GIÁO TRÌNH BỆNH TRUYỀN NHIỄM THÚ Y (PHẦN ĐẠI CƯƠNG) part 6 docx

108


dƣơng tính thể hiện ở dạng các tế bào vi khuẩn ở ống tƣơng ứng ngƣng tụ
lại làm đục cả ống nghiệm, trong khi ở các ống âm tính vi khuẩn (kháng
nguyên) chìm xuống đáy ống làm dịch trở nên trong. Ngƣng kết thấy rõ ở
những ống nghiệm có nồng độ kháng nguyên và kháng thể gần bằng nhau,
vì vậy ở những ống có nồng độ kháng thể cao (đầu dãy) có thể không thấy
ngƣng kết. Nhờ phản ứng này ta có thể xác định đƣợc hiệu giá kháng thể
trong huyết thanh bị kiểm. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của
huyết thanh (hoặc nhũ thanh, ) còn cho phản ứng dƣơng tính.
Phản ứng ngƣng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện
kháng nguyên đặc hiệu tức là xác định typ/dạng huyết thanh học của vi
khuẩn hoặc vi sinh vật khác. Khi đó thƣờng phải có bộ kháng huyết thanh
đa giá (xác định nhóm) và đơn giá (xác định typ).
Trong thực tế các virut đƣợc coi là kháng nguyên hòa tan và không
thể thực hiện phản ứng ngƣng kết. Tuy vậy, bằng cách gắn kết virut lên
hồng cầu ngƣời ta có thể tạo đƣợc kháng nguyên hữu hình đặc hiệu virut
có tính ngƣng kết hoàn hảo với kháng thể và đƣợc áp dụng trong một biến
thể của phản ứng huyết thanh học, phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp
phát hiện và bán định lƣợng kháng thể. Đồng thời, kháng nguyên này cũng
còn đƣợc sử dụng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp
phát hiện kháng nguyên bằng cách lấy kháng huyết thanh chuẩn cho tiếp
xúc trƣớc với bệnh phẩm chứa kháng nguyên nghi rồi đo lại hàm lƣợng
(hiệu giá) kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu gián tiếp. Sự sụt
giảm hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn chứng tỏ có kháng
nguyên đặc hiệu trung hòa kháng thể đó.
1.3. Phản ứng cố định bổ thể
Phản ứng cố định bổ thể (CFR) hay còn gọi là phản ứng kết hợp bổ
thể là phản ứng huyết thanh học phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng

thể thông qua vận dụng thuộc tính gây dung giải tế bào, kể cả tế bào hồng
cầu, của hệ thống bổ thể (các enzym trong huyết tƣơng động vật có vai trò
trong miễn dịch không đặc hiệu) một khi hệ thống này đƣợc hoạt hóa nhờ
kháng thể khi kháng thể hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể. Phản
ứng này gồm hai hệ thống: 1) hệ thống phản ứng chính và 2) hệ thống
phản ứng hiển thị (hệ thống phụ, hay hệ thống dung huyết).
Bổ thể là một hệ thống gồm 9 protein (C1 đến C9) hòa tan trong
huyết tƣơng ở trạng thái vô hoạt và có thể đƣợc hoạt hóa theo phản ứng
dây chuyền từ C1 đến C9 một khi C1 đƣợc hoạt hóa (con đƣờng cổ điển)

109


hoặc C3 đƣợc hoạt hóa (con đƣờng nhánh). Yếu tố C1 đƣợc hoạt hóa nhờ
phần Fc của kháng thể khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên (Fc từ
trạng thái vô hoạt sang trạng thái hoạt động của một enzym). Khi tổ hợp bổ
thể đƣợc hoạt hóa một số yếu tố sản phẩm của bổ thể đƣợc hình thành và
gắn kết lên cấu trúc màng tế bào chất làm hình thành tổ hợp tấn công màng
(MAC - membrane attacking complex) là những lỗ khổng bất thƣờng trên
màng tế bào chất qua đó tế bào chất bị thoát ra ngoài (dung bào) (bên cạnh
các phản ứng quá mẫn, viêm và hoạt hóa thực bào, ). Tuy nhiên, các bổ
thể là những protein mẫn cảm với nhiệt. Đun ở 56 - 58 °C nhanh chóng
làm biến tính bổ thể, trong khi nếu đun ở nhiệt độ này sau 30 phút kháng
thể vẫn giữ nguyên hoạt tính.
Ở hệ thống phản ứng chính ngƣời ta trộn kháng nguyên chuẩn (1
ml) với huyết thanh (1 ml) cần kiểm đã đƣợc đun nóng vô hoạt bổ thể rồi
thêm vào đó một lượng ở nồng độ làm việc của bổ thể là huyết thanh chuột
lang tƣơi mới. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C thì cho thêm vào đó một lƣợng
nhất định (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Lại ủ nhƣ trên, sau 15 phút
kiểm tra kết quả. Phản ứng chính dƣơng tính thể hiện dƣới dạng hồng cầu

chìm xuống đáy ống nghiệm (phản ứng phụ âm tính). Ngƣợc lại, phản ứng
chính âm tính thể hiện dƣới dạng dịch trong ống nghiệm có màu đỏ của
hemoglobin (phản ứng phụ dƣơng tính).
Nồng độ làm việc của bổ thể được xác định trước (vào đầu ngày
làm việc) nhờ dãy ống pha loãng dần huyết thanh chuột lang trong nƣớc
sinh lý (1 ml mỗi ống) rồi cho vào tất cả các ống trong dãy một lƣợng (1
ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Trong hệ thống phụ này có kháng
nguyên là huyền dịch 6% tế bào hồng cầu cừu trộn đều với kháng thể là
kháng huyết thanh thỏ tối miễn dịch (mẫn hóa) với hồng cầu cừu gọi là
hemolysin. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C, trong ống nghiệm có đủ bổ thể sẽ
thấy dung huyết (dịch đỏ đều) còn các ống có nồng độ bổ thể quá thấp sẽ
không xuất hiện dung huyết (hồng cầu chìm xuống đáy ống, dịch trên
trong). Nồng độ làm việc của bổ thể là ở ống có độ pha loãng lớn nhất còn
cho phản ứng dung huyết. Pha huyết thanh chuột lang tƣơi mới ở nồng độ
này ta sẽ có dung dịch bổ thể ở nồng độ làm việc. Lượng làm việc của bổ
thể đƣợc giữ ổn định (1 ml) trong quá trình thực hiện phản ứng.
1.4. Phản ứng HI (ngăn trở ngƣng kết hồng cầu)
Nhiều virut có thuộc tính ngƣng kết hồng cầu. Chúng có thụ thể
tƣơng ứng với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, do đó kết nối các hồng cầu
liền kề lại với nhau thành mạng đa chiều không chìm xuống đáy tự nhiên

110


nhờ tỷ trọng của hồng cầu cao hơn tỷ trọng dung dịch sinh lý. Phản ứng
ngƣng kết hồng cầu của virut giúp ta phát hiện đƣợc sự hiện diện cũng nhƣ
bán định lƣợng virut tƣơng ứng. Đồng thời, ngƣời ta còn lợi dụng đặc tính
này của virut để xác định sự hiện diện cũng nhƣ hiệu giá kháng thể đặc
hiệu trong huyết thanh cần kiểm dƣới dạng phản ứng ngăn trở ngƣng kết
hồng cầu (HI: hemagglutination inhibition reaction).

Trƣớc tiên ngƣời ta phải thực hiện phản ứng ngƣng kết hồng cầu để
xác định hiệu giá của virut chuẩn rồi trên cơ sở đó pha dịch virut làm việc
với hiệu giá 4 đơn vị ngƣng kết (4 HA). Phản ứng này đƣợc thực hiện trên
khay nhựa vi chuẩn độ (Microtitration plate) 96 lỗ (mỗi lỗ chứa khoảng 0,4
ml) đáy U hoặc V.
Cho vào mỗi lỗ 50 μl nƣớc sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50
μl virut, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển nhƣ vậy
đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Hai lỗ 11 và 12 dùng làm đối chứng âm
tính chỉ chứa nƣớc sinh lý để xác định thời điểm đọc kết quả tốt nhất. Cho
50 μl huyền dịch hồng cầu thích hợp (0,5% hoặc 1%, khối lƣợng tƣơi trên
thể tích, luôn ở trạng thái khuấy đều). Trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ
phòng 15 đến 60 phút, đọc kết quả khi hai lỗ 11 và 12 có hồng cầu chìm
xuống tâm đáy lỗ hoàn toàn. Hồng cầu ngƣng kết tạo mạng đa chiều không
chìm xuống tâm đáy lỗ khay mà dàn trải đều khắp lỗ hoặc nếu chìm chúng
cũng tỏa rộng và thƣờng tạo một lớp nhăn nheo khắp mặt đáy lỗ. Hiệu giá
kháng thể là độ pha loãng lớn nhất còn cho kết quả dƣơng tính. Nồng độ
virut làm việc phải chứa 4 HA chính là nồng độ của virut ở độ pha loãng
cách đó hai lỗ khay (2
2
=4). Pha virut gốc để có nồng độ này rồi kiểm tra lại
với phản ứng trong 4 lỗ khay có nồng độ 2 HA, 1 HA, 1/2 HA và 1/4 HA.
Nếu dịch virut bị nhạt (tức ít nhất có một trong hai lỗ nửa bên trái không
ngƣng kết) thì pha thêm virut cho đủ sao cho hai lỗ đầu có ngƣng kết rõ
còn hai lỗ sau không thấy ngƣng kết. Ngƣợc lại nếu virut quá đặc (có ít
nhất ba lỗ ngƣng kết) thì pha thêm nƣớc sinh lý để vừa đủ tạo ngƣng kết ở
hai lỗ.
Phản ứng HI cũng đƣợc tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ,
mỗi dãy lỗ khay cho một phản ứng. Đầu tiên pha huyết thanh theo cấp số
2. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nƣớc sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl
huyết thanh kiểm, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển

nhƣ vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ
11 (đối chứng âm) 50 μl dịch virut làm việc 4 HA, trộn đều và ủ 5 - 10
phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào tất cả các lỗ (lỗ 1 đến 12) 50 μl

111


huyền dịch hồng cầu đã dùng để xác định hiệu giá HA. Hai lỗ 11 và 12,
nhƣ vậy, dùng làm đối chứng âm tính (chứa chỉ virut và hồng cầu) và
dƣơng tính (chứa chỉ nƣớc sinh lý và hồng cầu). Để ở nhiệt độ phòng và
đọc kết quả sau 15 đến 60 phút phụ thuộc vào kết quả chìm hồng cầu ở lỗ
thứ 12 (đối chứng HI dƣơng tính: hồng cầu phải chìm hoàn toàn xuống tâm
đáy lỗ khay). Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh
mà ở đó còn thấy ngăn trở đƣợc ngƣng kết (hồng cầu chìm xuống đáy lỗ).
1.5. Các phƣơng pháp kháng thể đánh dấu
Các phƣơng pháp kháng thể đánh dấu gồm phƣơng pháp miễn dịch
huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch enzym và miễn dịch ferritin.
Phƣơng pháp cuối cùng áp dụng với kính hiển vi điện tử để kiểm tra cấu
trúc phân tử trên bề mặt tế bào hoặc tổ chức nhờ mật độ điện tử cao của
ferritin, không phổ biến trong chẩn đoán.
Bản chất các phƣơng pháp này là sử dụng các kháng thể (thƣờng là
kháng thể đơn dòng) đƣợc gắn kết (đánh dấu) với một chất phát huỳnh
quang (kháng thể đánh dấu huỳnh quang), hoặc chất phóng xạ (kháng thể
đánh dấu phóng xạ), hoặc một enzym chuyển hóa làm cơ chất không màu
phát màu (kháng thể đánh dấu enzym). Chúng còn đƣợc gọi chung là
conjugat (conjugate). Ta có conjugat trực tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu
epitop của mầm bệnh hay đối tƣợng cần nghiên cứu, hoặc là conjugat gián
tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu gamma-globulin của loài động vật cần
nghiên cứu.
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp bắt đầu bằng việc cố

định kháng nguyên cần kiểm lên phiến kính hiển vi (thƣờng bằng aceton
lạnh), sau đó phủ conjugat trực tiếp 30 phút trong buồng ẩm. Rửa bằng
nƣớc rồi soi kính hiển vi huỳnh quang (trong tối) với bức xạ kích thích
thích hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang gắn conjugat, nếu thấy tiêu bản
phát màu huỳnh quang đặc hiệu là kết quả dƣơng tính.
Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp bắt đầu bằng việc cố
định kháng nguyên chuẩn nếu để phát hiện kháng thể (hoặc kháng nguyên
cần kiểm) lên phiến kính hiển vi, sau đó phủ huyết thanh cần kiểm (hoặc
kháng huyết thanh chuẩn), cho tiếp xúc 30 phút ở trong buồng ẩm, rửa
bằng nƣớc rồi lại phủ bằng conjugat huỳnh quang gián tiếp chống gamma-
globullin loài cho huyết thanh lần phủ trƣớc. Sau 30 phút tiếp xúc lại rửa,
để khô và hiển vi huỳnh quang. Kết quả dƣơng tính tƣơng tự phƣơng pháp
miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Tuy nhiên, phƣơng pháp gián tiếp có độ

112


nhạy cao hơn và tiện hơn do có thể nghiên cứu kháng nguyên lẫn nghiên
cứu kháng thể.
Phản ứng miễn dịch phóng xạ sử dụng conjugat phóng xạ. Tiến
trình cũng bắt đầu bằng việc cố định (trên phiến kính hoặc trên màng), phủ
và rửa tƣơng tự phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Tuy nhiên, kết quả phản
ứng đƣợc đọc nhờ ép bản phản ứng lên một phim X-quang, để khoảng 30 -
60 phút thì rửa hiển thị phim. Vệt đen trên phim tƣơng ứng vị trí tiêu bản
cho phép kết luận kết quả dƣơng tính. Cũng có thể đọc kết quả nhờ ống đo
phóng xạ (scintillation counter) bằng cách cho tiêu bản tiếp xúc với đầu dò
đọc của thiết bị.
Phản ứng miễn dịch enzym gồm nhiều biến thể, sử dụng khay nhựa
polystyren để hấp phụ protein (ELISA) hoặc cố định protein lên màng
nitrocelluloza hay nylon (immunoanalysis, hay Western analysis). Các

biến thể này đều có thể sử dụng conjugat trực tiếp lẫn conjugat gián tiếp.
Phản ứng trực tiếp chỉ phát hiện đƣợc kháng nguyên trong khi phản ứng
gián tiếp phát hiện đƣợc cả kháng nguyên (nếu có kháng thể đặc hiệu) và
kháng thể (nếu có kháng nguyên đặc hiệu).
Phƣơng pháp ELISA trực tiếp bắt đầu từ việc cố định (hấp phụ)
protein kháng nguyên cần kiểm lên đáy và thành của lỗ khay chuyên dụng
(khay ELISA) nhờ phản ứng kiềm của môi trƣờng trong một đêm. Sau khi
rửa khay bằng dung dịch PBS (3 lần, có pha Tween 20 ở mức 0,5%), khay
đƣợc phủ bổ sung bằng dung dịch protein huyết thanh bê hoặc albumin
trứng (blocking), rửa lại rồi cho conjugat trực tiếp tiếp xúc kháng nguyên
trong khoảng 1 giờ, rửa rồi cho dung dịch cơ chất của enzym vào lỗ. Nếu
phản ứng kháng nguyên - kháng thể dƣơng tính, cơ chất enzym sẽ chuyển
từ không màu sang có màu và có thể đo đƣợc bằng quang phổ kế. Phản
ứng chuyển màu có thể dừng bằng dung dịch NaOH hoặc H
2
SO
4
. Enzym
có thể là phosphataza kiềm hoặc peroxidaza. Cơ chất enzym có thể là
tetramethyl benzidin hoặc axit 5-aminosalicylic đối với enzym peroxidaza.
Các chất này đều phải pha mới và pha thêm H
2
O
2
3% trƣớc khi dùng hiển
thị phản ứng.
Phƣơng pháp ELISA trực tiếp còn có thể thực hiện dƣới dạng phản
ứng sandwich ("bánh mỳ kẹp thịt"), khi đó lỗ khay đƣợc gắn sẵn kháng thể
đặc hiệu với kháng nguyên cần kiểm để tăng hiệu quả gắn kết kháng
nguyên với lỗ khay. Đầu tiên cho kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể gắn

trong lỗ khay khoảng 30 phút rồi rửa các lỗ khay. Tiếp theo sau là phủ lỗ
khay bằng conjugat đặc hiệu và các bƣớc rửa và hiển thị nhƣ đã mô tả ở

113


trên. Trong lỗ khay cho phản ứng dƣơng tính nhƣ vậy có ba lớp, một lớp
kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể, nên phƣơng pháp đƣợc gọi là "bánh
mỳ kẹp thịt".
Phƣơng pháp ELISA gián tiếp sử dụng conjugat gián tiếp, tức là
kháng thể đặc hiệu với gamma-globulin loài cung cấp kháng huyết thanh
đặc hiệu (trong phát hiện kháng nguyên) hoặc huyết thanh cần kiểm (trong
phát hiện kháng thể) đƣợc đánh dấu enzym.
Tƣơng tự phƣơng pháp ELISA trực tiếp, trong phƣơng pháp ELISA
gián tiếp để phát hiện kháng nguyên ban đầu ngƣời ta cố định dịch bệnh
phẩm hay kháng nguyên (hấp phụ trong dịch pH cao, thƣờng qua đêm) vào
lỗ khay, rửa rồi phủ bổ sung (blocking) bằng dịch protein (không kháng
thể, ở nhiệt độ thấp). Sau đó phủ kháng nguyên bằng kháng huyết thanh
đặc hiệu mầm bệnh, rửa rồi lại phủ bằng dịch conjugat gián tiếp. Sau khi
rửa kỹ, phủ lỗ khay bằng cơ chất enzym thích hợp. Phản ứng màu giúp ta
xác định sự hiện diện của kháng nguyên đặc hiệu.
Để phát hiện kháng thể bằng phƣơng pháp ELISA gián tiếp, cần cố
định kháng nguyên đặc hiệu vào lỗ khay, hấp phụ bổ sung bằng protein
không kháng thể, sau khi rửa ngƣời ta cho huyết thanh cần kiểm vào cho
tiếp xúc với kháng nguyên. Sau bƣớc rửa, cho dịch conjugat gián tiếp, lại
rửa kỹ rồi cho cơ chất enzym thích hợp để hiển thị. Phản ứng phát màu của
cơ chất giúp ta xác nhận sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong huyết
thanh cần kiểm.
1.6. Phƣơng pháp điện di miễn dịch
Đây là phƣơng pháp kiểm tra sự hiện diện kháng thể đặc hiệu virut

có bề mặt tích điện âm mạnh và virut tích điện âm mạnh. Nếu cho kháng
nguyên và huyết thanh cần kiểm đƣợc điện di song song trong một bản keo
(gel) agarose hoặc agar thì nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu sẽ
xuất hiện vết kết tủa ở dải giữa hai làn điện di. Phƣơng pháp này thƣờng để
kiểm tra bệnh cảm nhiễm virut Aleutian ở chồn mink.
2. Chẩn đoán bằng phản ứng quá mẫn muộn
Phản ứng quá mẫn muộn để phát hiện miễn dịch tế bào ở trong cơ
thể và vận dụng với một số bệnh thú y hình thành miễn dịch tế bào nhƣ
bệnh lao, bệnh tỵ thƣ, bệnh Johne (á lao) và bệnh sẩy thai truyền nhiễm.
Lấy dịch chiết từ lứa cấy tế bào vi khuẩn nuôi cấy lâu ngày ta đƣợc "dị ứng
nguyên quá mẫn muộn", với bệnh lao gọi là tubercullin, với bệnh sẩy thai

114


truyền nhiễm là brucellin, với bệnh tỵ thƣ là mallein và với bệnh Johne là
johnin. Ngoài ra phản ứng này còn thực hiện với bệnh sán lá gan, sán nang
(Echinococcus), bệnh cảm nhiễm Toxoplasma, bệnh cảm nhiễm nấm
Histoplasma và bệnh nấm sợi của da (do Trichophyton), Các phản ứng
này phát hiện cảm nhiễm trong quá khứ nhƣng nhiều khi là bệnh đang tiến
triển.
Tiêm tubercullin vào trong da (nội bì) nếu phản ứng dƣơng tính ta
thấy chỗ tiêm viêm tấy đỏ và cứng vào khoảng 72 giờ. Các dị ứng nguyên
quá mẫn muộn khác cũng có thể áp dụng và cho kết quả tƣơng tự. Ngoài
ra, ở động vật để tiện thực hiện, phản ứng có thể là dƣới da (tiêm kháng
nguyên vào dƣới da), trong mắt (nhỏ kháng nguyên vào niêm mạc mắt).
Phản ứng dƣới da có thể xác định kết quả nhờ đo độ dày chỗ da bị tiêm
trƣớc khi tiêm và sau khi tiêm 1 - 3 ngày và có thể vận dụng với hầu hết tất
cả các bệnh nêu trên. Riêng bệnh tỵ thƣ ở ngựa phản ứng trong mắt khá
tiện lợi, buộc ngựa cần kiểm tra vào chỗ tránh gió lùa, nhỏ kháng nguyên

vào một mắt để mắt kia làm đối chứng âm. Phản ứng dƣơng tính biểu hiện
viêm kết mạc mắt (sau một ngày) kèm theo dòng ghèn trắng đục, nhầy và
dính chảy ra từ khóe mắt.
IV. Chẩn đoán phân tử thông qua phân tích gen
1. Phương pháp lai phân tử (hybridization)
Các phƣơng pháp lai phân tử (hybridization) có nguyên lý chung là
nếu ADN hai sợi và ARN hai sợi đƣợc biến tính bởi nhiệt hoặc kiềm thì
trở thành một sợi. Nếu hỗn hợp axit nucleic một sợi này với axit nucleic
một sợi khác thì khi gặp điều kiện nhiệt độ nhất định các đoạn axit nucleic
một sợi có trình tự nucleotid tƣơng bổ sẽ kết hợp với nhau nhờ liên kết
hydro. Vì hình thành axit nucleic lai tạp (hybrid) nên phƣơng pháp đƣợc
gọi là hybridization (phƣơng pháp lai, để thuận tiện trong tiếng Việt
thƣờng gọi lai phân tử). Với nguyên lý này, nếu có một đoạn ADN hoặc
ARN có trình tự nucleotid đặc hiệu virut hoặc vi khuẩn ta có thể đánh dấu
bằng (cho kết hợp với) đồng vị phóng xạ, biotin, hoặc digoxygenin rồi
kiểm tra xem nó có lai với ADN hoặc ARN (ở trạng thái một sợi) trong
bệnh phẩm hay không ta có thể phát hiện đƣợc sự hiện diện của mầm bệnh
trong bệnh phẩm. ADN hoặc ARN một sợi đƣợc đánh dấu gọi là "dò" hay
"mẫu dò" (probe).
Phƣơng pháp kiểm xuất biotin lợi dụng avidin và phƣơng pháp
kiểm xuất digoxygenin lợi dụng kháng thể đánh dấu enzym, là những

115


phƣơng pháp phi phóng xạ đƣợc khai phát đã làm các phƣơng pháp lai
phân tử trở nên khả thi trong chẩn đoán. Các phƣơng pháp này so với dùng
đồng vị phóng xạ có nhiều lợi điểm nhƣ khả năng bảo quản dò đƣợc lâu và
có thể áp dụng trong các phòng thí nghiệm thông thƣờng, không lo ô
nhiễm phóng xạ nên có thể tiếp xúc dễ dàng. Tuy nhiên do có độ nhạy thấp

so với phƣơng pháp PCR (sau đây) nên chúng chỉ đƣợc sử dụng trong việc
đồng định hoặc định typ vi sinh vật đã phân lập thuần khiết.
Phƣơng pháp lai phân tử thông thƣờng cần cố định axit nucleic có
trong bệnh phẩm lên màng nylon hoặc nitrocelluloza rồi cho phản ứng với
dò đặc hiệu. Sau đó rửa bỏ các thành phần (kể cả dò) không gắn kết do
không có trình tự tƣơng bổ đặc hiệu với axit nucleic đã cố định và cho hiển
thị dò đặc hiệu. Nếu không thấy đƣợc dò chứng tỏ không có sự tƣơng đồng
trong trình tự nucleotid của dò và của axit nucleic đã cố định. Tùy thuộc
vào phƣơng pháp cố định mà ta có những biến thể dƣới đây.
1.1. Lai khuẩn lạc (colony hybridization)
Phƣơng pháp này dùng để đồng định vi khuẩn mầm bệnh đã phân
lập hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch. Đặt màng nylon lên mặt
môi trƣờng thạch sẽ làm khuẩn lạc in lên màng, hoặc là lấy cặn vi khuẩn
phết lên màng, sau đó bằng phƣơng pháp kiềm làm biến tính axit nucleic
rồi cho phản ứng với dò. Do có thể không cần cấy chuyển và bồi dƣỡng
thuần khiết nên có thể thực thi nhanh việc chẩn đoán. Tuy nhiên, do nhiều
thành phần của tế bào nên phản ứng có thể bị trở ngại và làm việc phán
định kết quả khó khăn.
1.2. Lai đốm (dot hybridization)
Còn gọi là phƣơng pháp thẩm đốm (dot blot), phƣơng pháp này bắt
đầu bằng việc chiết xuất axit nucleic từ bệnh phẩm rồi nhỏ giọt (đốm) lên
màng và cố định axit nucleic trên đó rồi cho phản ứng với dò. Tuy cần
nuôi cấy phân lập lứa cấy thuần vi khuẩn mầm bệnh nhƣng là phƣơng pháp
nhanh chóng do sử dụng axit nucleic không cần tinh khiết đƣợc chiết xuất
bằng phƣơng pháp đơn giản.
1.3. Lai Southern (Southern hybridization)
Phân tử ADN cần kiểm có thể để nguyên hoặc đƣợc cắt bằng
enzym hạn chế rồi điện di để phân đoạn trên gel agarose, sau đó chuyển
các phân đoạn ADN từ gel sang màng nylon rồi cho phản ứng với dò.
Bằng phƣơng pháp này có thể phân tích một cách chi tiết đoạn ADN nào

116


phản ứng với dò nên không chỉ dùng để đồng định mà còn sử dụng để
giám biệt typ. Hơn nữa với các loại mầm bệnh có ADN lớn nhƣ vi khuẩn,
nguyên trùng, ký sinh trùng, thì sau khi phân cắt bằng enzym hạn chế rồi
điện di thì số phân đoạn quá nhiều làm khó phân tích nhƣng với phƣơng
pháp này có thể phân tích đƣợc các mô hình, hay kiểu dạng (pattern), do số
phân đoạn phản ứng với dò trở nên hạn chế tức là chỉ những đoạn ADN
đặc hiệu đƣợc hiển thị vị trí trong làn gel điện di. Sự khác biệt của các kiểu
dạng của các đoạn cắt bởi enzym hạn chế phản ứng với dò đƣợc gọi là tính
đa hình độ dài phân đoạn hạn chế (restriction fragment length
polymorphism).
1.4. Lai khay vi thể (microplate hybridization)
Chiết xuất axit nucleic từ vi sinh vật mầm bệnh, cho hấp phụ cố
định vào đáy lỗ khay vi thể rồi cho phản ứng với dò. Nếu sử dụng phƣơng
pháp kháng thể đánh dấu để phát hiện dò thì phƣơng pháp này tƣơng tự
phản ứng ELISA, có thể phán định và xử lý kết quả tƣơng tự, đồng thời có
thể xử lý chẩn đoán số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm. Hơn nữa, các axit
nucleic từ vi khuẩn mầm bệnh không chỉ có ADN mà còn có ARN thông
tin vốn rất nhiều trong tế bào cũng phản ứng với dò nên độ nhạy của
phƣơng pháp cao.
2. PCR (Phản ứng chuỗi polymeraza)
2.1. Nguyên lý và ứng dụng PCR
Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR: polymerase chain reaction) là
kỹ thuật dựa trên phản ứng tổng hợp ADN nhờ enzym DNA-polymeraza
lặp đi lặp lại mà chỉ một đoạn nhất định của ADN đặc hiệu trong bệnh
phẩm đƣợc tăng lƣợng. DNA-polymeraza (DNA-polymerase) là enzym lấy
ADN một sợi làm khuôn để tổng hợp sợi ADN tƣơng bổ. Quá trình tổng

hợp ADN đƣợc thực hiện nối dài một hƣớng từ đầu 5' đến đầu 3' và tại vị
trí xuất phát của quá trình tổng hợp phải có mặt một đoạn ngắn ADN một
sợi gọi là mồi (primer) tƣơng bổ với ADN khuôn. Nếu tổng hợp đƣợc hai
mồi (một cặp) tƣơng bổ với hai vị trí trên hai sợi khác nhau của một ADN
hai sợi và hƣớng của phản ứng từ một mồi ngƣợc với hƣớng phản ứng từ
mồi kia, tức là kẹp một đoạn cần tăng lƣợng của ADN, thì nếu cho cặp
primer với lƣợng gấp bội vào dịch chứa bệnh phẩm thì phản ứng DNA-
polymeraza sẽ thực hiện lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả là từ vị trí một
mồi ADN đƣợc kéo dài rồi trong chu kỳ tiếp theo lại làm khuôn cho mồi
có chiều ngƣợc lại tổng hợp kéo dài ADN đến quá vị trí của mồi trƣớc.

117


Quá trình tổng hợp lặp đi lặp với một cặp mồi làm cho chỉ đoạn ADN nằm
giữa (tức đƣợc kẹp giữa) hai mồi đƣợc tăng lƣợng theo cấp số nhân. Nếu
số chu kỳ nhiệt là 30 thì đoạn ADN này tăng là 2
30
(tức khoảng 10
9
) lần.
Để thực hiện phản ứng cần có DNA-polymeraza chịu nhiệt và thiết bị luân
nhiệt (thermocycler) tự động hóa, và mỗi chu kỳ phản ứng phải qua ba
bƣớc 1) biến tính ADN hai sợi thành một sợi bằng nhiệt (94 - 95 °C), 2)
nhiệt độ thích hợp để mồi gắn vào trình tự nucleotid đặc hiệu của ADN
bệnh phẩm và 3) nhiệt độ thích hợp phản ứng kéo dài chuỗi ADN nhờ
DNA-polymeraza. Nhiệt độ chu kỳ 2) và 3) phụ thuộc vào thành phần
nucleotid của mồi và khuôn nhƣng có thể vận dụng nhiệt độ gắn mồi
khoảng 60 °C, nhiệt độ phản ứng kéo dài khoảng 70 °C. Thành phần dịch
phản ứng gồm DNA-polymeraza chịu nhiệt (Taq polymerase), hỗn hợp

deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP, gồm 4 loại dATP, dTTP, dCTP và
dGTP), cặp mồi (primer), dung dịch đệm và ADN khuôn (template DNA).
Sản phẩm PCR đƣợc điện di để xác nhận độ dài đặc hiệu của ADN theo lý
luận phải có, thƣờng nhờ điện di song song với ADN dấu phân tử lƣợng
(molecular weight marker DNA). Đôi khi sản phẩm đƣợc lai Southern để
kiểm tra tính đặc hiệu. Để điện di thƣờng dùng gel agarose 0,8% trong
dung dịch đệm acetat-tris, nhuộm ADN bằng ethidium bromid (~50 g/ml)
pha vào agarose trƣớc khi đổ bản gel hoặc pha vào dung dịch điện di sau
khi điện di.
Thời gian gần đây nhờ phát triển kỹ thuật chế primer đánh dấu
huỳnh quang chỉ phát quang khi gắn kết vào ADN và thiết bị phân tích
huỳnh quang tự động ngƣời ta đã phát triển PCR thông thƣờng thành PCR
thực thời (real-time PCR) với năng lực chẩn đoán và phân tích định lƣợng
rất tiện lợi.
Nhờ PCR có thể tăng lƣợng bất kỳ ADN nào có trong bệnh phẩm
nên ta có thể chẩn đoán thông qua phát hiện sự hiện diện của gen đặc hiệu
mầm bệnh mà không cần nuôi cấy phân lập mầm bệnh. Điều này làm cho
việc chẩn đoán các mầm bệnh không nuôi cấy đƣợc trở nên khả thi.
Phƣơng pháp PCR còn đƣợc phối hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử
khác trong nghiên cứu nhƣ mô tả dƣới đây.
2.2. PCR-RFLP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng độ dài đoạn ngẫu
nhiên)
PCR-RFLP là phƣơng pháp so sánh các kiểu dạng (hay mô hình:
pattern) các phân đoạn của sản phẩm PCR đƣợc phân cắt bởi enzym hạn
chế đƣợc phân tách bằng điện di trong gel.

118


2.3. RT-PCR (Phản ứng phiên ngƣợc - chuỗi polymeraza)

RT-PCR là phƣơng pháp kết hợp phản ứng tổng hợp ADN tƣơng
bổ (cDNA) trên khuôn ARN nhờ enzym phiên ngƣợc (RT: reverse
transcriptase) hay enzym tổng hợp ADN phụ thuộc ARN (RNA-dependent
DNA-polymerase) sau đó ADN đƣợc tổng hợp nhờ cặp mồi đặc hiệu trong
hàng loạt chu kỳ luân nhiệt tiếp theo. Nhờ phản ứng này genom của các
virut ARN trở nên có thể tổng hợp bằng PCR.
2.4. PCR-SSCP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng cấu hình lập thể
chuỗi đơn)
Nếu một ADN hai sợi đƣợc biến tính thành một sợi thì ADN một
sợi phụ thuộc vào trình tự nucleotid mà có cấu trúc bậc cao khác nhau và
đặc hiệu. Nếu điện di ADN một sợi này trong gel polyacrylamid phi biến
tính có gia nhiệt thì các cấu trúc bậc cao khác nhau phản ứng khác nhau,
tức cùng độ dài nhƣng dịch chuyển trong điện trƣờng với tốc độ khác nhau
phụ thuộc vào cấu hình lập thể. Phƣơng pháp này gọi là phân tích đa dạng
cấu hình lập thể chuỗi đơn (SSCP: single strand conformation
polymorphism). Có thể phân biệt đƣợc tối thiểu 1 bazơ khác biệt tồn tại
trong các đoạn ADN dài hàng trăm bazơ. Nếu áp dụng kỹ thuật phân tích
này để phân tích sự sai khác có thể có trong trình tự nucleotid của các sản
phẩm PCR thì phƣơng pháp này đƣợc gọi là PCR-SSCP.
2.5. RAPD (ADN sao chép ngẫu nhiên đa hình)
ADN đa hình đƣợc khuyếch đại ngẫu nhiên (random amplified
polymorphic DNA) còn gọi là tổ hợp mơ hồ tính đa hình độ dài khuyếch
đại hay ALP-HA (amplified fragment length polymorphism hazy
association), PCR đƣợc mồi ngẫu nhiên hay AP-PCR (arbitrarily primed
PCR) hay lấy vân tay khuyếch đại ADN (DNA amplification
fingerprinting), Đây là phƣơng pháp đồng định mầm bệnh hoặc định typ
nhờ sử dụng các cặp mồi có tính đặc hiệu tƣơng đối thấp hoặc mồi chế từ
các trình tự lặp trong genom mầm bệnh để thực thi PCR, kết quả là có
hàng loạt sản phẩm PCR với độ dài khác nhau đƣợc hình thành và nhờ
điện di phân tách thành các băng dƣới dạng mã vạch tạo ra những mô hình

(kiểu dạng) đặc trƣng.
3. Điện di axit nucleic
Điện di axit nucleic chiết xuất từ mầm bệnh có thể sử dụng trong
chẩn đoán. Phƣơng pháp này thƣờng áp dụng sau khi phân lập và đồng
định vi sinh vật mầm bệnh và dùng để khu biệt dạng/typ huyết thanh học,

119


và đôi khi trong một dạng huyết thanh học cũng có thể tách biệt tiếp thành
những nhóm nhỏ hơn. Với trƣờng hợp virut ARN hai sợi phân đoạn nhƣ
reovirut và rotavirut có thể phân biệt các virut thuộc các typ huyết thanh
học khác nhau nhờ kiểu dạng điện di ARN phân đoạn. Với các virut ADN
hai sợi nhƣ herpesvirut và adenovirut thì chiết xuất ADN, phân cắt bằng
enzym hạn chế rồi điện di để phân biệt typ dựa vào kiểu dạng enzym hạn
chế. Với vi khuẩn gây bệnh và plasmid đã đƣợc chiết xuất thì điện di, xác
định độ lớn và số lƣợng, phân tích so sánh có thể phân biệt typ huyết thanh
học và typ kháng thuốc. Những phân tích này còn có thể dùng để phân tích
dịch tễ học xác định mối quan hệ giữa các vụ dịch.
V. Phân tích dịch tễ học bệnh truyền nhiễm
Khi nhận biết bệnh phát sinh trong tập đoàn động vật, việc truy tìm
nguyên nhân phát sinh bệnh đó có ý nghĩa đối với việc khống chế và dự
phòng bệnh. Quy trình nghiên cứu thực nghiệm xác định mầm bệnh đã
đƣợc Koch phát biểu trong "Định đề Koch" gồm bốn điểm phải thỏa mãn.
Tuy nhiên, trong thực tế, việc vận dụng định đề Koch không thể thực hiện
đƣợc với nhiều loại bệnh khác nhau. Khi đó, các phƣơng pháp dịch (tễ)
học (epidemiological study) là phƣơng pháp hữu hiệu có thể tuân thủ trong
nghiên cứu mầm bệnh. Nghiên cứu dịch học bao gồm nhiều phƣơng pháp
và có thể nhóm thành hai nhóm: 1) nghiên cứu dịch tễ học mô tả và 2)
nghiên cứu dịch học phân tích.

Điều tra bệnh trong tập đoàn gọi là điều tra dịch (tễ) học hay
nghiên cứu dịch (tễ) học mô tả. Bên cạnh mô tả hiện tƣợng bệnh (mô tả ca
bệnh, mô tả loạt ca bệnh), nghiên cứu dịch tễ học mô tả còn bao gồm quan
sát các điều kiện mà bệnh tật hoặc trở ngại sức khỏe phát sinh. Để biết
thực trạng bệnh tật nhất thiết phải biết bệnh phát sinh trong quần thể nhƣ
thế nào, cho nên khi nắm bắt tình trạng bệnh trong quần thể cần biết những
thông tin liên quan đến toàn bộ quần thể. Vì vậy, nghiên cứu mô tả thƣờng
theo dõi tỷ lệ mới mắc, tỷ lệ hiện mắc hay lƣu hành bệnh so với tổng đàn,
tỷ lệ chết, tuổi, giống, loài mắc, mùa vụ, thời gian, không gian mắc của
bệnh, tập quán chăn nuôi, tỷ lệ động vật đã được tiêm phòng, trong các
nhóm đàn động vật và giải thích các đặc điểm phát sinh của bệnh trong
quần thể động vật. Trên cơ sở những kết quả đó đƣa ra giả thuyết về
nguyên nhân (mầm bệnh) và những điều kiện phát sinh bệnh. Giả thuyết
này sẽ đƣợc dùng để làm cơ sở cho nghiên cứu dịch tễ học phân tích.
Nghiên cứu phân tích có thể là nghiên cứu hồi cứu (còn gọi là
nghiên cứu bệnh chứng - case-control study), trong đó lấy tập đoàn bệnh

120


và tập đoàn chứng không bệnh làm thành hai nhóm đối tƣợng và truy tìm
khả năng tiếp xúc với yếu tố nguy cơ (mầm bệnh theo giả thuyết) nhƣ thế
nào trong quá khứ. Khi có đƣợc một hệ số tƣơng quan thuận cao thì khả
năng kết luận đúng về nguyên nhân bệnh là cao.
Nghiên cứu phân tích cũng có thể là nghiên cứu theo dõi (còn gọi
là nghiên cứu thuần tập - cohort study), trong đó ngƣời nghiên cứu ghi
nhận hai nhóm động vật (cùng loài) có tiếp xúc và không tiếp xúc với yếu
tố nguy cơ (theo giả thuyết) và theo dõi trong thời gian sau đó. Nghiên cứu
này thƣờng đòi hỏi theo dõi kéo dài với số lƣợng động vật lớn để đạt độ tin
cậy cao. Mối quan hệ nhân quả có thể là thuyết phục nếu hệ số tƣơng quan

thuận cao.
Nghiên cứu phân tích cũng còn có thể là nghiên cứu ngang (cross-
sectional study) nghiên cứu các cá thể có mặt trong thời gian nghiên cứu
và tất cả số liệu đƣợc thu thập trong thời gian nghiên cứu nhằm tìm ra mối
liên hệ giữa hiện tƣợng bệnh và yếu tố nguy cơ (mầm bệnh, theo giả
thuyết, đối với bệnh truyền nhiễm). Trong nghiên cứu ngang để có số liệu
thuyết phục cần có những xét nghiệm có độ nhạy cũng nhƣ độ đặc hiệu cao
(phân lập và đồng định mầm bệnh, xét nghiệm kháng thể đặc hiệu, xét
nghiệm kháng nguyên đặc hiệu, xác nhận ADN hay ARN đặc hiệu, ).
Tƣơng tự các nghiên cứu phân tích khác, quan hệ nhân quả là thuyết phục
nếu hệ số tƣơng quan thuận cao.
Dƣới đây trình bày một số phương pháp phân tích số liệu dịch tễ
học để xác nhận mối quan hệ nhân quả (bệnh - mầm bệnh) và đánh giá
hiệu quả của biện pháp (phòng bệnh bằng một vacxin nào đó, ) ứng dụng
trong thực tiễn thú y.
Phân tích nghiên cứu bệnh - chứng: Sau khi quan sát mô tả và hình
thành một giả thuyết nhân quả giữa bệnh và một yếu tố nguy cơ ta có thể
xác nhận quan hệ nhân quả giả thuyết đó. Căn cứ vào giả thuyết nhân quả
đó, nghiên cứu bệnh chứng tiến hành phân tích nhằm tìm ra đƣợc sự khác
biệt giữa nhóm bệnh và nhóm không bệnh trong quan hệ với yếu tố đƣợc
giả thiết là nguyên nhân (yếu tố mầm bệnh).
Phân tích nghiên cứu bệnh - chứng là so sánh tần số cảm nhiễm
một yếu tố (đƣợc coi là) nguy cơ ở nhóm bệnh và nhóm chứng đƣợc lấy
ngẫu nhiên để tính toán về mối kết hợp này. Số liệu dịch tễ học đƣợc thể
hiện ở dƣới dạng bảng liên thông, nhƣ sau:



121

Bệnh
Không bệnh

Bộc lộ với yếu tố nguy cơ
a
b
a+b
Không bộc lộ
c
d
c+d
Cộng
a+c
b+d
a+b+ c+d
Trong đó: a là số động vật bị bệnh mà ta hồi cứu thấy có tiếp xúc yếu tố nguy cơ,
b là số động vật không bệnh nhƣng có tiếp xúc yếu tố nguy cơ, c là số động vật
bệnh nhƣng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, d là số động vật không bệnh cũng
không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, a+b là tổng số cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, c+d là
tổng số không cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, a+c là tổng số động vật mắc bệnh, b+d
là tổng số động vật không mắc bệnh.

Đại lƣợng nguy cơ tƣơng đối (relative risk) RR=[a/(a+b)]/[c/(c+d)]
=a(c+d)/c(a+b) là đại lƣợng giúp xác định mức độ kết hợp giữa bệnh và
bộc lộ với yếu tố nguy cơ. RR>1 nói lên rằng có sự liên quan giữa bệnh và
yếu tố nguy cơ, RR=1 cho thấy không có sự liên quan giữa bệnh và cảm
nhiễm yếu tố nguy cơ, còn RR<1 nói lên một kết hợp âm.
Tƣơng tự, ngƣời ta có thể sử dụng đại lƣợng tỷ suất chênh lệch

(odds ratio) OR=ad/bc làm đại lƣợng kiểm định mức độ kết hợp bệnh với
yếu tố nguy cơ. OR >1 nói lên sự kết hợp và giá trị này càng cao thì sự kết
hợp càng mạnh. OR=1 cho thấy không có sự liên quan giữa bệnh và cảm
nhiễm yếu tố nguy cơ, còn OR<1 nói lên một kết hợp âm.
Phân tích nghiên cứu thuần tập có liên quan đến việc tính tỷ lệ mắc
bệnh ở các nhóm rồi so sánh tỷ lệ này ở nhóm bộc lộ (cảm nhiễm) với yếu
tố nguy cơ (giả thiết) và ở nhóm không bộc lộ. Các số liệu thu thập đƣợc
trình bày ở bảng sau:


Bệnh
Không bệnh

Bộc lộ với yếu tố nguy cơ
a
b
a+b
Không bộc lộ
c
d
c+d
Cộng
a+c
b+d
a+b+ c+d
Trong đó: a là số động vật có tiếp xúc yếu tố nguy cơ bị phát bệnh, b là số động
vật có tiếp xúc yếu tố nguy cơ nhƣng không phát bệnh, c là số động vật bệnh
nhƣng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ, d là số động vật không bệnh cũng không
tiếp xúc yếu tố nguy cơ, a+b là tổng số cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, c+d là tổng
số không cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, a+c là tổng số động vật mắc bệnh, b+d là

tổng số động vật không mắc bệnh.


122


Tƣơng tự nhƣ trên, đại lƣợng nguy cơ tƣơng đối
RR=[a/(a+b)]/[c/(c+d)] =a(c+d)/c(a+b) cũng là đại lƣợng giúp xác định
mức độ kết hợp giữa bệnh và bộc lộ với yếu tố nguy cơ. RR>1 nói lên rằng
có sự liên quan giữa bệnh và yếu tố nguy cơ, RR=1 cho thấy không có sự
liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm yếu tố nguy cơ, còn RR<1 nói lên một
kết hợp âm.
Cũng nhƣ vậy, ngƣời ta có thể sử dụng đại lƣợng tỷ suất chệnh lệch
(odds ratio) OR=ad/bc làm đại lƣợng kiểm định mức độ kết hợp bệnh với
yếu tố nguy cơ. OR >1 nói lên sự kết hợp và giá trị này càng cao thì sự kết
hợp càng mạnh, tức yếu tố nguy cơ (mầm bệnh) giả thuyết là nguyên nhân
của bệnh là có xu hƣớng khẳng định.
Đánh giá ảnh hưởng của tiêm vacxin đối với tỷ lệ mắc bệnh: là một
trong những bài toán thực tiễn đòi hỏi ngay cả khi vacxin đã đƣợc nhà sản
xuất thực nghiệm và khuyến cáo sử dụng. Một trong những phƣơng pháp
là phân tích tính phụ thuộc giữa tỷ lệ gia súc đƣợc tiêm vacxin và tỷ lệ mắc
bệnh (sau khi vacxin theo lý luận phải có hiệu lực) hàng năm. Ví dụ dữ
liệu thu thập đƣợc 10 năm (1990 - 1999) trong bảng sau giúp ta giải quyết
vấn đề này.

Năm
90
91
92
93

94
95
96
97
98
99
Tỷ lệ tiêm vacxin (%)
55
57
63
64
62
68
71
75
74
77
Tỷ lệ mắc bệnh (%)
1,8
1,7
2,1
1,6
1,2
1,4
0,9
0,8
0,8
0,6

Có một số phƣơng pháp xác định mối phụ thuộc giữa hai dãy số

liệu trên. Trong đó, phƣơng pháp xác định hệ số liên quan thứ bậc r
range
là
phƣơng pháp khá tiện lợi. Hệ số liên quan thứ bậc r
range
= 1-{6∑d
2
/[(n(n-
1)(n+1)]} mang giá trị từ -1 đến +1. Giá trị dƣơng chỉ mối tƣơng quan
thuận, tức cùng tăng cùng giảm, giá trị âm chỉ mối tƣơng quan nghịch. Giá
trị từ 0 đến 0,5 chỉ mối phụ thuộc yếu, từ 0,5 đến 0,8 chỉ mức trung bình,
lớn hơn 0,8 đến 1 chỉ mối quan hệ phụ thuộc mạnh.
Trƣớc hết cần lập bảng xác định thứ bậc, nhƣ sau:

Năm
Tỷ lệ tiêm
X (%)
Tỷ lệ
bệnh Y
(%)
Số thứ tự bậc
d (=X-Y)
d
2
X
Y
1990
55
1,8
10

2
+8
64
91
57
1,7
9
3
+6
36
92
63
2,1
7
1
+6
36
93
64
1,6
6
4
+2
4
94
62
1,2
8
6
+2

4

123


95
68
1,4
5
5
0
0
96
71
0,9
4
7
-3
9
97
75
0,8
2
8
-6
36
98
74
0,8
3

9
-6
36
99
77
0,6
1
10
-9
81






∑d
2
=306

Hệ số liên quan thứ bậc r
range
=1-{6×306/(10×9×11)}=1-1,85=-
0,85. Điều này nghĩa là tỷ lệ tiêm phòng bằng vacxin và tỷ lệ mắc bệnh có
mối tƣơng quan nghịch mạnh. Hay nói cách khác, tiêm vacxin giảm đáng
kể tỷ lệ mắc bệnh ở gia súc.
Đánh giá so sánh hiệu giá kháng thể các tập đoàn: Phƣơng pháp
phân tích này áp dụng khi thử nghiệm hai hay nhiều loại vacxin dự phòng
cùng một bệnh. Khi đó số mẫu thu thập đƣợc cần phải xét nghiệm bằng
cùng một phƣơng pháp thậm chí trong nhiều trƣờng hợp phải đƣợc xử lý

bằng một lô kháng nguyên đặc hiệu nhất định trong cùng một đợt xét
nghiệm để bảo đảm tính so sánh. Nguyên nhân của điều kiện này là do kết
quả xét nghiệm xác định hiệu giá kháng thể phụ thuộc vào nồng độ của
epitop kháng nguyên tham gia phản ứng. Nồng độ epitop kháng nguyên
chuẩn cao làm giảm kết quả hiệu giá vì phản ứng thể hiện rõ khi tỷ số giữa
"hóa trị" của kháng nguyên và của kháng thể xung quanh giá trị 1. Từ số
liệu hiệu giá kháng thể của hai tập đoàn thu thập đƣợc, chỉ số có thể dùng
để so sánh là giá trị trung bình nhân hiệu giá (GMT: geometric mean titre).
Giá trị trung bình cộng các hiệu giá không thể dùng để đánh giá hiệu quả
đáp ứng miễn dịch vì, chẳng hạn, nếu trong một nhóm 10 cá thể đƣợc
nghiên cứu chỉ có một cá thể có hiệu giá cao (10
3
) còn 9 cá thể khác không
có kháng thể, trong khi đó ở nhóm khác cả 10 cá thể đều có hiệu giá kháng
thể vừa đủ bảo vệ (10
2
) thì trung bình cộng hiệu giá của hai nhóm là bằng
nhau. Mặc dù vậy, nếu công cƣờng độc bằng mầm bệnh tƣơng ứng thì chỉ
một cá thể thuộc nhóm thứ nhất đƣợc bảo vệ trong khi ở nhóm thứ hai cả
10 cá thể đều miễn dịch.
Giá trị trung bình nhân hiệu giá kháng thể đƣợc tính theo công
thức: GMT= (T
1
×T
2
× ×T
n
)
1/n
. Trên thực tế để tiện phân tích và tránh cho

vế phải bằng không (0) ngƣời ta vận dụng lôgarit hóa cả hai vế. Khi đó,
logGMT=(logT
1
+logT
2
+ logT
n
)/n; trong đó T
1
, T
2
, và T
n

là các hiệu giá
riêng rẽ. Chú ý khi đọc kết quả phản ứng cần gán cho các mẫu âm tính
hoàn toàn (với huyết thanh nguyên, không pha) giá trị logT=-1, còn mẫu
huyết thanh cho kết quả dƣơng tính chỉ khi không pha loãng có giá trị
logT=0 (tức a
0
=1). Bằng phép đối lôgarit xác định đƣợc giá trị GMT. Chú

124


ý rằng trong các thí nghiệm dạng này cần phải thực hiện xét nghiệm với
mẫu huyết thanh không pha loãng để tránh sai số do bỏ mất các giá trị
logT=-1. Tuy nhiên, giá trị này có thể bỏ qua khi nghiên cứu tập đoàn lớn
vẫn bảo đảm ý nghĩa so sánh.

CÂU HỎI ÔN TẬP CHƢƠNG 3
1. Chẩn đoán là gì? đặc điểm chẩn đoán bệnh truyền nhiễm?
2. Các bƣớc trong hẩn đoán bệnh nguyên học?
3. Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên có khác phân lập và đồng định bệnh nguyên?
4. Phân lập và đồng định vi khuẩn mầm bệnh?
5. Phân lập và đồng định virut mầm bệnh?
6. Mục đích của phƣơng pháp huyết thanh học? Phƣơng pháp huyết thanh học
trong kiểm nghiệm thể bệnh nguyên và đồng định mầm bệnh có gì khác nhau?
7. Phản ứng kết tủa?
8. Phản ứng ngƣng kết?
9. Phản ứng cố định bổ thể?
10. Phản ứng HI (ngăn trở ngƣng kết hồng cầu)?
11. Các phƣơng pháp kháng thể đánh dấu?
12. Phản ứng quá mẫn muộn?
13. Các phƣơng pháp lai phân tử (hybridization)?
14. Nguyên lý và ứng dụng PCR?
15. Các chỉ tiêu của nghiên cứu dịch (tễ) học mô tả?
16. Các phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ học phân tích?


125


CHƢƠNG 4
PHÒNG CHỐNG BỆNH TRUYỀN NHIỄM
I. Các phương pháp phòng bệnh truyền nhiễm
1. Nguyên tắc chung của công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm
Nguyên lý công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm là vận
dụng những kiến thức về ba pha của chu trình truyền lây mầm bệnh và các
giai đoạn của quá trình sinh dịch vào công tác thực tiễn.

Bệnh truyền nhiễm xảy ra đƣợc là do ba khâu của quá trình sinh
dịch: nguồn bệnh, các nhân tố trung gian truyền bệnh và động vật cảm thụ,
và sự liên hệ giữa ba khâu đó. Thiếu một trong ba khâu hoặc thiếu sự liên
hệ giữa hai trong ba khâu đó thì dịch không xảy ra đƣợc.
Nguồn bệnh là khâu đầu tiên và chủ yếu, là xuất phát điểm của quá
trình sinh dịch. Nhân tố trung gian truyền bệnh nối liền nguồn bệnh với cơ
thể cảm thụ làm cho quá trình sinh dịch thực hiện thuận lợi. Động vật cảm
thụ là yếu tố làm cho dịch biểu hiện ra, đồng thời nó lại biến thành nguồn
bệnh làm cho quá trình sinh dịch đƣợc nhân lên, đƣợc thúc đẩy mạnh hơn.
Trên cơ sở phân tích vai trò và sự liên hệ giữa các khâu trên, công
tác phòng chống bệnh truyền nhiễm phải nhằm thực hiện cho đƣợc việc
xóa bỏ một hoặc nhiều khâu, hoặc cắt đứt sự liên hệ giữa các khâu với
nhau trong quá trình sinh dịch. Chỉ cần cắt đứt một khâu hoặc cắt đứt sự
liên hệ giữa những hai khâu, cũng đủ làm cho quá trình sinh dịch không
thực hiện được. Đó là nguyên lý cơ bản của mọi biện pháp phòng chống
bệnh. Đƣơng nhiên, chỉ giải quyết đƣợc một cách căn bản việc đó khi nhận
thức của con ngƣời đƣợc nâng cao.
Khi chƣa có dịch các biện pháp phòng bệnh truyền nhiễm đều
nhằm đề phòng dịch xuất hiện. Chủ chăn nuôi, chủ động vật chuyên chở
phải chấp hành các yêu cầu thực hiện các biện pháp phòng dịch đƣợc quy
định trong Pháp lệnh thú y, các Nghị định thi hành Pháp lệnh và Điều lệ
phòng chống dịch bệnh cho động vật, trong đó việc xây dựng vùng, cơ sở
an toàn dịch bệnh là trách nhiệm của mọi cá nhân, tổ chức và cơ quan quản
lý nhà nƣớc liên quan ngành chăn nuôi. Các cá nhân và tổ chức chăn nuôi
động vật phải đăng ký xây dựng vùng, cơ sở an toàn dịch bệnh động vật và
phải chấp hành các quy định của pháp luật về thú y đối với vùng, cơ sở an
toàn dịch bệnh động vật. Các tổ chức, cá nhân có hoạt động liên quan vùng
an toàn dịch bệnh động vật phải chấp hành các quy định của pháp luật về

126

thú y đối với vùng, cơ sở an toàn dịch bệnh động vật. Chính phủ có
chƣơng trình quốc gia về khống chế, thanh toán một số bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm của động vật, nhằm bảo đảm hiệu quả khống chế và thanh toán
các dịch bệnh nguy hiểm của động vật và những bệnh từ động vật lây sang
ngƣời, đáp ứng yêu cầu xuất khẩu động vật và sản phẩm động vật, bảo
đảm giảm dần số ổ dịch, số động vật mắc bệnh, tiến tới thanh toán dịch
bệnh. Trong việc xây dựng chƣơng trình này Chính phủ có chỉ đạo các các
bộ, ngành có liên quan phối hợp Bộ Nông nghiệp và PTNT và Bộ Thủy
sản trong việc xây dựng chƣơng trình quốc gia về khống chế, thanh toán
dịch bệnh động vật. Bộ Nông nghiệp và PTNT và Bộ Thủy sản xây dựng
chƣơng trình quốc gia về khống chế, thanh toán dịch bệnh động vật trình
Chính phủ phê duyệt và chỉ đạo thực hiện chƣơng trình. Các cơ quan quản
lý nhà nƣớc về thú y ở trung ƣơng (Cục Thú y đối với dịch bệnh động vật
trên cạn và Cục Quản lý chất lƣợng, an toàn vệ sinh và thú y thủy sản đối
với dịch bệnh động vật dƣới nƣớc và lƣỡng cƣ), UBND các cấp, Chi cục
Thú y và Chi cục Quản lý chất lƣợng, an toàn vệ sinh và thú y thủy sản,
các tổ chức và cá nhân chăn nuôi động vật tùy theo quyền hạn và trách
nhiệm của mình có trách nhiệm hƣớng dẫn thực hiện, thanh tra, kiểm tra và
đánh giá việc thực hiện, tổ chức thực hiện, tuyên truyền phổ biến hƣớng
dẫn và thực hiện các biện pháp khống chế, thanh toán dịch bệnh động vật.
Khi dịch đã xuất hiện, muốn phòng bệnh lây lan rộng thì cần thực
hiện các biện pháp chống dịch nhằm dập tắt dịch, bao gồm, một mặt, tiêu
diệt nguồn bệnh (điều trị bệnh cho các động vật bệnh hoặc giết hủy hay
giết mổ bắt buộc động vật bệnh) và, mặt khác, phòng bệnh cho các động
vật chƣa mắc bệnh. Các biện pháp phòng dịch và biện pháp chống dịch
liên quan mật thiết với nhau. Các biện pháp tiêu diệt nguồn bệnh một mặt
là để thanh toán dịch nhƣng đồng thời cũng bảo đảm cho động vật khỏe
không bị lây bệnh nên phòng ngừa dịch lan rộng. Các biện pháp phòng

bệnh truyền nhiễm ở nƣớc ta đã đƣợc quy định trong Điều lệ phòng chống
dịch bệnh cho gia súc và gia cầm trƣớc đây và Pháp lệnh thú y hiện nay,
cũng nhƣ các văn bản liên quan do Nhà nƣớc ban hành.
Để thực hiện các biện pháp phòng dịch cần thực hiện những biện
pháp tổng hợp tác động đến nhiều khâu của quá trình phát sinh dịch: đối
với nguồn bệnh (vật mang trùng khi chƣa có dịch, cũng nhƣ vật mang
trùng và vật bệnh khi có dịch), đối với đƣờng truyền lây và đối với động
vật mẫn cảm.

127


2. Đối sách đối với nguồn bệnh
2.1. Với vật mang trùng
Đối với nguồn bệnh phải tiêu diệt hoặc hạn chế nguồn bệnh gieo
rắc mầm bệnh ra ngoài. Khi chƣa có dịch phát ra, nguồn bệnh chỉ có thể là
những vật mang trùng. Khi đó, đối với vật mang trùng cần phải thực hiện
các biện pháp dƣới đây.
Phát hiện sớm, chủ động và tích cực. Phải có kế hoạch định kỳ phát
hiện vật mang trùng. Phát hiện động vật mang trùng rất khó. Có thể dùng
phƣơng pháp vi sinh vật học để xét nghiệm các chất bài tiết, bài xuất,
nhƣng kết quả thƣờng không chắc chắn vì con vật mang trùng chỉ bài xuất
mầm bệnh một cách định kỳ. Có thể dùng phƣơng pháp huyết thanh học
phát hiện kháng thể và kháng nguyên đặc hiệu trong một khoảng thời gian
nhất định. Tuy nhiên, cần chú ý rằng các phản ứng huyết thanh học phát
hiện kháng thể tuy dễ thực hiện nhƣng kết quả thƣờng khó giải thích. Phát
hiện kháng nguyên đặc hiệu thƣờng dễ giải thích hơn nhƣng việc thực hiện
thƣờng khó hơn do phản ứng thƣờng có độ nhạy thấp hơn và sự bài xuất
mầm bệnh (kháng nguyên) từ vật sống mang trùng không phải khi nào
cũng xảy ra. Mầm bệnh có thể phát hiện một cách tƣơng đối chắc chắn hơn

nhờ phƣơng pháp chẩn đoán dị ứng đối với những bệnh có phản ứng dị
ứng nhƣ lao, tỵ thƣ, sẩy thai truyền nhiễm, Phƣơng pháp cho kết quả
nhanh và nhạy hơn cả là các phƣơng pháp phân tích axit nucleic đặc hiệu
mầm bệnh (PCR, RT-PCR, PCR-RFLP, ) nhƣng cũng còn nhiều trở ngại
do sự bài xuất mầm bệnh từ vật mang trùng không ổn định, xét nghiệm lại
đòi hỏi tuyệt đối không đƣợc bị ô nhiễm từ những xét nghiệm cũ trƣớc đó
và, vì vậy, thƣờng đắt tiền. Vì vậy, phát hiện kháng nguyên bằng các phản
ứng huyết thanh học trực tiếp từ bệnh phẩm hoặc từ lứa cấy vi sinh vật
mầm bệnh đã đƣợc phân lập còn tiếp tục có thể là biện pháp đƣợc lựa chọn
trong điều kiện hiện nay.
Cách ly triệt để những con vật đã phát hiện có mang trùng. Ở
nhiều nƣớc, những con vật có phản ứng dƣơng với bệnh lao, sẩy thai
truyền nhiễm, tỵ thƣ đƣợc tập trung thành đàn và nuôi riêng trong những
trang trại cách ly. Nếu số lƣợng động vật mang trùng ít thì có thể giết thịt.
Việc cách ly con vật mang trùng với con khỏe ở nƣớc ta còn gặp nhiều khó
khăn. Tuy nhiên, các cơ sở chăn nuôi tập trung bắt buộc phải có khu
chuồng nuôi cách ly. Nông hộ có thể vận dụng biện pháp cách ly gián tiếp
nhƣ khi mua thịt chợ đƣa về nhà trong mọi trƣờng hợp loại bỏ một cách
triệt để lá hoặc giấy bao gói hoặc thực phẩm nguồn gốc động vật khác mua

128


từ chợ, khỏi sự tiếp xúc với gia súc, gia cầm của mình. Cần nghi ngờ
rằng thịt có thể đƣợc lấy từ động vật không sạch bệnh.
Điều trị dự phòng những con vật mang trùng, nhất là những động
vật quý đắt tiền. Một số con vật mang trùng có khi có thể tự nhiên lành
bệnh (bệnh sẩy thai truyền nhiễm), một số có thể phát hiện triệu chứng và
phải xử lý. Với những bệnh thƣờng có hiện tƣợng mang trùng, nếu không
có phƣơng pháp tốt để phát hiện mầm bệnh khi động vật còn sống thì cần

có biện pháp giải quyết ngay những con mắc bệnh khi xảy ra dịch (giết mổ
bắt buộc). Đối với những con mang trùng là dã thú hoặc côn trùng, ve
bét, thì phải dùng mọi biện pháp tiêu diệt và có biện pháp ngăn ngừa
chúng tiếp xúc với gia súc, gia cầm.
Với động vật mang trùng một số bệnh truyền nhiễm có tính lây
thấp, ẩn tính và có thể tái phát bất thƣờng do genom virut tái tổ hợp vào
nhiễm sắc thể ký chủ (nhƣ bệnh bạch huyết bò, ) và những biện pháp điều
trị không đƣa lại kết quả mà chỉ làm duy trì mầm bệnh (hay nguồn bệnh)
trong tập đoàn thì cần thực hiện biện pháp giết mổ dần (giết hủy chậm) và
không sử dụng động vật vào mục đích lấy giống.
2.2. Các biện pháp đối với ổ dịch
Các biện pháp chống dịch truyền nhiễm đƣợc thực hiện ở ổ dịch
thƣờng nhằm mục đích tiêu diệt nguồn bệnh, đồng thời phòng ngừa mầm
bệnh lây lan sang những động vật khỏe, không cho ổ dịch lan rộng hoặc
khởi nguồn ổ dịch khác.
Các biện pháp chống dịch bao gồm phát hiện bệnh, tiêu diệt nguồn
bệnh (điều trị hoặc giết hủy động vật bệnh, hoặc áp dụng song song cả hai
biện pháp), làm suy yếu hoặc tiêu diệt các nhân tố trung gian truyền bệnh
và làm tăng sức đề kháng của cơ thể động vật. Các biện pháp đó cần đƣợc
thực hiện khẩn trƣơng, cùng một lúc thì mới đạt mục đích dập tắt dịch.
a. Đối với động vật bệnh
Phải phát hiện sớm, khai báo nhanh, cách ly kịp thời và điều trị triệt
để hoặc giết hủy hay giết mổ bắt buộc theo hƣớng dẫn của chuyên môn thú
y.
Phát hiện bệnh sớm: Phải dùng mọi biện pháp chẩn đoán để phát
hiện bệnh đúng và sớm. Nếu chẩn đoán còn nghi ngờ, chƣa có điều kiện
xác định bệnh chắc chắn thì cũng phải có kết luận sơ bộ chẩn đoán và có
biện pháp đề phòng bệnh lây lan. Nguyên tắc cần tuân thủ đối với dịch

129

bệnh truyền nhiễm là một khi có con vật sốt chƣa rõ nguyên nhân phải
nghi là nguồn bệnh truyền nhiễm và phải cách ly. Thà chẩn đoán nhầm
một bệnh không truyền nhiễm là bệnh truyền nhiễm còn hơn là nhầm một
bệnh truyền nhiễm là bệnh không truyền nhiễm. Tuy nhiên, phải dùng mọi
biện pháp chẩn đoán đúng bệnh thì mới đề ra biện pháp chống dịch có hiệu
quả, đặc biệt là tránh gây hoang mang không đáng có và trở ngại sinh hoạt
bình thƣờng đối với xã hội liên quan vấn đề xử lý dịch bệnh truyền nhiễm
nguy hiểm. Phải sử dụng nhiều phƣơng pháp chẩn đoán: lâm sàng, dịch tễ
học và chẩn đoán xét nghiệm.
- Chẩn đoán lâm sàng: Dựa vào triệu chứng lâm sàng điển hình của
các bệnh động vật đã đƣợc mô tả trƣớc đây để đối chiếu và quy thuộc mà
xác định nguyên nhân của trƣờng hợp bệnh lý đang tiếp cận. Phƣơng pháp
chẩn đoán này dễ nhầm lẫn vì nhiều bệnh khác nhau có thể có triệu chứng
lâm sàng giống nhau hoặc khi ở đầu vụ dịch triệu chứng bệnh thƣờng
không điển hình.
- Chẩn đoán dịch tễ học: Tìm hiểu nguyên nhân và điều kiện xuất
hiện dịch. Cần phải điều tra kỹ để tìm nguồn bệnh, nguồn lây lan, hoàn
cảnh động vật mắc bệnh, lịch sử cảm nhiễm (trƣớc đó con bệnh đã tiếp xúc
với những loại súc vật nào, chăn dắt ở đâu, đã đi qua những địa phƣơng
nào có dịch), điều kiện vệ sinh động vật ra sao, đã tiêm phòng chƣa, tiêm
vacxin gì. Ngoài ra, phải tìm hiểu những con vật có tiếp xúc với con bệnh.
Điều tra dịch tễ học kết hợp với những triệu chứng lâm sàng có thể
giúp chẩn đoán bệnh nhƣng có khi chƣa chắc chắn nên còn phải dùng
phƣơng pháp chẩn đoán xét nghiệm.
- Chẩn đoán xét nghiệm: Nên tiến hành bằng việc phối hợp nhiều
phƣơng pháp khác nhau (vi sinh vật học, huyết thanh học, di truyền học
phân tử, sinh vật học, ).
Bệnh phẩm lấy từ động vật bệnh, nghi bệnh hoặc động vật chết

phải phù hợp với yêu cầu xác định bệnh. Cách lấy bệnh phẩm, cách bao
gói và gửi bệnh phẩm phải theo đúng yêu cầu kỹ thuật để bảo đảm không
gieo rắc mầm bệnh ra ngoài, bảo đảm an toàn cho ngƣời lấy và bảo đảm
chẩn đoán chính xác. Bệnh phẩm phải đƣợc gửi đến cơ quan xét nghiệm
càng nhanh càng tốt.
Để xác định một số bệnh truyền nhiễm, cần tiến hành kết hợp các
phƣơng pháp chẩn đoán nói trên.