Thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá thể nuôi cấy tế bào gốc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


NGUYỄN THỊ NHẬT UYÊN


THU NHẬN VÀ XỬ LÝ NGÀ RĂNG NGƯỜI
LÀM GIÁ THỂ NUÔI CẤY
TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI




Chuyên ngành: Sinh lý động vật
Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC




HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN LÊ BẢO HÀ





THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012

LỜI CẢM ƠN

Luận văn tốt nghiệp này là thành quả của những năm học tập, nghiên cứu cùng
với sự quan tâm, chia sẻ nhiệt tình của gia đình, thầy cô và bạn bè. Nếu không có sự
giúp đỡ và động viên của nhiều người có lẽ tôi khó hoàn thành tốt luận văn này.
Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Lê Bảo Hà, đã tận tình hướng
dẫn, góp ý và động viên tôi trong quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ths. Phan Kim Ngọc, người đã tạo mọi điều kiện tốt
nhất về vật chất lẫn tinh thần để tôi học tập và nghiên cứu tại PTN Nghiên cứu và
Ứng dụng Tế bào gốc, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM.
Tôi xin cảm ơn chị Tuyền, các bạn Giang, Xuân và các em Vũ, Quân, Hương,
Hằng đã luôn sát cánh cùng tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
Lời cảm ơn cuối cùng, tôi xin gởi đến ngoại, cha mẹ và em gái đã hết lòng quan
tâm và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.


Tp Hồ Chí Minh, 02/2012
Nguyễn Thị Nhật Uyên



i

MỤC LỤC
Trang
Bìa chính
Bìa phụ
Lời cảm ơn
Mục lục i
Danh mục từ viết tắt iv
Danh mục bảng và đồ thị vi

Danh mục hình vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Kỹ nghệ mô 3
1.1.1. Giá thể ba chiều 3
1.1.1.1. Các đặc tính của giá thể ba chiều 4
1.1.1.2. Nguyên liệu thiết kế giá thể 4
1.1.2. Tế bào trong kỹ nghệ mô 4
1.1.3. Khả năng tương tác của tế bào với giá thể 5
1.1.3.1. Sự bám dính 5
1.1.3.2. Sự di chuyển 5
1.1.3.3. Sự tăng trưởng và biệt hóa 6
1.1.4. Giá thể dùng trong nha khoa . 8
1.2. Ngà răng 11
1.2.1. Cấu trúc ngà răng 12
1.2.2. Thành phần cấu tạo và các đặc tính của ngà răng 13
1.2.2.1. Thành phần hữu cơ 13
1.2.2.2. Thành phần vô cơ 14
1.2.2.3. Đặc tính của ngà răng 14
1.2.3. Giá thể ngà răng 15
1.3. Tế bào gốc trong mô tủy răng 15

ii

1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18
Chương 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 19
2.1.1. Mẫu vật 19

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị 20
2.1.3. Hóa chất 21
2.2. Phương pháp 24
2.2.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm tổng quát 24
2.2.2. Tạo giá thể từ ngà răng người 25
2.2.3. Qui trình nuôi cấy tế bào tủy răng người 26
2.2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp 26
2.2.3.2. Phương pháp cấy chuyền tế bào tủy răng 27
2.2.4. Đánh giá tế bào tủy răng thu được
28
2.2.4.1. Phương pháp xác định kiểu hình miễn dịch 28
2.2.4.2. Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào thu được từ mảnh mô
28

2.2.5. Khảo sát sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng trên giá thể
ngà đã xử lý 29
2.2.5.1. Phương pháp đưa tế bào lên giá thể 29
2.2.5.2. Phương pháp MTT 30
2.2.5.3. Phương pháp SEM 31
Chương 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1. Thu nhận và xử lý giá thể từ mô ngà răng người 32
3.1.1. Thu nhận các mẫu ngà từ thân răng người 32
3.1.2. Đánh giá kết quả xử lí bề mặt của giá thể ngà răng 32
3.2. Kết quả nuôi cấy tế bào gốc từ tủy răng người 36
3.2.1. Kết quả nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E) mô tủy răng. 36
3.2.2. Kết quả nuôi cấy sơ cấp 37

iii

3.2.3. Kết quả cấy chuyền tế bào 40

3.3. Kết quả đánh giá tế bào thu được từ tủy răng. 41
3.3.1. Sự biểu hiện một số marker của tế bào gốc trung mô. 41
3.3.2. Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt nuôi cấy 42
3.4. Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào tủy răng trên bề mặt giá thể 44
3.5. Khả năng bám của tế bào gốc tuỷ răng trên giá thể 46
Chương 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
Kết luận 48
Kiến nghị 48
Danh mục công trình của tác giả viii
Tài liệu tham khảo ix
Phụ lục





iv

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BMPs Bone morphogenetic proteins
DFCs Dental follicle cells
DMEM Dullbecco Modification of Eagle’s Medium
DMSO Dimethyl sulfoxide
DPCs Dental Pulp Cells
DPSCs Dental Pulp Stem Cells
ECM Extra Cellular Matrix
EDTA Ethylene Diaminetertraacetid Acid
EGF Epithelial Growth Factor
FBS Fetal Bovine Serum

FGF Fibroblast Growth Factor
g Gram
HE Haematoxylin Eosin
l Litre
mg Miligram
ml Mililitre
mm Milimetre
NaCl Sodium Chlorite
NaOCl Sodium Hypochlorite
NCPs Non – collagenous proteins
hTDM Hunan treated dentin matrix
PBS Phosphatev - Buffered Saline
PDL Periodontal ligament
SEM Scanning Electron Microscope
HA Hydroxyapatite
TCP Tricalcium phosphate
TGF-β Transforming Growth Factor-β

v

WNTs Wingless- and int-related proteins
μl Microlitre
μm Micrometre

vi

DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ
Trang

Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ sử dụng 20
Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị sử dụng 21
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy ở lần
cấy chuyền thứ 3 42
Đồ thị 3.2. Biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang (OD) với các mốc thời
gian nuôi cấy 45





vii

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Các nhân tố trong kĩ nghệ mô 3
Hình 1.2. Ba yếu tố quan trọng cho kỹ nghệ mô trong nha khoa: tín hiệu cho
sự phát triển, tế bào gốc và khung nâng đỡ của chất nền ngoại bào 8
Hình 1.3. Ngà răng – tủy hình thành phức hợp với định hướng tối ưu cho các
ứng dụng lâm sang của liệu pháp tái sinh 9
Hình 1.4. Nguyên bào ngà và ống ngà 13
Hình 1.5. Hình dạng ống ngà 13
Hình 1.6. Bề mặt ngà chưa xử lý dưới SEM 15
Hình 2.1. Mẫu răng người sau khi thu nhận 19
Hình 2.2. Cách cắt răng tạo hình mẫu ngà 25
Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT 30
Hình 3.1. Mẫu ngà thu nhận để làm thí nghiệm sau khi xử lý 32
Hình 3.2. Mẫu chứng bề mặt ngà chưa xử lý 33
Hình 3.3. Bề mặt ngà xử lý bằng EDTA / Axit Citric 33
Hình 3.4. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (100X) 36

Hình 3.5. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (200X) 36
Hình 3.6. Quần thể tế bào sau khi thu nhận 37
Hình 3.7. Quần thể tế bào sau 5ngày nuôi cấy.

38
Hình 3.8. Quần thể tế bào sau 14 ngày nuôi cấy 39
Hình 3.9. Quần thể tế bào sau 21 ngày nuôi cấy 39
Hình 3.10. Quần thể tế bào sau 4 ngày (a) và sau 15 ngày (b) cấy chuyền 40
Hình 3.11. Kết quả phân tích sự biểu hiện một số marker của tế bào tủy răng
sau 3 lần cấy chuyền 41
Hình 3.12. Giá thể ngà sau khi ủ hóa chất MTT: a) Giá thể không có tế bào,
(b) Giá thể có tế bào 44
Hình 3.13. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x600) 47
Hình 3.14. Tế bào bám trên giá thể xử lý bằng EDTA / Axit citric (x7.000) 47

viii

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
I. BÀI BÁO KHOA HỌC
1. Đoàn Nguyên Vũ, Phạm Trần Hương Trinh, Nguyễn Thị Nhật Uyên, Tô
Minh Quân, Phan Kim Ngọc, Trần Lê Bảo Hà, Nguyễn Thị Thư, Đặng Vũ Ngọc
Mai, Hoàng Đào Bảo Trâm, Hoàng Tử Hùng, Trịnh Thị Trúc Ly (2011). Nuôi
cấy tế bào gốc từ tủy răng người. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9(3), 297-301.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh về răng miệng như sâu răng, bệnh lý tủy răng và nha chu là các loại
bệnh phổ biến nhất nhưng cũng ít được chú ý, đề phòng nhất ở Việt Nam hiện nay.
Trong khi Việt Nam có tới 90% dân số mắc các bệnh về răng miệng.

Khác với các bệnh khác, người ta có thể mắc bệnh răng miệng ngay từ lúc mới
sinh cho đến khi sắp từ giã cõi đời, bệnh ảnh hưởng lớn đến sức khỏe do không
được chăm sóc và điều trị đúng cách, dẫn đến rụng răng, hạn chế khả năng nói và
nhai của con người và mất răng sớm, từ đó làm giảm chất lượng cuộc sống. Do tính
chất phổ biến với mọi lứa tuổi như vậy mà việc phòng chống và chữa trị các bệnh
về răng miệng là một nhiệm vụ có tính xã hội hoá cao.
Ngày nay, với sự tiến bộ của công nghệ trong thế kỷ 21, người ta mong đợi sẽ
giữ được răng tự nhiên hoặc thay thế răng chức năng trong suốt cuộc đời họ. Các kỹ
thuật nha khoa hiện nay như phương pháp trám ống tủy (loại bỏ tủy hư) và cấy ghép
răng (implant) giúp tăng tỷ lệ thành công trong việc giữ răng, nhưng răng của nhiều
người không phục hồi chức năng hoàn toàn; đồng thời, các phương pháp điều trị
này đòi hỏi phải tuân theo những nguyên tắc nghiêm ngặt, kỹ thuật phức tạp, theo
dõi và chăm sóc răng định kỳ nên các nhà khoa học trên thế giới đã và đang hướng
đến nghiên cứu những phương pháp nhằm tái tạo răng.
Đã có nhiều công trình trên thế giới tiến hành nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế
bào gốc tủy răng cũng như tạo khung nâng đỡ, dùng để phục hồi tủy răng trong
chữa trị mà không cần loại bỏ hoàn toàn tủy răng. Khi đó, tế bào tủy răng đã được
nuôi trên giá thể polymer tổng hợp như giá thể alginate, giá thể polymer poly
(lactic-co-glycolic) acid, giá thể composite và giá thể polymer tự nhiên dùng trong
công nghệ nội nha như collagen. Tuy nhiên, sự phân hủy các polymer tổng hợp, cả
trong điều kiện in vitro và in vivo, giải phóng các sản phẩm phụ khiến cho vi môi
trường giá thể không lý tưởng cho sự tăng trưởng mô, có hại đến chức năng của tế
bào và các polymer tự nhiên có thể gây ra các đáp ứng miễn dịch.
Để khắc phục nhược điểm của các giá thể polymer tự nhiên và polymer tổng
hợp, hiện nay, các nhà khoa học hướng tới việc sử dụng ngà răng. Ưu điểm của giá

2

thể ngà là giá thể tự nhiên, chi phí thấp, nguồn mẫu thu dồi dào và hỗ trợ sự bám
dính, tăng sinh của tế bào gốc tủy răng người. Ngoài ra, giá thể ngà đã được chứng

minh có khả năng kích thích tế bào tủy răng người biệt hóa thành nguyên bào ngà in
vitro và hình thành nên ngà mới in vivo.
Những thành tựu gần đây đã mở ra một triển vọng về xây dựng một quy trình tái
tạo mô tủy và hình thành lớp ngà mới, nhằm để tái tạo phức hợp ngà - tủy ứng dụng
trong chữa trị nội nha lâm sàng. Với sự phát triển không ngừng và kết hợp của
nhiều ngành khoa học, các ứng dụng của kỹ nghệ mô ngày càng phong phú như da,
xương, mạch máu, thần kinh và răng. Trong đó, việc lựa chọn giá thể thích hợp là
mục tiêu cần thiết để thành công trong việc tạo mô và cơ quan thay thế.
Với những tiềm năng ứng dụng to lớn như trên, đề tài luận văn này được tiến
hành nhằm mục tiêu “Thu nhận và xử lý ngà răng người làm giá thể nuôi cấy tế
bào gốc”. Các kết quả thu được như một bước khởi đầu cho những nghiên cứu sau
này trong lĩnh vực chữa trị và phục hồi nha khoa lâm sàng.
Mục tiêu chuyên biệt
- Thu nhận và xử lý được giá thể từ ngà răng người
- Nuôi cấy và nhận diện được tế bào gốc tủy răng người
- Đánh giá được sự bám dính và tăng sinh của tế bào tủy răng người trên giá
thể ngà đã xử lý.

3


1.1. Kỹ nghệ mô [4], [46]
Kỹ nghệ mô là ngành khoa học mới kết hợp nhiều lĩnh vực như sinh học tế bào,
khoa học vật liệu, giải phẫu, … để tạo ra các mô, cơ quan có chức năng, sử dụng tế
bào sống và một chất nền hay còn gọi là giá thể.
Kỹ nghệ mô đã khắc phục những hạn chế của phương pháp điều trị truyền thống
bằng cách tạo ra các mô, cơ quan nhân tạo có tính tương hợp sinh học và không gây
ra các phản ứng thải loại.
Các tế bào được nuôi cấy theo phương pháp truyền thống có thể tăng trưởng tạo
lớp đơn nhưng không thể tổ chức thành mô hay cơ quan được. Bởi vì, chúng thiếu

các tín hiệu cơ học, tín hiệu điện và các thành phần cấu trúc, hóa học từ thành phần
ngoại bào giống như môi trường in vivo (thành phần cấu trúc giống chất nền ngoại
bào của mô hay cơ quan). Do đó, để tạo ra mô hay cơ quan nhân tạo phải thỏa mãn
những yêu cầu sau: giá thể, tế bào, nhân tố tăng trưởng thích hợp và điều kiện nuôi
cấy tối ưu. Trong đó, giá thể là một thành phần rất quan trọng trong kỹ nghệ mô.









Hình 1.1. Các nhân tố trong kĩ nghệ mô
1.1.1. Giá thể ba chiều [4]
Giá thể là khuôn ngoại bào nhân tạo có cấu trúc lỗ xốp, giúp điều tiết tế bào,
hướng dẫn tế bào tăng trưởng và tái tạo mô ba chiều. Sau khi được cấy vào giá thể,
các tế bào sẽ bám dính, tăng sinh, biệt hóa và tổ chức tạo mô song song với quá
trình tiết ra các chất nền ngoại bào (ECM). Vì thế để tạo ra các mô và cơ quan có

4


hình dạng và kích thước mong muốn, cần chọn lựa giá thể có hình dạng và cấu tạo
phù hợp.
1.1.1.1. Các đặc tính của giá thể ba chiều [4]
Có cấu trúc lỗ xốp bên trong (đường kính lỗ ít nhất 60-100 m) để cung cấp
dưỡng chất, giúp tăng trưởng mô, phân bố các mạch máu….
Có khả năng tự phân hủy sinh học để khi các tế bào tiết các thành phần ngoại bào

sẽ thay thế giá thể.
Có bề mặt hỗ trợ cho quá trình bám dính, tăng sinh và biệt hóa của tế bào.
Có các đặc tính cơ học thích hợp để tương xứng với vùng ghép.
Không kích thích bất kỳ phản ứng có hại cho tế bào.
Dễ tạo hình dáng và kích thước mong muốn.
1.1.1.2. Nguyên liệu thiết kế giá thể
- Các giá thể sinh học: các mô, cơ quan đồng loại, dị loại được sử dụng để tạo
giá thể. Các mô, cơ quan được hủy tất cả tế bào và thành phần tế bào, thu bộ khung
ECM.
- Polymer tổng hợp: các polyester như polyglicolic acid (PGA), polylactic
acid (PLA) và các chất đồng trùng hợp (copolymer) của chúng thường được sử
dụng để thiết kế các giá thể.
- Polymer tự nhiên: các polymer là protein hoặc carbohydrate có nguồn gốc
tự nhiên được sử dụng làm giá thể để kích thích sự tăng trưởng của một số dòng tế
bào. Collagen là dạng polymer tự nhiên phổ biến nhất thường được sử dụng tạo giá
thể ba chiều.
1.1.2. Tế bào trong kỹ nghệ mô
Các loại tế bào có thể được sử dụng cho sửa chữa và tái tạo mô bao gồm các tế
bào trưởng thành được lấy từ bệnh nhân hoặc các tế bào gốc (trưởng thành hoặc
phôi thai) [13]. Trong đó, tế bào gốc là loại tế bào có khả năng tự làm mới và khả
năng biệt hóa thành những dạng tế bào chuyên hóa của cơ thể trưởng thành. Thêm
nữa, việc sử dụng tế bào gốc có nguồn gốc từ mô trưởng thành tránh được những
vấn đề về đạo đức và xã hội trong các ứng dụng nghiên cứu [13].

5


Tế bào gốc hiện diện trong các mô chuyên biệt như mô xương, mỡ, tụy, gan,
máu, tủy răng. Chúng có thể duy trì tính gốc và tiềm năng biệt hóa trong suốt quá
trình nuôi cấy tăng sinh. Vì vậy, tế bào gốc trưởng thành được xem là một nguồn tế

bào hữu ích cho việc phát triển liệu pháp tế bào.
1.1.3. Khả năng tương tác của tế bào với giá thể
1.1.3.1. Sự bám dính [9]
Sự bám dính của tế bào thông qua các thành phần của ECM như fibronectin,
vitronectin, collagen hay laminin gắn lên các thụ thể integrin của tế bào. Ở vật liệu
thế hệ mới, các thụ thể và trình tự phụ trợ đều được gắn trực tiếp trên vật liệu.
Các phân tử ECM này có thể được hấp thu trên bề mặt vật liệu từ môi trường
xung quanh. Bề mặt mềm và thấm nước có khả năng hấp thu các protein ngoại bào
tốt. Tuy nhiên, vật liệu sử dụng trong kĩ nghệ mô đa số là polymer tổng hợp như
polyethylene, polyurethane, polypropylene hoặc polystyrene rất kị nước ở trạng thái
chưa biến đổi. Do đó các giá thể ba chiều thường được phủ một lớp dung dịch ECM
tự nhiên như matrigel, gelatin, collagen
1.1.3.2. Sự di chuyển [9]
Sự di chuyển của tế bào trên giá thể rất được quan tâm vì chúng đóng vai trò
quyết định tính đa dạng của các hiện tượng sinh lý và bệnh lý học, cũng như thành
phần giá thể trong kỹ nghệ mô. Hoạt động đó bị chi phối bởi các tác nhân sinh hóa
và tương tác tế bào.
Sự di chuyển của tế bào được chia thành hai giai đoạn là quá trình dàn trải (bám
dính) và chuyển động của tế bào. Dàn trải là một quá trình kết hợp sự bám dính liên
tục và sự co thắt có chọn lọc của tế bào. Đầu tiên, tế bào nhô ra các phiến mỏng
chứa nhiều vi sợi và bám dính chủ yếu ở phiến nhô ra này. Ở giai đoạn sau, tế bào
chất ở chỗ nhô ra cũng được mở rộng, hoàn thiện sự dàn trải tế bào. Nếu tế bào gặp
tế bào khác, quá trình ức chế sẽ xảy ra và ngăn chặn sự di chuyển xa hơn của tế bào
trong giá thể
Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự di chuyển tế bào: bề mặt giá thể, độ gồ ghề,
trạng thái lỗ của giá thề và gradient trong môi trường nuôi cấy…

6

- Bề mặt giá thể: sự bám dính của tế bào bị tác động bởi các đặc trưng hóa lý
của bề mặt rắn nằm bên dưới. Sự dàn trải diễn ra tốt hơn trên bề mặt ưa nước ở cả
trường hợp môi trường có hoặc không có huyết thanh. Điều đó cho thấy tính chất
thể nền có vai trò quan trọng đối với sự bám dính và dàn trải tế bào thông qua các
protein được hấp thu trước.
- Trạng thái lỗ: bao gồm kích thước và sự phân bố, chúng có ảnh hưởng trực
tiếp lên sự di chuyển của tế bào. Khi kích thước lỗ quá lớn sẽ làm giảm khả năng di
chuyển của tế bào, do tế bào không thể dàn trải được và tốn nhiều thời gian hơn cho
việc định hướng di chuyển.
Ngoài ra, sự phân bố các rãnh giữa các vi lỗ giá thể có tác động mạnh đến sự
di động và tính định hướng tế bào. Các rãnh nhỏ, ngay cả các rãnh hẹp 3µm cũng
dẫn đến định hướng tế bào. Trong khi đó, các rãnh lớn 120 µm sẽ không còn thấy
sự liên kết tế bào. Do đó, điều này đã đưa ra một cơ chế lý sinh mới trong quá trình
kiểm soát sự vận động của tế bào bằng những cấu trúc vi ngoại bào.
- Nồng độ phân tử trong môi trường: sự di động của tế bào còn được định
hướng bằng các nồng độ khác nhau trong môi trường (hóa học, điện, haptotaxis…).
Sự cảm ứng đó được gọi là tính hóa hướng động “chemotaxis”. Mặc dù có nhiều
loại phân tử hóa học khác nhau như đường, peptide, chất chuyển hóa tế bào, vách tế
bào hay màng lipid, nhưng tất cả đều thực hiện một cơ chế chung. Chúng gắn lên
các thụ thể bề mặt tế bào, hoạt hóa các con đường truyền tín hiệu nội bào và tổ chức
lại bộ xương tế bào.
Hiện nay, các nhà khoa học vẫn đang nghiên cứu sâu hơn tính hóa hướng động
của tế bào khi tế bào di chuyển trong giá thể, giúp tế bào di chuyển sâu hơn bên
trong giá thể nhằm sử dụng hoàn toàn nguồn dinh dưỡng, tăng sinh và biệt hóa tốt
hơn.
1.1.3.3. Sự tăng trưởng và biệt hóa
Sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào trên giá thể phụ thuộc rất nhiều yếu tố như
chất liệu, cấu trúc giá thể trong đó quan trọng nhất là các nhân tố biệt hóa.

7

- Chất liệu tạo giá thể: đóng vai trò quyết định khi thiết kế giá thể. Tuy nhiên,
người ta nhận thấy nếu có sự kết hợp nhiều loại chất liệu với nhau khi thiết kế giá
thể ba chiều dùng để nuôi cấy tế bào hoặc đưa vào cơ thể làm vật ghép thì hoạt tính
sinh học sẽ tăng lên và giúp tế bào tăng sinh tốt hơn cũng như vật liệu ghép tốt hơn.
Điều này có thể giải thích do thành phần cấu trúc trong các mô là hỗn hợp
của rất nhiều loại chất liệu. Sự kết hợp nhiều loại vật liệu tạo ra một khung sườn
giống môi trường của tế bào sinh sống, do đó làm tăng quá trình tăng sinh và biệt
hóa của tế bào cũng như tạo ra một cấu trúc phù hợp với chức năng mô thay thế
[16].
- Cấu trúc giá thể
 Kích thước các lỗ trên giá thể không chỉ ảnh hưởng đến sự di chuyển của
các tế bào trong giá thể mà cũng ảnh hưởng đến sự biệt hóa và tăng sinh của tế bào.
Đặc biệt kích thước lỗ ảnh hưởng trực tiếp đến việc phân phối chất dinh dưỡng và
các nhân tố biệt hóa đều khắp giá thể.
 Tế bào sẽ biệt hóa nhanh hơn trên giá thể có kích thước lỗ tương đối so
với giá thể có kích thước lỗ lớn. Giá thể có kích thước lỗ lớn làm gia tăng tỉ lệ tăng
sinh tế bào do đó tế bào không chuyển sang giai đoạn biệt hóa.
Như vậy, có thể kết luận độ thông thoáng của vật liệu xốp giúp tế bào tăng
sinh mạnh. Tuy vậy, sự thông thoáng quá mức có thể giảm hiệu quả của quá trình
biệt hóa do cung cấp nhiều không gian cho tế bào tăng sinh [53].
- Các nhân tố biệt hóa [48]
 Giá thể cần được bổ sung các nhân tố tăng trưởng để có được các tính
chất sinh học chuyên biệt cho từng loại tế bào. Chất tăng trưởng có thể tồn tại tự do
trong dung dịch hoặc cố định lên bề mặt giá thể.
 Sự hỗ trợ bề mặt vật liệu sinh học với những phân tử có hoạt tính sinh
học là con đường đơn giản để tạo ra vật liệu có tính sinh học cao hay còn gọi là vật
liệu có khả năng phỏng sinh học. Giá thể có thể được gắn trình tự peptide đơn giản
của protein ngoại bào hoặc các nhân tố tăng trưởng. Khi đó, các tế bào bám dính tốt

hơn, tăng trưởng mạnh và nhanh chóng đi vào con đường biệt hóa [36].

8



1.1.4. Giá thể dùng trong nha khoa
Điều trị tái tạo mô của phức hợp ngà – tủy răng đòi hỏi yếu tố quan trọng thứ hai
bên cạnh tế bào gốc tủy răng (DPSCs) đáp ứng là một giá đỡ phù hợp. Việc lựa
chọn một vật liệu khung nâng đỡ thích hợp có tầm quan trọng quyết định để tạo ra
và hình thành giá thể ngà răng tối ưu. Qua đó, sự phù hợp của các khung nâng đỡ
phụ thuộc vào cả hai đặc tính vật liệu sinh hóa cũng như cấu trúc hình học.













Hình 1.2. Ba yếu tố quan trọng cho kỹ nghệ mô trong nha khoa: tín hiệu cho sự
phát triển, tế bào gốc và khung nâng đỡ của chất nền ngoại bào [36]
Việc xác định và phát triển của khung nâng đỡ phù hợp có khả năng tái sinh các
cấu trúc răng, chẳng hạn như ngà răng, là những khía cạnh thiết yếu của kỹ nghệ mô
trong điều trị nha khoa. Ngoài ra, vật liệu của khung nâng đỡ phải có tính chất cơ

học và sinh lý tương thích khi đưa trở lại cho bệnh nhân. Một số polymer tổng
hợp và tự nhiên, như calcium/phosphate, đã được thử nghiệm trong kỹ nghệ mô tái
tạo ngà răng. Tuy nhiên, rất ít vật liệu có thể tái tạo hoàn chỉnh mô ngà răng, chúng
có thể hỗ trợ tế bào tăng trưởng nhưng không có khả năng gây ra sự khác
biệt hướng tới chuyên hóa tạo răng [17] [29].

9












Hình 1.3. Ngà răng – tủy hình thành phức hợp với định hướng tối ưu cho các ứng
dụng lâm sàng của liệu pháp tái sinh [35]
Một tập hợp các vật liệu sinh học đã được sử dụng trong các nghiên cứu gần đây
cho quy trình tái tạo mô răng. Ứng dụng vật liệu hoạt tính sinh học có sẵn như
khung nâng đỡ tiềm năng bao gồm vật liệu hữu cơ tự nhiên như collagen,
fibronectin, polymer hữu cơ như alginate (PLA), polyglycolic acid (PGA) và chất
đồng trùng hợp (copolymer) của chúng.
Các vật liệu hứa hẹn nhất trong việc tái tạo mô răng sẽ được mô tả tóm tắt sau
đây:
- Collagen [1], [25], [57]
Collagen thuộc về các polymer tự nhiên, là một protein quan trọng trong cơ

thể con người bao gồm các sợi không hòa tan. Nó là một thành phần chủ yếu của
giá thể ngà răng và hỗ trợ sự khởi đầu vôi hóa, nhưng không tự gây ra sự khoáng
hóa. Collagen có lợi thế về tương hợp tế bào và hoạt tính sinh học. Tuy nhiên,
collagen cấy ghép có thể phân hủy trong cơ thể và đôi khi có thể gây ra phản ứng
viêm nhẹ [56].
Trong quá trình thiết kế giá thể collagen ba chiều, có bốn đặc tính cần phải
được kiểm soát: một số nhóm chức trong sợi collagen phải được loại bỏ để tránh
ngưng tụ tiểu cầu, thành phần hóa học phải phù hợp với sự bám dính của tế bào

10


chuyên biệt, kích thước lỗ phải nằm trong khoảng giới hạn và tốc độ phân hủy sinh
học của giá thể.
Zhang và cộng sự (2006) thực hiện thí nghiệm đưa DPSCs vào một khung
nâng đỡ collagen, kết quả DPSCs bám dính, tăng sinh trên bề mặt, tế bào tăng sinh
rõ rệt bởi collagen trong cơ thể sống. Tuy nhiên nó không thể chứng minh rằng vật
liệu sinh học collagen dựa trên kích thích DPSCs để tổng hợp khoáng mô cứng [59]
Vì vậy, collagen đã được sử dụng như một loại vật liệu tiên phong cho sự tái
tạo phức hợp ngà-tủy răng, nhiều nhà nghiên cứu đã tập trung vào loại vật liệu
khung nâng đỡ này.
- Gelatin [1], [44]
Gelatin là sản phẩm từ thủy phân giới hạn sợi collagen không hòa tan. Thành
phần và trình tự axit amin của gelatin tương tự collagen. Gelatin có hàm lượng
glycin, prolin và hydroxyprolin cao. Cấu trúc xoắn ba của tropocollagen được bảo
tồn trong gelatin, vì vậy gelatin có thể giữ nước để tạo thành gel.
- Alginate [23], [1]
Giá thể ngoại bào tổng hợp cũng đã được phát triển như là khung nâng đỡ
tiềm năng cho chữa trị nha khoa, alginate hydrogel tạo điều kiện chữa lành tổn
thương tủy và có thể cung cấp các yếu tố tăng trưởng như TGF-1 để tăng cường

khả năng tái sinh tự nhiên tủy răng nha khoa.
- Gốm (ceramic)
Ceramic phosphate calcium cũng là một loại vật liệu thường được sử dụng để
tái tạo mô cứng bởi vì có tính chất tương hợp sinh học cao và khả năng hỗ trợ sự
khác biệt của các tế bào.
Vật liệu này là một ứng dụng khá thích hợp cho răng nhân tạo và tái sinh
răng. Mặc dù vậy, nó được giới hạn để cấy ghép hoặc vật liệu phủ hay dạng bột vì
độ dai chỗ xương gãy kém, cũng phụ thuộc vào các kỹ thuật chuẩn bị (chế biến,
hình thành, mật độ) và độ xốp [51].
Gronthos và cộng sự (2000, 2002) đã chứng minh hoạt động của DPSCs liên
kết với bột hạt gốm (TCP / HA) do việc cấy ghép vào chuột suy giảm miễn dịch.

11


Kết quả cho thấy phát sinh thế hệ của một lớp giá thể như ngà răng trên bề mặt
khung nâng đỡ của các hạt TCP / HA cho thấy tiềm năng của nó như là vật liệu hoạt
tính sinh học cho việc sửa chữa phức hợp ngà – tủy. [10]
- Nhựa tổng hợp (composites) [10]
Một lựa chọn khác cho việc sử dụng khung nâng đỡ tổng hợp là sử dụng nuôi
cấy ba chiều với một chuỗi khung nâng đỡ ngoại bào nội sinh. Sản xuất và ứng
dụng vật liệu tổng hợp từ các polymer tái hấp thụ tổng hợp và có hoạt tính sinh học
calcium/phosphate như HA, TCP hoặc kích hoạt tính sinh học trở nên ngày càng
quan trọng, lợi dụng tính chất hoạt tính sinh học và tái hấp thụ dẫn tới các quá trình
hình thành mô. Qua đó, thiết kế tập trung vào việc giảm thiểu những bất lợi và sử
dụng các thuộc tính có lợi của các thành phần đơn để phát triển giá thể kỹ nghệ mô
tối ưu hóa với những đặc tính bao gồm cả tỷ lệ thoái hóa trong cơ thể cân bằng để
hình thành mô mới
Gần đây, hệ thống nuôi cấy khung nâng đỡ tự do có tên là "kỹ thuật tế bào viên"
đã được phát triển. Hệ thống này bao gồm việc hình thành dạng viên hay tập hợp tế

bào, cho phép tương tác ba chiều giữa các tế bào lân cận, thiên về tổng hợp giá thể
ngoại bào trong dạng viên [57].
- Giá thể ngà răng
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng giá thể ngà răng là một khung nâng đỡ phù
hợp với kỹ nghệ mô răng do tính tương hợp miễn dịch, tính chất cơ học phù hợp và
sự đa dạng các yếu tố di truyền răng. Các giá thể ngà răng đã được nghiên cứu chứa
khoảng 30% lượng collagen, protein không tạo keo (NCPs), các yếu tố tăng trưởng
[34] [43], nhiều protein và các yếu tố này được chứng minh là quan trọng trong việc
phát triển, khoáng hóa và tái sinh của ngà răng [14] [40].
1.2. Ngà răng [2], [3]
Ngà răng, chiếm phần lớn cấu trúc răng, ít cứng hơn men răng. Ngà răng gồm
70% chất vô cơ, 30% chất hữu cơ (hầu hết là collagen dạng sợi) và nước. Ngà liên
tục từ thân đến chân, tận cùng ở chóp răng, trong lòng chứa buồng tủy và ống tủy.
Trong ngà có nhiều ống ngà, chứa đuôi bào tương của nguyên bào ngà.

12


Ngà răng là một mô sống, cùng với tủy răng tạo thành hệ thống (phức hợp)
ngà - tủy có chức năng quan trọng đối với toàn bộ hoạt động và sự sống của răng.
1.2.1. Cấu trúc ngà răng
- Đuôi bào tương của nguyên bào ngà: Nguyên bào ngà nằm ở bề mặt phía
trong của ngà răng, trong vùng ngoại vi của tủy răng. Từ khi biệt hóa chúng không
phân chia. Sau khi quá trình hình thành răng kết thúc, các tế bào này giúp nâng đỡ
về mặt sinh lý học cho toàn bộ lớp ngà răng bên ngoài và đắp dày thêm lớp ngà nhờ
việc tạo ngà thứ phát. Các đuôi của chúng xuyên suốt toàn bộ bề dày của ngà răng,
từ lớp tiền ngà sát tủy răng cho tới đường nối men - ngà hoặc đường nối ngà - xê
măng. Bào tương của các đuôi nguyên bào ngà chứa ty lạp thể và các vi quản chạy
song song theo trục của nó.
Về mặt phát triển cá thể và chức năng, nguyên bào ngà có mối liên hệ với

nguyên bào xương và nguyên bào sợi, là những tế bào chuyên biệt của mô liên kết.
Nguyên bào ngà cũng như toàn bộ tập đoàn tế bào của nhú răng có nguồn
gốc ngoại trung mô, bắt nguồn từ mào thần kinh. Khi đã được biệt hóa, nguyên bào
ngà bước vào một vòng đời liên quan đến việc tạo thành, duy trì và sửa chữa ngà
răng.
- Ống ngà: Trong quá trình tạo ngà, các đuôi nguyên bào ngà bị kéo dài dần,
chúng nằm trong những ống dài chạy xuyên qua lớp ngà đã khoáng hóa. Đó là ống
ngà, ống ngà được lấp đầy bởi các đuôi bào tương của nguyên bào ngà, dịch mô và
các thành phần cấu trúc hữu cơ như sợi collagen và chất khuôn của ngà quanh ống,
có vai trò nâng đỡ sinh lý cho ngà răng.
Các ống ngà có đường đi hình chữ S ở ngà thân răng, khá thẳng ở ngà chân
răng.






13

Hình 1.4. Nguyên bào ngà và ống ngà [11]










Hình 1.5. Hình dạng ống ngà [3]
1.2.2. Thành phần cấu tạo và các đặc tính của ngà răng
1.2.2.1. Thành phần hữu cơ
Khuôn hữu cơ của ngà răng chứa 91% đến 92% collagen và 8% đến 9% khuôn
hữu cơ không collagen. Phần lớn collagen thuộc loại I, chỉ có dưới 3% thuộc loại V
(Butler, W.T., 1984). Thành phần acid amin của collagen ở răng vĩnh viễn chỉ hơi
khác răng sữa nhưng thành phần khuôn lại hoàn toàn khác.


a. Ở răng cửa
b. Ở răng nanh
c. Ở răng cối
d. Ngà răng
e. Men
ac. Xê măng không tế bào
cc. Xê măng tế bào
M: Buồng tủy
Nguyên bào
ngà

Ống ngà

14


1.2.2.2. Thành phần vô cơ
Tất cả các dạng ngà răng như ngà vỏ, ngà quanh tủy, ngà gian ống và ngà quanh
ống đều có thành phần tinh thể phosphate calcium dạng apatide. Các tinh thể của
ngà răng nhỏ hơn các tinh thể ở men răng, chúng có hình dạng và kích thước tương
tự như tinh thể ở xê-măng và xương.
Thành phần khoáng của ngà răng (các tinh thể hydroxyapatide) chứa calcium,
phosphate. Trong thành phần của ngà răng có một lượng nhỏ carbon, magnesium và
fluor với nồng độ thay đổi. Thành phần khoáng của ngà quanh tủy tương đối đồng
nhất và có tỉ lệ cao hơn so với thành phần hóa học trung bình của ngà răng.
1.2.2.3. Đặc tính của ngà răng
- Độ cứng: Ngà răng không cứng so với men răng nhưng cứng hơn xương và
xê măng. Độ cứng của ngà răng ở thân răng, cổ răng và chân răng tương tự nhau.
Ngà răng cứng nhất được thấy là ở khoảng cách 0,4 đến 0,6 mm cho tới khoảng
giữa lớp ngà. Ở gần tủy, ngà răng mềm hơn khoảng 30% và vùng ngà răng ở ngoại
vi tương đối mềm. Ngà xơ hóa cứng hơn hẳn so với ngà bình thường.
- Các đặc tính khác của ngà răng
Ngà răng tự nhiên có màu vàng nhạt.
Trong ngà có nhiều ống nhỏ chứa các đuôi nguyên sinh chất của các tạo ngà
bào, ống ngà có đường kính khoảng 5-10 m ( 1m = 10
–6
m, 1nm = 10
–9
m)
Trên 1mm
2

cắt ngang qua ngà răng có khoảng từ 20.000 đến 50.000 ống ngà,
như vậy ngà răng là một mô có độ đàn hồi cao, tương đối xốp và có tình thấm. Khả
năng thẩm thấu tăng khi lớp ngà mỏng và đối với các phần tử kích thước nhỏ, khả
năng thẩm thấu giảm khi mức xơ hóa tăng
Các đuôi nguyên bào ngà với mật độ cao và có chiều dài tổng cộng rất lớn
tạo nên một tổng thể tích lớn hơn hẳn so với tổng thể tích thân tế bào và thể tích tủy
răng. Trên một răng đã mọc và đang hoạt động chức năng, nguyên bào ngà là thành
phần chức năng quan trọng nhất của răng.



15


1.2.3. Giá thể ngà răng
Giá thể ngà đã được chứng minh có khả năng kích thích tế bào tủy răng người
biệt hóa thành nguyên bào ngà in vitro và hình thành nên ngà mới in vivo [10]. Để
đảm bảo cho tế bào giảm tính kháng nguyên và tế bào có thể bám, tăng sinh trên bề
mặt ngà thì cần tiến hành xử lý loại bỏ lớp mùn ngà trên bề mặt. Lớp mùn ngà là
lớp giữa cấu trúc ngà - tủy, gồm có các nguyên bào ngà, các sợi collagen và các
protein bề mặt

Hình 1.6. Bề mặt ngà chưa xử lý dưới SEM [52]
1.3. Tế bào gốc trong mô tủy răng
Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng mô tủy của người trưởng thành chứa một quần
thể đa tiềm năng tế bào gốc tủy răng trung mô, tăng sinh cao cho sự tự đổi mới và
khả năng biệt hóa dạng tế bào khoáng hóa thành nguyên bào ngà, đã làm nổi lên
cuộc cách mạng nghiên cứu nha khoa và mở con đường mới đặc biệt cho điều trị và
tái tạo nha khoa nói riêng và kỹ nghệ mô nói chung.
Điều trị nha khoa bằng liệu pháp tế bào gốc cho phép sử dụng nguồn tế bào tự
thân, có nghĩa là tế bào gốc đã biệt hóa có thể được thu nhận và sử dụng điều trị trên
cùng một bệnh nhân, do vậy loại trừ khả năng không tương thích miễn dịch.
Đã có rất nhiều nghiên cứu về việc phân lập tế bào tủy răng của nhiều loài khác
nhau và chứng minh rằng chúng có tỉ lệ tăng sinh cao; đồng thời có khả năng biệt
hóa thành dạng tế bào khoáng hóa trong môi trường thích hợp (Nakashima, 1991;
Lớp mùn
Nguyên
bào ngà

Ống ngà