được những trở ngại
do sự xa cách về quan hệ họ hàng giữa thể cho gene và nhận gene mà còn
cho phép cây trồng tiếp nhận một cách nhanh chóng những gene mới do
con người thiết kế. Có thể thực hiện được điều này bằng cách sử dụng các
hệ thống vector sinh học, nhưng không phải đều có thể thực hiện được với
bất kỳ cây trồng nào. Việc tái sinh các cây được chuyển gene chủ yếu phụ
thuộc vào các tế bào soma có tính toàn thể, mà không phải là tế bào soma
nào cũng có khả năng đó.
Thành tựu nổi bậc của công nghệ gene ở thực vật bậc cao là tái sinh
được cây biến nạp gene đầu tiên vào đầu thập niên 1980. Đến nay, các kỹ
thuật phân tử đã được ứng dụng thành công ở nhiều loài khác nhau. Lúc
đầu người ta sử dụng các gene chỉ thị để biến nạp, nhưng nay đã thay thế
bằng các gene quan trọng có giá trị kinh tế.nhằm mục đích cải thiện phẩm
chất cây trồng. Hai nhân tố then chốt thúc đẩy sự phát triển của công nghệ
gene ở thực vật bậc cao là: các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ
những tế bào biến nạp và các phương pháp đưa DNA ngoại lai vào các


178
loài thực vật khác nhau. Muốn chuyển một gene thành công cần phải
chứng minh hiệu quả của phương pháp biến nạp gene, nhưng đôi khi các
loài nghiên cứu hoặc không thể tái sinh được cây từ các mô không phân
hoá, hoặc có thể tái sinh nhưng sau đó khó phát triển thành cây hoàn
chỉnh. Do đó hai nhân tố nói trên thường được nghiên cứu phát triển song
song.
Các chỉ thị biến nạp gene đầu tiên đã sử dụng Agrobacterium
tumefaciens để đưa vào cây thuốc lá các gene kháng kháng sinh.
Agrobacterium là vật truyền hữu hiệu để đưa các DNA ngoại lai vào trong

các loài thuộc họ Solanaceae, nhưng ở một số cây trồng khác quan trọng
hơn, việc sử dụng nó còn gặp nhiều hạn chế. Trở ngại lớn nhất là tính đặc
trưng vật chủ của Agrobacterium, mặc dù những tiến bộ gần đây đã cho
phép ứng dụng thành công trên một số giống cây trồng. Sự phát triển của
các phương pháp tái sinh cây hoàn chỉnh từ callus và protoplast đã mở ra
một hướng mới cho công nghệ di truyền thực vật thông qua các phương
pháp biến nạp gene trực tiếp. Nhờ sự phát triển của phương pháp bắn gene
(particle bombardment) dựa trên cơ sở tăng gia tốc của các hạt kim loại
nặng mang nguyên liệu di truyền vào trong mô thực vật. Việc biến nạp ở
các loài cây trồng gặp nhiều thuận lợi hơn. Các phương pháp biến nạp
khác cũng có hiệu quả đối với các trường hợp đặc biệt, nhưng khả năng
ứng dụng rộng rãi của chúng bị hạn chế. Chẳng hạn các phương pháp biến
nạp gene bằng xung điện (electroporation) vào các mô được cắt nhỏ từng
phần, phương pháp xử lý hoá học bằng PEG (polyethylene glycol),
phương pháp vi tiêm (microinjection) đưa DNA ngoại lai trực tiếp vào tế
bào, phương pháp dùng silicon carbide lắc với tế bào có tác dụng như các
mũi kim nhỏ giúp DNA bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào, phương
pháp biến nạp gene qua ống phấn
Kể từ khi tạo được cây chuyển gene đầu tiên, đến nay kỹ thuật này đã
có những bước tiến rất lớn. Những thành công của nó không chỉ giới hạn ở
những cây mang tính chất mô hình như thuốc lá và các cây họ cà, mf còn
đạt được những kết quả ứng dụng ở một số cây trồng quan trọng. Vì thế
chúng ta có cơ sở để hy vọng rằng trong tương lai kỹ thuật gene sẽ trở
thành một công cụ hỗ trợ không thể thiếu được của chọn giống thực vật.
II. Kỹ thuật chuyển gene
1. Những nguyên tắc chung của kỹ thuật chuyển gene
Có một số yếu tố sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gene.
Không phải tất cả các tế bào trong cơ thể đều có tính toàn thể, các cây
khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gene
lạ. Một loại cây nào đó có thể được biến nạp khi nó có khả năng tái sinh

và chấp nhận sự biến nạp. Mô tế bào là một tập hợp của nhiều tế bào có
phản ứng khác nhau khi gặp một yếu tố tác động đến. Một số ít tế bào
trong cây có khả năng tái sinh và chấp nhận sự biến nạp. Những tế bào


179
khác chỉ có một trong hai khả năng ấy. Một số lớn các tế bào trong cơ thể
có khả năng điều chỉnh được khả năng đó, một số khác ngược lại không
thể làm được. Tương quan giữa các quần thể tế bào kiểu như vậy phụ
thuộc vào loài, kiểu gene, cơ quan, thậm chí tùy từng vùng trong một cơ
quan.
Một trong các cơ chế có thể chuyển các tế bào từ trạng thái tiềm ẩn
sang trạng thái thực sự có khả năng tái sinh là sự xuất hiện thương tổn trên
cơ thể. Phản ứng với sự thương tổn có lẽ là cơ sở sinh học cho sự tăng
sinh và tái sinh của các tế bào soma. Tuy nhiên phản ứng này khác nhau
giữa các loài cây, cũng như giữa các nhóm tế bào trong cùng một cây. Nói
chung các cây hòa thảo và các cây họ đậu phản ứng này xảy ra rất yếu.
Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA. Vì thế gene chỉ có thể được
đưa vào tế bào thông qua Agrobacterium, virus, bằng phương pháp vi tiêm
hay bằng súng bắn gene. Việc chuyển gene chỉ thành công khi đưa được
gene vào nhóm tế bào có khả năng tái sinh và tiếp nhận gene lạ. Tuy
nhiên, khả năng biến nạp không có liên quan chặt chẽ với khả năng biểu
hiện của gene được biến nạp. DNA không phải của virus có thể liên kết
với hệ gene của vật chủ và không di chuyển từ tế bào này qua tế bào khác.
Trong khi đó các DNA của virus có thể không liên kết với hệ gene của vật
chủ, thậm chí cả khi có rất nhiều bản sao trong tế bào chủ. DNA, RNA của
virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và có thể lan truyền khắp
trong cây trừ vùng mô phân sinh.
- Phản ứng của các loại tế bào thực vật với quá trình chuyển gene
Mục đích chính của một quy trình chuyển gene là đưa một cách ổn

định một đoạn DNA vào hệ gene nhân của các tế bào có khả năng phát
triển thành một cây biến nạp. Ở nhiều loài thực vật, sự xác định kiểu tế
bào nào trong cây có khả năng tiếp nhận sự biến nạp là điều khó khăn. Hạt
phấn hay tế bào trứng sau khi được biến nạp có thể được dùng để tạo ra
cây biến nạp hoàn toàn thông qua quá trình thụ tinh bình thường. Hạt phấn
thường được coi là đối tượng lý tưởng để gây biến nạp. Trong khi đó, việc
biến nạp gene vào hợp tử in vivo hay in vitro lại gặp nhiều khó khăn.
Trong trường hợp này, thường phải kết hợp với kỹ thuật cứu phôi. Việc
biến nạp đối với các tế bào đơn của các mô phức tạp như phôi hay mô
phân sinh thường cho ra những cây khảm.
Tính toàn năng của tế bào thực vật đã tạo điều kiện cho sự tái sinh cây
hoàn chỉnh in vitro qua quá trình phát sinh cơ quan (hình thành chồi) hay
phát sinh phôi. Các chồi bất định hay các phôi được hình thành từ các tế
bào đơn được hoạt hóa là những bộ phận dễ dàng tiếp nhận sự biến nạp và
có khả năng cho những cây biến nạp hoàn chỉnh.
2. Các phương pháp chuyển gene ở cây trồng
Khi sử dụng nấm men, nấm, động vật hoặc thực vật như là vật chủ cho
tạo dòng, cần có phương pháp đưa DNA vào trong tế bào của những sinh


180
vật này. Nói chung ở một số loài vi khuẩn tế bào được xử lý bằng dung
dịch muối. Ở tế bào nấm men, sự tiếp nhận DNA tăng lên khi tiếp xúc với
lithium chloride hoặc lithium acetat. Vì vậy người ta sử dụng phương pháp
này thường xuyên khi biến nạp nấm men (Saccharomyce cerevisiae). Đối
với phần lớn sinh vật bậc cao hơn đòi hỏi phương pháp tinh vi hơn.
2.1. Biến nạp vào tế bào riêng lẻ
Cản trở lớn nhất ở sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế
bào. Tế bào động vật không có thành. Trong nuôi cấy, chúng được biến
nạp dễ dàng, đặc biệt khi DNA gắn trên bề mặt của tế bào nhờ kết tủa với

calcium phosphat (hình 9.1a). Các enzyme được sử dụng làm mất thành tế
bào của nấm men, các loại nấm khác, tế bào thực vật, và dưới những điều
kiện thích hợp, người ta có thể tạo ra tế bào trần (hình 9.1b). Tế bào trần
tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng. Có thể thực hiện chuyển nạp bằng
những phương pháp khác nhau:

Hình 9.1 Chuyển DNA ngoại lai vào tế bào
2.1.1. Biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes
mang các gene ngoại lai vào mô và tế bào thực vật. A. tumefaciens có chứa
một plasmid lớn có kích thước khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid (tumor
inducing plasmid) chính là tác nhân truyền bệnh cho cây (Hình 9.2).


181

Hình 9.2 Cấu trúc của Ti-plasmid

Hình 9.3 Agrobacterium gây khối u ở thực vật
A. tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất
là các khối u được hình thành ở ngay chỗ lây nhiễm (Hình 9.3). Sự hình
thành khối u sau đó có thể tiếp tục mà không cần phải có sự hiện diện của
vi khuẩn. Khả năng này có được do A. tumefaciens đã chuyển một đoạn
DNA của Ti-plasmid là T-DNA xâm nhập vào hệ gene của cây bị bệnh.
2.1.1.1. Ti-plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật
Tạo khối u
Tổng hợp nopaline
Sử dụng
nopaline
Điểm xuất phát
sao chép
Các chức năng
chuyển T-DNA