CƠ SỞ DI TRUYỀN CHỌN GIỐNG THỰC VẬT part 5 pps

90
giống thuốc lá sẽ phát triển thành phôi ngay cả khi chuyển vào bao phấn
của một giống khác. Chính kết quả này đã dẫn đến khái niệm “thành bao
phấn” (wall factor), nó giúp cho nhiều nhà nghiên cứu sử dụng “ hiệu ứng
bảo mẫu” (nursing effect) của bao phấn hoàn chỉnh để phát triển sinh sản
đơn tính ở các hạt phấn phân lập cuả nhiều loài. Dịch chiết của bao phấn
cũng có tác dụng kích thích sản xuất phôi hạt phấn (Pollen embryo)
Các nghiên cứu về mô học đã xác định vai trò của nhân tố thành
bao phấn trong việc phát triển phôi hạt phấn. Một số kết quả nghiên cứu
cho thấy glutamine riêng rẽ hoặc phối hợp với serine và myo-inositol có
thể thay thế nhân tố thành bao phấn trong các thí nghiệm nuôi cấy hạt
phấn phân lập.
2.2.3. Môi trường nuôi cấy (culture medium)
Thành phần môi trường nuôi cấy thay đổi tùy thuộc vào kiểu gene và tuổi
của bao phấn cũng như các điều kiện mà ở đó cây cho bao phấn sinh
trưởng. Sinh sản đơn tính tiểu bào tử ở Nicotiana tabacum và Datura
innoxia có thể cảm ứng trên môi trường agar đơn giản chỉ chứa sucrose.
Hạt phấn tiếp tục phát triển trên môi trường như thế cho đến giai đoạn
hình cầu Quá trình sinh trưởng về sau của phôi hạt phấn đòi hỏi phải bổ
sung các muối khoáng vào môi trường.
Các loài không thuộc họ Solanacêa, thành phần môi trường bao
gồm các chất điều khiển sinh trưởng và các hỗn hợp dinh dưỡng phức tạp
như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa. Môi trường của
một số tác giả Trung Quốc như Chu (N6) và Yu Pei dùng cho nuôi cấy
bao phấn ngô. Môi trường N6 cũng được sử dụng cho nuôi cấy bao phấn
các loại ngũ cốc khác như lúa, lúa mạch đen.
2.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và ánh sáng
Gây sốc nhiệt sẽ tăng tần số sinh sản đơn tính tiểu bào tử. Các nụ
được xử lý lạnh ở 3
o

C hoặc 5
o
C trong 72 giờ sẽ kích thích hạt phấn phát
triển thành phôi (xấp xỉ 58%( ở một số loài thuộc họ Solanaceae (Datura,
Nicotiana). Ngược lại bao phấn được duy trì ở 22
o
C trong cùng thời gian
chỉ cho khả năng phát triển phôi khoảng 21% (Nitsch 1974). Nói chung,
gây sốc nhiệt từ 2-5
o
c trong 72 giờ có tác dụng kích thích sự phát triển
không bình thường của giao tử đực và tích lũy hạt phấn đơn nhân.
Cụm hoa hình chùy (panicles) được tách rời của lúa khi xử lý ở
13
o
C trong 10-14 ngày cho tần số hạt phấn tạo mô sẹo (callus) cao nhất.
Cảm ứng sinh sản đơn tính sẽ có hiệu quả cao nếu bao phấn của các loại
ngũ cốc khác (lúa, ngô) được bảo quản ở nhiệt độ thấp trước khi nuôi cấy.
Tần số phát sinh cây đơn bội và sinh trưởng của cây nối chung sẽ

91
tốt hơn nếu chúng được nuôi trong điều kiện chiếu sáng. Hạt phấn phân
lập dường như mẫn cảm với ánh sáng hơn so với cả bao phấn. Ánh sáng
trắng cường độ thấp hoặc ánh sáng huỳnh quang đỏ kích thích phát triển
phôi nhanh hơn trong nuôi cấy thuốc lá phân lập so với ánh sáng trắng
cường độ cao.
2.2.5. Trạng thái sinh lý của cây cho
Bao phấn tách từ cây sinh trưởng trong điều kiện ngắn ngày (8
giờ/ngày) và ở vùng có cường độ ánh sáng cao cho phản ứng tương đối tốt
hơn so với cây dài ngày (16 giờ/ngày) có cùng cường độ chiếu sáng. Sự

phát sinh phôi hạt phấn có thể được cải thiện xa hơn nếu nhiệt độ dưới
điều kiện ngắn ngày duy trì ở 18
o
C. Sự thay đổi mùa vụ thích hợp và tuổi
cây cho bao phấn ảnh hưởng lớn đến phản ứng của các hạt phấn.
3. Sự sinh sản đơn tính đực (Adrogenesis)
Chúng ta đã biết, một vài loài tạo ra thế hệ sau chỉ mang nhiễm sắc
thể của cây mẹ nhờ các quá trình như sinh sản vô phối và sinh sản đơn
tính (được gọi là “gynogenesis”). Có nhiều trường hợp sinh sản tự nhiên
nhờ sinh sản vô tính trong đó con cháu lưỡng bội mang nhiễm sắc thể chỉ
từ cây bố.
Hiện tượng phát sinh cây đơn bội từ các tế bào giao tử đực của
thực vật được gọi là sinh sản đơn tính đực. Có 3 phương thức sinh sản đơn
tính đực:
3.1. Sinh sản đơn tính trực tiếp từ tiểu bào tử
Tiểu bào tử trong bao phấn hay phân lập → phôi → cây đơn bội
(Hình 5.4)
Cấu trúc dạng phôi (Embryoid) phát triển trực tiếp từ hạt phấn.
Quá trình này thường xảy ra trong bao phấn, điển hình là Datura,
Nicotiana, Atroppa.
3.2. Sinh sản vô tính qua mô sẹo
Tiểu bào tử trong bao phấn → mô sẹo → chồi → cây hoàn chỉnh
Cây hoàn chỉnh phát triển từ khối mô sẹo, khối mô này thường
phát triển ra ngoài bao phấn. Ví dụ: Oryza, Brassica, Lolium, Hordeum.
3.3. Sinh sản đơn tính hỗn hợp
Giai đoạn phát triển mô sẹo xảy ra rất ngắn và khó nhận biết. Ví
dụ: Datura.

92

Hình 5.4 Nuôi cấy bao phấn và tiểu bào tử



Hình 5.5
Sự phát sinh phôi soma
Sinh sản đơn tính đực có thể được xác định như là sự đưa hạt phấn
trở lại kiểu bào tử của sự phát triển (Maheshwari và cs, 1983). Khi bao
phấn được nuôi cấy in vitro, một phần của tiểu bào tử được cảm ứng phân
chia tạo thành khối các tế bào gắn kết phát triển thành callus hoặc phôi. Ở
trường hợp cây ngũ cốc, sự phân cực của lần phân chia nguyên nhiễm đầu
tiên đóng vai trò quan trọng trong quá trình này. Nhìn chung, con đường
tạo bào tử được gây ra bởi quá trình nguyên phân đối xứng, làm xáo trộn

93
tính phân cực gốc được yêu cầu để trực tiếp phát triển thể giao tử bình
thường của hạt phấn. Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn cho sản phẩm đơn bội đã
được mô tả ở 237 loài khác nhau thuộc 83 giống và 37 họ và nó được áp
dụng thành công cho việc tạo ra các giống mới của các cây ngũ cốc và các
cây họ cà như lúa, lúa mạch, lúa mì, Tritical, cà chua và thuốc lá
(Dunwell, 1985).

III. Khái niệm, bản chất di truyền và ý nghĩa của tính không tương
hợp (incompatibility)
Tính không tương hợp trong quá trình sinh sản là một khái niệm
chỉ hiện tượng hạt phấn không có khả năng nảy mầm hoặc ống phấn
không thể xâm nhập vào nhuỵ và thực hiện được quá trình thụ tinh.
Tính không tương hợp có thể xảy ra trong phạm vi giữa các cơ

quan sinh sản đực và cái của một cây, gọi là tính không tự hợp (self
incompatibility), nghĩa là cây đó không tự xảy ra quá trình tự thụ phấn
được. Tính không tương hợp cũng có thể xảy ra khi giao phấn giữa các
nhóm cây có quan hệ họ hàng nhất định với nhau, gọi là tính không tương
hợp chéo (incompatibility crosspollination), nghĩa là các cây giữa các
nhóm này không giao phối được với nhau.
Hệ thống tính không tương hợp có thể hoạt động ở trạng thái bào
tử thể (sporophytic incompatibility) hoặc ở trạng thái giao tử thể
(gametophytic incompatibility). Nó kiểm soát sự tương tác giữa vòi nhuỵ
và hạt phấn nhờ sự hoạt động của các allele thuộc locus S. Tuy nhiên ở
một số thực vật người ta cũng đã phát hiện ra hiện tượng không phải chỉ
do một mà là hai hoặc nhiều locus can thiệp vào tính không tương hợp ở
trạng thái giao tử thể.
1. Tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể
East và Mangelsdorf (1925) là những người đầu tiên nêu ra hiện
tượng tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể ở loài thuốc lá
Nicotiana sanderae. Về sau hiện tượng này được xác định là có ở hơn 60
họ thực vật hạt kín điển hình là họ đậu, cà, hoà thảo, mao lương …
Trong hệ thông không tự tương hợp do giao tử điều khiển, hiện
tượng tự xung khắc không biểu hiện ở sự khác biệt do cấu trúc của hoa mà
do chính kiểu gene của cây mang hoa đó điều khiển (sporophyte), hoặc
bằng chính kiểu gene của hạt phấn gây ra chứ không phải do kiểu gene
của cây đó quyết định
Đặc điểm của hệ thống tính không tương hợp ở trạng thái giao tử
thể: Phản ứng tự xung khắc do đơn gene có nhiều allele điều khiển. Locus

94
S là một locus đa allele. Tùy từng loài mà số lượng allele đó có thể rất
khác nhau. Ví dụ ở cây cỏ ba lá, loài Trifolium hybridum có 22 allele, còn
ở loài T. pratense có 212 allele.

Kiểu gen của từng tiểu bào tử quy định kiểu hình của hạt phấn. Ví
thế những hạt phấn chứa allele khác nhau sẽ hoạt động không giống nhau
và chúng độc lập với nhau về phản ứng đối với vòi nhụy. Ví dụ, cây có
kiểu gen S
1
S
2
sẽ cho ra hai loại hạt phấn S
1
và S
2
. Allele S
1
và S
2
hoạt
động độc lập với nhau, giữa chúng không có mối quan hệ trội lặn hay một
sự tương tác nào khác.
Phản ứng của tính không hợp xảy ra giữa hạt phấn (n) và mô vòi
nhụy (2n) là cố định cho từng loài.
Hạt phấn mang một allele nào đó sẽ không nảy mầm hoặc không
sinh trưởng được trong mô vòi nhụy có chứa chính allele đó. Ví dụ sự giao
phối S
1
S
2
× S
1
S
2

là không xảy ra do hạt phấn S
1
hay S
2
không thể nảy
mầm hoặc ống phấn không thể sinh trưởng được trong mô vòi nhụy S
1
S
2
.
Ví thế, có thể thấy rằng tính không tự hợp nằm trong tính không hợp ở
trạng thái thể giao tử.

Tất cả hạt phấn được tạo ra từ cây S
1
S
2
Núm nhụy

Vòi nhụy

Kiểu gen của nhụy
Hình 5.6 Hệ thống giao tử không tương hợp. Phản ứng không tương hợp của
hạt phấn do chính kiểu gene của hạt phấn điều khiển

Ở phấn lớn các họ thực vật được nghiên cứu thì tính không hợp ở
trạng thái thể giao tử do một locus kiểm soát. Tuy nhiên hiện tượng này
cũng có thể do 2 locus (ở một số loài của họ hòa thảo, cà …) hoặc do
nhiều locus khống chế (họ mao lương …). Theo Lundqvist (1956), ở lúa
mach 2 locus S và Z kiểm soát tính không hợp nằm trên những nhiễm sắc

thể khác nhau và hoạt động độc lập với nhau. Khi sự giống nhau giữa hạt
phấn và vòi nhụy xảy ra ở một trong hai locus thì không dẫn đến hiện
tượng không hợp. Sự không hợp chỉ xuất hiện khi hạt phấn và vòi nhụy có
sự giống nhau về thành phần allele ở cả hai locus. Điều này dẫn đến sự gia

95
tăng về tần số giao phấn chéo so với trường hợp chỉ do 1 locus kiểm soát.
2. Tính không tương hợp ở trạng thái bào tử thể
Hệ thống tính không tương hợp ở trạng thái bào tử thể được
Hughes và Babcock (1950) phát hiện ở các loài Crepies foetida và
Parthenium argentatum. Hiện tượng này khá phổ biến ở các họ hoa chữ
thập và hoa kép, như họ cải, cúc … Ở một số loài, tính không tương hợp ở
trạng thái bào tử thể còn gắn liền với sự đa hình của hoa nhằm tăng cường
sự ngoại phối.
Đặc điểm của hệ thống tính không tương hợp ở trạng thái bào tử thể:
- Giống như hệ thống tính không tương hợp giao tử thể, tính không
tương hợp bào tử thể cũng do một locus đa allele kiểm soát, nhưng quy
mô biến dị rộng hơn và việc xác định kiểu gene phức tạp hơn, do có hiện
tượng tính trội
- Tính không tương hợp bào tử thể chịu sự kiểm soát của nhân
lưỡng bội ở trạng thái bào tử thể, hoạt động (kiểu hình) của hạt phấn hay
ống phấn do kiểu gene lưỡng bội của cơ thể 2n quy định.


Sự nảy
mầm của
hạt phấn bị
khóa

Thành tế bào nhụy

Màng sinh chất

Hạt
phấn
Hình 5.7 Thể bào tử tạo phấn hoa S
1
S
2
tổng hợp cả SCR
1
và SCR
2
hợp nhất
vào cả hai loại hạt phấn S
1
và S
2
, trong đó: SLG (S-locus glycoprotein) mã hóa
một phần thể nhận (receptor) có trong thành tế bào núm nhụy; SRK (S-receptor
kinase) mã hóa cho phấn khác của thể nhận. Kinase gắn các nhóm phosphate
của protein khác. Kinase là protein xuyên màng, gắn vào màng sinh chất của tế
bào núm nhụy; SCR (S-locus Cystein-rich protein) mã hóa tuyến tiết cho cùng
một thể nhận.
Về nguyên tắc, hạt phấn không nẩy mầm ở đầu nhụy (lưỡng bội)
của hoa chứa cả 2 allele ở thể bào tử tạo ra hạt phấn. Chẳng hạn, hạt phấn
S
2
được tạo ra bố mẹ S
1

S
2
, không thể nẩy mầm trên đầu nhụy của cây
S
1
S
3
. Nguyên nhân, thể bào tử S
1
S
2
tạo hạt phấn, tổng hợp cả SCR
1
và
SCR
2
đã gắn vào cả hạt phấn S
1
và S
2
. Nếu phân tử SCR gắn vào thể nhận

96
(receptor) trên nhụy, enzyme kinase sẽ khởi động hàng loạt sự kiện dẫn
đến ngăn cản sự nẩy mầm của hạt phấn trên núm nhụy (Hình 5.7). Nếu
con đường này không được khởi động (như hạt phấn của cây S
1
S
2
trên

núm nhụy S
3
S
4
) hạt phấn nảy mầm thành công.

Vùng mã
hóa của
receptor

Vùng mã hóa
của cùng
receptor

Tiểu phần mã
hóa kinase của
receptor

Hình 5.8 Cấu trúc các locus S ở thể bào tử
của câ
y
S
1
S
2
- Giữa các allele có trong hạt phấn và vòi nhụy có mối tương tác,
mà thường là quan hệ trội - lặn. Chẳng hạn, khi ở cả hạt phấn và vòi nhụy
có tính trội hoàn toàn của một allele này đối với các allele khác và theo
một kiểu giống nhau thì xảy ra hiện tượng không tương hợp chéo giữa một
số nhóm có kiểu gene khác nhau. Vì thế tính không tương hợp chéo là một

dạng của tính không tương hợp bào tử thể. Giả sử, S
1
> S
2
, S
3
, S
4
… thì
kiểu gene S
1
S
2
sẽ có phản ứng không tương hợp với các kiểu gene S
1
S
3
,
S
1
S
4
. Tính không tương hợp sẽ trở nên phức tạp hơn nếu quan hệ trội - lặn
giữa các allele trong locus S thể hiện không giống nhau ở hạt phấn và vòi
nhụy. Ví dụ nếu S
1
> S
2
ở cả hạt phấn và vòi nhụy, còn S
1

> S
3
ở hạt phấn,
S
3
> S
1
ở vòi nhụy thì S
1
S
2
(mẹ) × S
1
S
3
là không tương hợp trong khi đó
phép lai nghịch S
1
S
3
(mẹ) × S
1
S
2
lại tương hợp.

Tất cả hạt phấn được tạo ra từ cây S
1
S
2

Núm nhụy

Vòi nhụy

Kiểu gen của nhụy
Hình 5.9 Hệ thống không tương hợp bào tử thể. Phản ứng bất hợp của hạt
phấn do kiểu gene của cây (sporophyte) đã sinh ra nó, trong khi đó vòi nhụy sự
bất hợp được điều khiển do chính kiểu gene của nó.

97
3. Tính không tương hợp đa hình
Ở một số loài Primula vulgaris, Lythrum salicaria tính không
tương hợp được tăng cường do hiện tượng đa hình trong cấu trúc hoa, vòi
nhụy hoặc chỉ nhị có thể có các dạng dài, ngắn hay trung bình. Hoặc do
hiện tượng đối lập về độ lớn giữa hạt phấn với tế bào ở núm nhụy. Dạng
cây vòi nhụy dài thường có tế bào núm nhụy to nhưng hạt phấn lại bé,
ngược lại dạng cây vòi nhụy ngắn có tế bào núm nhụy bé nhưng hạt phấn
lại to.
Hiện tượng vòi nhụy ngắn và dài do 2 allele S và s kiểm soát. Sự
giao phối chỉ xảy ra ở phép lai nhụy dài (ss) × nhụy ngắn (Ss) hoặc nhụy
ngắn (Ss) × nhụy dài (ss). Ở F
1
cho tỷ lệ 1 nhụy ngắn : 1 nhụy dài. Nếu
cho các cây cùng kiểu nhụy ngắn hoặc nhụy dài giao phối với nhau (Ss ×
Ss hay ss × ss) thì do tính không hợp được kiểm soát ở bào tử thể nên hạt
phấn S hay s trong trường hợp này kém phát triển hoặc không phát triển.
4. Tính tương hợp giả
Ở các cây có tính tương hợp, đôi khi cũng xảy ra hiện tượng tương
hợp giả. Nguyên nhân có thể do:
- Sự tự thụ phấn nhân tạo xảy ra nhiều lần

- Tác động của một số nhân tố môi trường như nhiệt độ, ẩm độ,
ánh sáng. Nhiệt độ thấp ở giai đoạn nở hoa có thể làm yếu phản ứng của
tính không tương hợp. Nhiệt độ cao có thể phá hủy sản phẩm của gene S
- Tính tương hợp giả có thể tăng lên ở giai đoạn đầu và cuối của
thời kỳ nở hoa. Nguyên nhân do trong các vòi nhụy non có thể thiếu
những sản phẩm của các allele S hoặc nồng độ của chúng chưa đủ để ức
chế sự sinh trưởng của ống phấn. Vào cuối thời kỳ nở hoa, do sự trao đổi
chất xảy ra yếu nên phản ứng của tính không tương hợp cũng giảm sút.
- Tính tương hợp giả cũng có thể xuất hiện do sự bất hoạt hoặc đột biến
của những allele S nhất định hoặc do tác động của những allele khác.
Ngoài ra, một số hóa chất như acid boric hoặc hormone sinh trưởng có thể
gây ra tính tương hợp giả.
5. Ý nghĩa của tính không tương hợp trong chọn giống
- Hiện tượng đa bội với tính không tương hợp
Phản ứng của tính không tương hợp ở trạng thái giao tử thể và bào tử thể
có khác nhau
+ Ở hệ thông tính không tương hợp giao tử thể, khi ở trạng thái lưỡng bội,
tính không tương hợp phụ thuộc vào tác dụng độc lập của allele S có mặt
trong hạt phấn đơn bội. Khi ở trạng thái đa bội, hạt phấn lưỡng bội chứa

98
không phải là 1 mà là 2 allele S. Tác dụng cạnh tranh cuả 2 allele này
trong cùng một hạt phấn làm rối loạn phản ứng của tính không tương hợp.
Vì thế, ở các dạng đa bội, tính không tương hợp thường bị phá hủy.
+ Ở hệ thống tính không tương hợp bào tử thể: hiện tượng đa bội không
phá hủy phản ứng của tính không tương hợp. Nguyên nhân do giữa các
allele khác nhau mối quan hệ trội -lặn đã được xác định.
- Lai xa với tính không tương hợp
Trong lai xa giữa các loài với nhau, kết quả của phép lai phụ thuộc
vào việc sử dụng bố mẹ có liên quan đến tính không tương hợp như thế

nào. Ở các họ Solanaceae, Compositae, Cruciferae, Linaceae … thường
lai xa khác loài chỉ thành công khi dạng mẹ có tính tự hợp còn dạng bố có
tính không tự hợp. Nguyên nhân có lẽ do các allele không tự hợp có khả
năng ức chế các allele tự hợp.
- Mối quan hệ giữa tính không tương hợp với các kiểu hạt phấn
Ở thực vật hạt kín, quá trình phát sinh các tiểu bào tử xảy ra theo 2
kiểu:
+ Kiểu hạt phấn hai nhân: Khi hạt phấn chín, ở trạng thái sẵn sàng
thụ tinh (sau khi tứ tử được hình thành vài ngày), nhân đơn bội trong hạt
phấn trải qua một lần nguyên phân cho ra 2 nhân là nhân sinh sản và nhân
sinh dưỡng. Sau đó, đến lúc hạt phấn nảy mầm trên vòi nhụy, trong ông
phấn xảy ra một lần nguyên phân nữa của nhân sinh sản cho ra 2 tinh tử.
Kiểu này thường thấy ở phần lớn thực vật hạt kín.
+ Kiểu hạt phấn ba nhân: Với kiểu hạt phấn này, khi ở trạng thái
sẵn sàng thụ tinh, trong nó đã chứa 3 nhân (1 nhân sinh dưỡng và 2 tinh
tử) do kết quả của 2 lần nguyên phân liên tiếp.Kiểu hạt phấn này thường
gặp ở họ hòa thảo và họ cúc.
Brewbaker (1957) nhận thấy có sự phụ thuộc giữa 2 kiểu hạt phấn
nói trên với tính không tương hợp. Thực vật có kiểu hạt phấn hai nhân
thường gắn liền với tính không tương hợp giao tử thể. Các loài có kiểu hạt
phấn ba nhân thường có biểu hiện tính không tương hợp bào tử thể. Với
những loài đa hình, hạt phấn của chúng có thể là kiểu hai nhân hay ba
nhân, nhưng đều thuộc hệ thống tính không tương hợp bào tử thể.
Ngoài ra, có sự tương ứng giữa kiểu hạt phấn và nơi xảy ra phản
ứng của tính không tương hợp. Ở các loài có kiểu hạt phấn ba nhân, nơi
xảy ra phản ứng là núm nhụy, do vậy nó tác động đến sự nảy mầm của hạt
phấn. Trong khi đó những thực vật có kiểu hạt phấn hai nhân, phản ứng
xảy ra khi ống phấn đang xâm nhập vào vòi nhụy, vì thế nó ảnh hưởng đến
sự sinh trưởng của ống phấn.

99
Như vậy có một mối liên quan giữa tính không tương hợp, nơi xảy
ra phản ứng và kiểu hạt phấn, hay chính là thời điểm xảy ra nguyên phân
lần thứ hai trong hạt phấn.
- Tạo dòng đồng hợp tử bằng phương pháp tự phối
Hệ thống di truyền tính không tương hợp có ứng dụng thực tiễn
lớn trong quá trình chọn giống theo ưu thế lai, mà không cần khử đực ở
dạng mẹ. Để thu được các dạng con lai có ưu thế cao nhờ sử dụng tính
không tương hợp, cần phải thu được các dòng đồnghợp tử về các allele S
bằng phương pháp tự thụ phấn nhân tạo qua 3-4 thế hệ. Tính đồng hợp tử
theo các allele khác nhau của các dòng đảm bảo quá trình thụ tinh của các
cây mẹ bằng hạt phấn của các dòng khác để thu 100% hạt lai.
- Khắc phục tính không lai được giữa các loài
+ Ức chế sinh lý: có thể sử dụng một số tác nhân gây ức chế như
nhiệt độ cao, tia phóng xạ hay các hóa chất ức chế sự tổng hợp RNA hay
protein … tác động vào nơi xảy ra phản ứng của tính tương hợp hay không
tương hợp (núm nhụy hay vòi nhụy)
+ Loại bỏ tính không tương hợp trong quá trình giao phối nhờ đột
biến
Tính không tự tương hợp ở trạng thái bào tử thể không thích hợp
cho các nghiên cứu đột biến, trong khi đó tính không tương hợp ở trạng
thái giao tử thể rất thích hợp Trong thực tế, một hạt phấn đột biến hữu
thụ nào đó cho phép xâm nhập được vào túi noãn và truyền những đặc
điểm đột biến cho thế hệ sau. Sau khi xử lý nụ hoa đang giảm phân bằng
tác nhân gây đột biến sẽ hình thành nên hàng triệu hạt phấn như vậy. các
hạt phấn này có thể được hình thành nhờ hiện tượng locus S bị mất hoạt
tính hoàn toàn hoặc một phần, hoặc do locus này bị biến mất do hiện
tượng mất đoạn nhiễm sắc thể. Nhiều trường hợp các đột biến không làm
thay đổi kiểu hình hạt phấn nhưng đã bị biến đổi nên vòi nhụy không nhận
diện được chúng.

Các dạng đột biến tự hợp đã được tạo ra nhờ phóng xạ ở nhiều chi
thực vật như: Oenothera, Prunus, Nicotiana, Petunia và Trifolium.
+ Khắc phục tính không tương hợp khi lai giữa các loài
Một số chi thực vật, sử dụng phóng xạ để xử lý giao tử đực hoặc cái khắc
phục được hiện tượng không tương hợp khi lai giữa các loài. Điển hình là
nhờ đó lai thành công giữa hai loài thuốc lá N. glauca và N. forgetiana.
Có thể sử dụng các phương pháp khác để khắc phục tính bất thụ
khi lai khác loài như trộn hạt phấn đã bị làm hỏng bằng methanol với hạt
phấn không tương hợp, hoặc trộn hạt phấn không tương hợp với một

100
lượng protein được chiết ra từ bao phấn tương hợp.

Câu hỏi ôn tập

1. Sinh sản vô tính là gì? gồm những dạng nào? Ý nghĩa của sinh sản vô
phối trong chọn giống thực vật.
2. Trình bày các nhân tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn.
3. Hãy nêu các phương thức sinh sản đơn tính đực?
4. Bản chất di truyền của tính không tương hợp
5. Ý nghĩa của tính không tương hợp trong chọn giống.

Tài liệu tham khảo

1. Grain. 2001. Apomixis: The plant breeder’s dream. Seedling, Grain
Publications, Vol 18, Issue 3.
2. Trần Đình Long. 1997. Chọn giống cây trồng. NXB Nông nghiệp.
3. Nguyễn Hoàng Lộc. 1998. Bài giảng nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Đại học Khoa học Huế.
4. Paul M. Pechan and Petr Smykal. 2001. Androgenesis: Affecting the

fate of the male gametophyte. Physiologia Plantarum, vol 111.
5. Lê Duy Thành. 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa
học và Kỹ thuật.
6. Yang Wei-Cai. 2002. Self-incompatibility and Ubiquitin/26 proteasome
pathway: A sexual link revealed. Institute of Genetics and Developmental
Biology, Beijing China.

101
Chương 6
Các Phương pháp trong Chọn giống
Thực vật

I. Các phương pháp chọn lọc cơ bản
Chọn lọc là một trong những phương pháp cơ bản và quan trọng được
ứng dụng rộng rãi trong chọn giống. Có hai kiểu chọn lọc cơ bản, đó là:
chọn lọc theo kiểu hình và chọn lọc theo kiểu gene; nhưng tất cả đều dựa
trên cơ sở là nguồn biến dị di truyền của sinh vật.
Ngày nay chúng ta đều biết rằng, chỉ có các biến dị di truyền (các đột
biến, biến dị tổ hợp) mới đóng vai trò là nguồn cung cấp nguyên liệu cho
quá trình chọn lọc và tiến hoá của sinh vật.
Trong khi Darwin xây dựng thuyết chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân
tạo, ông cũng đã phân bịêt được các biến dị di truyền (biến dị không xác
định) và biến dị không di truyền (biến dị xác định), nhưng chưa giải thích
được nguyên nhân của chúng. Về vai trò sáng tạo của chọn lọc,
+ Chọn lọc tự nhiên
Theo quan điểm của Darwin, sinh vật không ngừng phát sinh các biến
dị cá thể trong quá trình sinh sản và dưới tác dụng của các điều kiện môi
trường sống. Chỉ những biến dị nào có lợi cho bản thân sinh vật thì được
giữ lại, còn các biến dị nào không có lợi thì bị đào thải. Chọn lọc tự nhiên
thường xuyên diễn ra, giúp cho sinh vật mang các biến đổi thích nghi trên

cơ thể ngày càng hợp lý. Có những trường hợp chọn lọc tự nhiên thúc đẩy
và hỗ trợ cho chọn lọc nhân tạo, làm cho quá trình chọn lọc phát huy
nhanh hơn. Ví dụ, đặc tính chống chịu sâu bệnh, chịu hạn của cây trồng
vừa có lợi cho con người, vừa có lợi cho sinh vật. Ngược lại, đối với một
số đặc tính như rụng hạt ở cây ngũ cốc, chất lượng nông sản cao thì giữa
chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo mâu thuẫn nhau. Do vậy sự thúc
đẩy quá trình hình thành giống mới xảy ra chậm hơn. Vì vậy trong công
tác chọn giống, chọn lọc nhân tạo có tác dụng vô cùng quan trọng để tạo
ra giống mới.
+ Chọn lọc nhân tạo
Darwin là người đầu tiên tổng kết đầy đủ nhất về vai trò tác dụng của
tác dụng nhân tạo. Theo Darwin, biến dị, di truyền và chọn lọc là ba yếu tố
quyết định sự tiến hoá của sinh vật. Chọn lọc nhân tạo đã tích luỹ những
biến dị có lợi và loại bỏ những biến dị không có lợi cho con người. Chính

102
chọn lọc nhân tạo đã tạo nên các đặc điểm thích nghi kỳ diệu trên cơ thể
vật nuôi, cây trồng (phù hợp với các thị hiếu thẩm mỹ và nhu cầu về kinh
tế của con người). Nếu như trong chọn lọc tự nhiên, động lực của chọn lọc
là đấu tranh sinh tồn, thì trong chọn lọc nhân tạo động lực thúc đẩy chính
là lợi ích kinh tế của con người.
II. Các nhân tố ảnh hưởng đến chọn lọc
1. Hệ thống sinh sản của cây trồng
Ở cây tự thụ phấn(autogamous), do đặc điểm sinh học về cấu tạo hoa,
việc lai tạo với cây trồng khác trong cùng loài gặp nhiều khó khăn. Mặt
khác, phần lớn cây tự thụ phấn là đồng hợp tử. Hạt giống thương phẩm
của nó đựơc sản xuất bằng phương pháp tự thụ phấn. Còn ở các cây giao
phấn hay thụ phấn chéo, việc lai tạo trong tự nhiên xảy ra thuận lợi. Đặc
điểm của những cây dị giao là dị hợp tử, do vậy hiệu ứng trội sẽ đóng góp
việc hình thành các tính trạng.

Phương pháp chọn giống ở cây sinh sản vô tính nói chung là các biến
dị xảy ra đều tạo nên các kiểu gene đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. Chọn ra
kiểu gene mong muốn trong môi trường nhất định sẽ tạo ra các dòng vô
tính phục vụ sản xuất. Ở đây nhân tố môi trường có tác động nhất định đến
các hệ thống sinh sản của cây.
2. Hiện tượng ưu thế lai
Ưu thế lai là hiện tượng thường gặp ở tất cả các loài cây giao phấn và
một số loài cây tự thụ như: đậu tương, cà chua, lúa mì, lúa Hạt lai
thương mại hiện nay đã được áp dụng rộng rãi ở cả các cây tự thụ phấn và
cây giao phấn (xem chương 4).
3. Cấu trúc của bộ máy di truyền tế bào
Mức độ đa bội có ảnh hưởng nhất định đến chiến lược chọn giống cây
trồng: tứ bội thể được dùng thông dụng ở các loài cây thức ăn gia súc
nhằm làm tăng sản lượng chất khô và các đặc tính tốt khác. Việc chọn lọc
một tính trạng nào đó như khả năng chống chịu sâu bệnh của củ cải
đường, khoai tây bằng cách chọn các dạng tam bội tỏ ra có hiệu quả hơn.
4. Tính trạng số lượng và tính trạng chất lượng
Tuỳ theo tính trạng nhà chọn giống quan tâm là tính trạng số lượng
hay tính trạng chất lượng mà có các phương pháp chọn lọc khác nhau.
Thông thường, tính trạng chất lượng được kiểm tra bởi một gene, còn tính
trạng số lượng do nhiều gene kiểm tra và chịu ảnh hưởng lớn bởi môi
trường và tác động qua lại giữa các gene.
Đối với tính trạng số lượng, phương pháp chọn giống thường được áp

103
dụng là chọn lọc theo chu kỳ hay chọn lọc hồi quy. Càng có nhiều gene
tham gia thì sẽ ít có cơ hôi tạo ra sự ngẫu nhiên để đạt được một tổ hợp
gene tốt nhất của một chu kỳ chọn lọc. Do vậy cần có sự phối hợp của
chọn lọc nhằm làm tăng các tổ hợp tốt nhất ở chu kỳ tiếp theo. Trong
trường hợp này, phương pháp chọn giống hồi quy giúp thu được các tính

trạng tốt ở mỗi chu kỳ.
5. Sự hoạt động của các gene (xem cơ sở di truyền học của hiện tượng ưu
thế lai, chương 4)
III. Các nguyên tắc cơ bản của chọn lọc
Ngoài những nguyên nhân khách quan ảnh hưởng đến quá trình chọn
lọc như mức độ biến dị của tính trạng được chọn à phương pháp chọn lọc,
thì nguyên nhân chủ quan cũng góp phần quan trọng và mang tính quyết
định, do vậy cần tuân thủ các nguyên tắc cơ bản khi chọn lọc.
(1) Có mục tiêu và phương hướng: Mục tiêu và phương hướng của
nhà chọn giống càng cụ thể và rõ ràng thì công tác chọn giống càng nhanh
chóng có hiệu quả.
(2) Chọn vật liệu khởi đầu thích hợp: Nguyên tắc này mang tính quyết
định đối với công tác chọn giống. Ví dụ, khi muốn tạo ra cây trồng có tính
chịu rét, chịu hạn, chịu mặn hoặc khả năng chống chịu sâu bệnh v.v. cần
chọn những vật liệu có các gene chống chịu về những đặc tính này và cần
được thực tiễn sản xuất thừa nhận các đặc tính này trên quy mô lớn.
(3) Cần dựa vào tính trạng trực tiếp và tính trạng tổng hợp: Các tính
trạng có mối quan hệ mật thiết với nhau, sự tương quan này còn phụ thuộc
vào nhiều yếu tố. Việc phát hiện ra mối tương quan càng sớm bao nhiêu
thì kết quả chọn lọc càng nhanh bấy nhiêu. Ví dụ, tính trạng chịu hạn của
cây ngoài các đặc điểm về cấu tạo bộ rễ ra thì đặc điểm về kích thước lá,
đường kính lá, đặc điểm về hình dáng là góp phần quan trọng cho tính
trạng tổng hợp chịu hạn của cây trồng.
(4) Vật liệu chọn giống cần đảm bảo trồng trong điều kiện đồng đều
và thích hợp: Đây là nguyên tắc bắt buộc, vì chỉ có trong những điều kiện
phù hợp như vậy, các đặc tính hay tính trạng của giống cây trồng mới biểu
hiện ra và thông qua công việc đánh giá, quá trình chọn lọc đó mới đảm
bảo tính khách quan và chính xác.
(5) Ruộng chọn giống cần áp dụng các biện pháp kỹ thuật phù hợp:
Muốn đánh giá tiềm năng năng suất của giống cây trồng, cần áp dụng

những biện pháp kỹ thuật tối ưu về đất đai, thời vụ phân bón, tưới tiêu
Còn muốn đánh giá giống trong điều kiện sản xuất thì áp dụng các quy
trình kỹ thuật ngoài sản xuất mà không có bất kỳ một sự ưu tiên nào ngoài

104
việc chọn lọc sao cho các giống ngày càng trở nên thuần chủng.
(6) Cần chọn lọc theo đúng mục tiêu đề ra và phải chọn lọc trong môi
trường phù hợp: Chẳng hạn, trong việc chọn các giống chịu mặn, chịu
úng, chịu hạn thì các vật liệu chọn giống cần trồng trong điều kiện tự
nhiên tương ứng như: mặn, úng, hạn Hoặc trong đánh giá khả năng
kháng bệnh cũng vậy, vật liệu chọn tạo cần gieo trồng trong mùa vụ có
dịch bệnh phát sinh mạnh nhất.
(7) Kết hợp chọn lọc ở trong phòng và trên đồng ruộng trong suốt thời
kỳ sinh trưởng của giống, khi đó các giống cây trồng mới được chọn ra
một cách nhanh chóng và chuẩn xác.
IV. Sơ lược về các phương pháp chọn giống truyền thống và hiện
đại thông dụng
1. Một số phương pháp chọn giống truyền thống
Chọn giống là một quá trình liên tục để thoả mãn nhu cầu thay đổi của
một nền nông nghiệp. Nói chung, các phương pháp chọn giống truyền
thống vẫn tương đối phổ biến, trong đó tái tổ hợp giữa các kiểu gene ưu tú
vẫn là khâu then chốt để tạo ra vật liệu chọn giống cho quá trình chọn lọc.
Các phương pháp chọn giống truyền thống dựa vào sự tái tổ hợp của các
gene và nhiễm sắc thể thông qua sinh sản hữu tính của sinh vật (tuân theo
các nguyên lý di truyền cổ điển của Mendel và Morgan).
Các quy trình chọn giống khác nhau đã được sử dụng cho các kiểu cây
trồng khác nhau, tuỳ thuộc vào phương thức sinh sản là tự thụ phấn hay
giao phấn. Đối với lúa, phương pháp chọn giống theo phả hệ là thông
dụng nhất. Các bố mẹ được chọn kỹ lưỡng và lai thông qua thụ phấn bằng
tay (Hình 6.1). Trong chương trình chọn giống kháng, thông thường một

dạng bố mẹ là giống đã được cải tiến và dạng kia là một giống kháng hoặc
loài hoang dại. Phải mất vài thế hệ lai và chọn lọc để chuyển gene kháng
cho dạng bố mẹ đã được cải tiến và phục hồi các đặc tính mong muốn của
dạng bố mẹ cải tiến (năng suất, chất lượng hạt, v.v.). Tại Viện nghiên cứu
lúa quốc tế (IRRI, đặt tại Manila - Philippines), mỗi năm có tới hàng chục
ngàn dòng chọn giống được kiểm tra và lưu giữ về khả năng kháng rầy
nâu và sâu hại lá. Tại đây đã lai tạo và phóng thích nhiều giống lúa mới
(IR-8, IR-36, IR-64, ) góp phần tạo nên cuộc "cách mạng xanh" trong
những năm 1960 và 1970 ở các nước đang phát triển.

105


Hình 6.1 Hình trên: Hoa lúa, khử nhị đực và tiến hành lai giữa hai giống lúa
thông qua thụ phấn bằng tay. Hình dưới: Một giống lúa bán lùn, năng suất cao
gọi là IR-8 (trái), một phần của cuộc cách mạng sanh lần thứ hai, được IRRI tạo
ra bằng cách lai chéo giữa hai dòng lúa bố mẹ: PETA từ Indonesia (giữa) và
DGWG từ Trung Quốc (phải). Với thân thấp hơn và cứng hơn, giống lúa mới có
thể mang các bông to hơn nhưng không bị đổ.

2. Một số phương pháp chọn giống hiện đại
Sự phát triển của công nghệ sinh học (CNSH) trong vài thập niên gần
đây đã và đang đưa lại các kiểu quy trình chọn giống mới. Trong chọn lọc
với sự hỗ trợ của marker (marker-assisted selection), các marker DNA
liên kết với các tính trạng quan tâm (ví dụ các gene kháng côn trùng) được
sử dụng để cải tiến hiệu quả của chọn giống. Các marker DNA còn hỗ trợ
cho việc phân tích số lượng, tác dụng và sự đinh khu trên nhiễm sắc thể
của các gene thứ yếu ở thực vật, thông qua một quá trình gọi là phân tích
các locus tính trạng số lượng (quantitative trait loci = QTL).
Kỹ thuật di truyền (genetic engineering) cho phép sử dụng bất kỳ sinh

vật nào để làm nguồn cung cấp tính kháng. Chẳng hạn, vi khuẩn Bacillus
thuringiensis (Bt) là nguồn cung cấp gene mã hoá các độc tố diệt côn
trùng đã được dùng để tạo ra giống lúa chuyển gene kháng được loại sâu
đục thân (xem Hình 6.2). Vấn đề này sẽ được thảo luận kỹ ở chương 9.
CNSH bao gồm một các loạt phương pháp và quy trình sử dụng cơ thể
sống và các hệ thống sinh học được biến đổi để tạo ra sản phẩm mới và
tăng năng suất cây trồng, vật nuôi. Trong trồng trọt và nhất là trong cải

106
lương giống cây trồng, hầu hết các quy trình CNSH sử dụng nuôi cấy mô
và tế bào in vitro từ mảnh mô, tế bào phân lập, mô sẹo, tế bào trần hoặc
mô phôi để thực hiện quá trình biến đổi, rồi sau đó cho tái sinh cây hoàn
chỉnh. Điều cần thiết là phải hiểu và nắm vững sự tái sinh cây từ nuôi cấy
mô đối với từng loại xác định trước khi áp dụng để bổ sung cho phương
pháp chọn tạo giống hiện hành. kết quả nuôi cấy mô và tế bào mấy chục
năm qua cho thấy nuôi cấy tế bào từ các loài cây trồng khác nhau hay các
kiểu gene khác nhau trong nội bộ một loài, hoặc thậm chí từ các bộ phận
khác nhau trên cùng một cây có phản ứng khác nhau đối với một kỹ thuật
nuôi cấy cụ thể. Điều này đã cản trở việc xây dựng các qui trình đồng nhất
để có thể áp dụng thường xuyên trong các chương trình chọn giống cho
nhiều loài cây trồng. Để ứng dụng kỹ thuật này trong chương trình chọn
tạo giống cần phải vạch ra các quy trình cụ thể cho từng loại vật liệu di
truyền và môi trường nuôi cấy.
2.1. Nuôi cấy mô và tế bào
Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn năng của tế bào
soma ở thực vật và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đường
nuôi cấy mô và tế bào. Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh cây hoàn
chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào trần (protoplast) mới trở thành hiện thực.
Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật phân lập
hay mảnh mô thực vật tách rời trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện

vô trùng. Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Người ta đã xây dựng được các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh
cây cho một số loài như thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn
quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng trên đồng ruộng, như bông và đậu lấy
hạt thì việc thiết lập các quy trình để áp dụng rộng rãi khó hơn nhiều. Ở
những loài cây này tần số tái sinh thấp và kết quả tái sinh từ nuôi cấy
không chỉ thay đổi theo loài mà còn phụ thuộc vào kiểu gene trong một
loài, nguồn mô cấy, tuổi và sức khoẻ của mô cấy, môi trường dinh dưỡng
và nhiều yếu tố khác. Nhìn chung, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào cho
phép nhân nhanh những kiểu gene có giá trị hay vật liệu chọn giống trong
một môi trường có kiểm soát. Một số khả năng ứng dụng của nhân nhanh
đối với cây trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị hợp tử, nhân kiểu gene
tự bất hợp, nhân bố mẹ bất dục trong chương trình chọn giống lai, nhân
vật liệu sạch bệnh, bảo quản và trao đổi nguồn gene quốc tế
Ở đây chỉ giới thiệu sơ lược một số kỹ thuật nuôi cấy in vitro liên
quan trực tiếp tới quá trình chọn giống.
(1) Nuôi cấy phôi, noãn và thụ phấn in vitro
Các nhà chọn giống chủ yếu đã và đang tận dụng biến dị di truyền

107
hiện có trong nguồn gene trồng trọt bằng cách sử dụng nhiều sơ đồ lai và
chọn lọc khác nhau. Tuy nhiên với thâm canh và độc canh, một ít kiểu
gene chọn lọc về những tính trạng có ý nghĩa kinh tế biến dị di truyền
ngày một giảm trong nguồn gene trồng trọt. Thậm chí trong một số trường
hợp, nguồn biến dị đối với một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế không đủ
thoả mãn, ví dụ: tính kháng bệnh vàng lụi, sâu đục thân, chịu mặn ở lúa
Để khắc phục những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất,
nhà chọn giống cần có nguồn gene kháng sâu bệnh từ các loài hoang dại
thân thuộc hoặc không thân thuộc. Một khó khăn lớn khi sử dụng các loài
hoang dại để lai với cây trồng là tính bất hợp khi lai. Trong một số trường

hợp, các phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường
yếu và không có khả năng sống do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ
không đầy đủ và chúng thường bị chết trong một thời gian ngắn sau khi
hình thành hợp tử và không thể phát triển thành hạt có khả năng sống. Vì
vậy, nuôi cấy phôi hay cứu phôi là một phương pháp để khắc phục hàng
rào bất hợp, bảo đảm để phôi non sinh trưởng, nảy mần, và phát triển
thành cây con. Thông qua sử dụng phương pháp này người ta đã tạo ra
nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng như lúa mì, lúa nước, đại
mạch, bông, đậu, đỗ, các loài cây ăn quả, cây cảnh và nhờ vậy nhiều gene
có ích đã được chuyển vào cây trồng.
Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy để cứu phôi từ các tổ hợp lai
xa mà không cần tách phôi ra khỏi noãn. Noãn chứa phôi lai non được
tách ngay sau khi thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi
trường dinh dưỡng. Bằng con đường nuôi cấy noãn phôi có thể nuôi cấy ở
giai đoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát triển
trong noãn có môi trường hoá học và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy
bên ngoài noãn.
Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập noãn chưa thụ tinh,
cấy noãn trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng, và thụ
phấn cho noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua thành noãn và
túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng. Phương pháp này đã được áp dụng để
tạo con lai giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào
noãn bình thường sau khi thụ phấn.
(2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây đơn bội:
Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải
tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F
2
lớn và chọn lọc các dòng mong
muốn trong các thế hệ phân ly từ F
2

đến F
7
để cuối cùng tạo ra các dòng
đồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để
tạo ra các dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do

108
đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống mới.
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu
bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra
cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây
lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy
bao phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn bội kép có thể được
sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn.
Thời gian cần thiết để tạo ra một giống hay một dòng tự phối bằng phương
pháp đơn bội kép được rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền
thống. Các dòng đơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải thiện hiệu quả
chọn lọc đối với nhiều tính trạng vì trong quần thể không có phương sai
trội, đồng thời gene lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này đã được
áp dụng thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra giống lúa và lúa mì.
Tuy nhiên, hạn chế trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả
năng nuôi cấy khó và tính đặc thù cao của kiểu gene. Ví dụ, các nhà chọn
giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu quả bằng các nhà
chọn giống lúa Japonica do các kiểu gene Indica khó nuôi cấy hạt phấn
còn bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của bao phấn, điều kiện sinh lý
của cây cho phấn, điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh
dưỡng, điều kiện nuôi cấy và hiệu quả lưỡng bội hoá bằng colchicine.
(3) Biến dị dòng soma và chọn lọc dòng tế bào:
Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối
và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây dồng nhất

và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú.
Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây
trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy
trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao
gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc
thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh.
Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là
biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983).
Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và
mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của
genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di
truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng
và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng
soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus Fiji, bệnh
đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977);
khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng

109
sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh
ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996).
Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả
năng chọn lọc dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế
bào trong một không gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc
bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn
lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến
dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới
có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các đặc
tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt, nhôm,
axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả
năng kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gene phân

lập kháng với các điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong
chương trình chọn giống.
2.2. Lai tế bào soma hay dung hợp tế bào trần
Trong các phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tính là
phương pháp cơ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao
tử. Tuy nhiên, việc lai hữu tính chỉ thực hiện được các cá thể trong một
loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Lai giữa các loài có quan hệ xa
nhau thường rất khó khăn vì hàng rào cản trở việc lai xa làm giảm tính
hữu dụng của kỹ thuật lai trong việc tăng nguồn biến dị di truyền cần thiết
cho việc cải lương cây trồng. Vì vậy một phương pháp mới được đề xuất
bởi Keller và Melchers (1973) là nhằm khắc phục hàng rào lai hữu tính
giữa các loài có quan hệ họ hàng xa nhau là phương pháp dung hợp tế bào
soma hay dung hợp tế bào trần.
Đó là kỹ thuật cho phép hợp nhất các tế bào soma không có thành tế
bào của cá thể hoặ các loài khác nhau, và sau đó cho tái sinh cây lai từ các
tế bào đã dung hợp. Trong lai hữu tính, các tính trạng liên quan DNA bào
quan kiểm soát hoàn toàn giống cây mẹ vì không có sự tổ hợp các cơ quan
tử của bố và mẹ. Trong dung hợp tế bào trần, ngoài khả năng dung hợp
nhân, còn có khả năng xảy ra hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di
truyền hoàn toàn mới. Ty thể và lạp thể của hai tế bào khác nhau có thể
hợp nhất hoặc là tái tổ hợp tạo ra một tế bào dị tế bào chất, gọi là cybrid.
Như vậy, bằng con đường lai soma người ta có thể thu được tổ hợp mới
của lạp thể hay ty thể và tương tác mới giữa nhân và tế bào chất. Dung
hợp tế bào trần là một quá trình nhiều giai đoạn, bao gồm việc phân lập tế
bào trần từ các loài khác nhau, dung hợp tế bào trần từ hai loài khác nhau,
giám định, nhân sản phẩm dung hợp và cuối cùng là tái sinh cây lai hữu
dục là sản phẩm dung hợp.

110
Lai soma được sử dụng có hiệu quả để kết hợp khả năng kháng các

bệnh virus ở khoai tây từ các kiểu gene trong một loài cũng như từ các loài
khác nhau (Venzen, 1994). Lai soma là một phương tiện có hiệu quả để
chuyển bất dục đực tế bào chất và đa dạng hoá nguồn bất dục trong việc
tạo giống lai.
2.3. Chuyển gene hay kỹ thuật di truyền
Kỹ thuật di truyền thực vật là sự chuyển một đoạn DNA lạ, thường là
một gene có chức năng mã hoá cho một thông tin hay đặc điểm có lợi nhất
định vào tế bào thực vật như khả năng kháng sâu hại, kháng virus hay
kháng thuốc trừ cỏ. Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gene lạ được lồng
vào genome, biểu hiện ra kiểu hình va di truyền ổn định được gọi là cây
chuyển gene. Gene lạ có thể có nguồn gốc từ vi sinh vật thực vật, động
vật, thậm chí gene tổng hợp. Quá trình chuyển gene bao gồm nhiều bước:
xác định và phân lập gene có ích, nhân gene, chuyển gene vào tế bào thực
vật, tái sinh tế bào chuyển nạp thành cây hoàn chỉnh và đánh giá sự biểu
hiện của gene.
Trong các bước trên, kỹ thuật chuyển gene đóng một vai trò quyết
định đối với kết quả chuyển gene. Chuyển gene vào tế bào thực vật có thể
thực hiện gián tiếp thông qua vector hay trực tiếp. Sau đây là ví dụ về sự
chuyển qua thông qua Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens.
A. tumefaciens là vi khuẩn gây khối u ở cây hai lá mầm và phản ứng
hình thành khối u là kết quả của sự kiện chuyển gene tự nhiên. Mấu chốt
của sự hình thành khối u là Ti-plastmid (Ti: tumor inducing) của vi khuẩn
chứa các gene mã hoá sinh tổng hợp các horrmon (auxin và cytokinin)
chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u. Các gene này nằm trong vùng
T-DNA (transfered DNA) của plasmid. Khi plasmid xâm nhập vào tế bào
của cây, cùng T-DNA được chuyển vào genome. Đoạn T-DNA là yếu tố
di truyền vận động trong quá trình chuyển gene.
Ý nghĩa của Agrobacterium trong kỹ thuật di truyền là khả năng
chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật. Lợi dụng phương thức chuyển

gene tự nhiên các nhà khoa học thực vật dựa vào kỹ thuật phân tử điều
khiển T-DNA để thiết kế hệ vector bằng cách lồng đoạn DNA cần chuyển
gắn vào cùng T-DNA của vi khuẩn, sau đó cho cây nhiễm các vi khuẩn
chứa plasmid đã biến đổi. Để lây nhiễm người ta nuôi cấy tế bào trần thực
vật, tế bào đơn trong trong mooi trường lồng, hoặc đặt mô cấy trong dung
dịch huyền phù chứa vi khuẩn có plasmid biến đổi trong một thời gian
nhất định. Quá trình chuyển nạp thông qua Agrobacterium gồm các bước
sau đây: