Đặc điểm các gen mã hóa β lactamase phổ mở rộng ở một số vi khuẩn gram âm và nguy cơ lan truyền qua trung gian plasmid

2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN HOÀNG THU TRANG

ĐẶC ĐIỂM CÁC GEN MÃ HÓA β-LACTAMASE
PHỔ MỞ RỘNG Ở MỘT SỐ VI KHUẨN
GRAM ÂM VÀ NGUY CƠ LAN TRUYỀN QUA
TRUNG GIAN PLASMID


Chuyên ngành: Di Truyền Học
Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ DI TRUYỀN HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. STEPHEN BAKER



Thành phố Hồ Chí Minh - 2011
i

ACKNOWLEDGEMENTS

First and foremost I offer my sincerest gratitude to my
supervisor, Dr. Stephen Baker, who has supported me

thoughout my thesis with his patient guidance, encouragement
and advice. I have been extremely lucky to have a supervisor
who cared so much about my work. Without him, this thesis
would not have been completed.


I would like to thank Doctor James Campbell for his guide on
clinical microbiology and his kindness to allow me working in
good condition at the microbiology laboratory.
ii

LỜI CÁM ƠN
Tôi muốn dành tặng những lời cảm ơn chân thành và thân thương nhất đến hai
người bạn lớn của tôi là chị Thiếu Nga và Thanh Duy. Với tôi, họ thực sự là
những bậc Thầy trong lab. Sự hiểu biết, sự năng động và những tình cảm mà họ
dành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận cũng như sự quan tâm trong thời
gian tôi viết bài là điều đáng giá nhất. Mong những điều t
ốt đẹp nhất sẽ đến với
họ.

Xin gửi đến Thầy Phạm Văn Tới và chị Minh Viện lời cám ơn chân thành vì sự
giúp đỡ nhiệt tình để tôi có cơ hội làm việc tại OUCRU.

Xin gửi lời cám ơn chân thành đến bạn Sĩ Kiệt vì sự giúp đỡ nhiệt tình trong quá
trình làm thí nghiệm. Cám ơn bạn Ngọc Dung, Phương Tú, Khánh Như đã là
những người bạn thật dễ thương cũng như đ
ã dành thời gian đọc bài và đóng góp
nhiều ý kiến hữu ích.

Xin chân thành cám ơn anh Hoàng và các anh chị phòng thí nghiệm vi sinh đã

giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm việc.

Xin chân thành cám ơn các Cô và chị ở phòng pha chế môi trường đã luôn hỗ
trợ tôi kịp thời trong lúc làm thí nghiệm.

Tôi sẽ không bao giờ quên các bạn ở OUCRU đã cho tôi một khoảng thời gian
đầy ý nghĩa. Cám ơ
n nhóm bi lắc với những buổi trưa thật tuyệt vời!
iii


Với sự biết ơn và trân trọng nhất tôi muốn dành cho Tiến sĩ Nguyễn Trọng Hiệp,
người Thầy suốt đời của tôi. Thầy đã định hướng cho tôi những bước đi đầu tiên,
đưa tôi đi khắp nơi và chọn cho tôi một điểm đến lý tưởng. Tôi cám ơn Thầy vì sự
tận tâm hướng dẫn, theo dõi từng thí nghiệm của tôi và góp ý một cách khắc khe để

tôi có thể làm tốt công việc của mình. Được làm việc với Thầy trong suốt thời gian
qua, với tôi, đó là một trải nghiệm khoa học thật bổ ích.

Tôi vô cùng biết ơn các Thầy Cô, các chị và các bạn ở Bộ môn Vi sinh – Ký sinh,
Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. HCM đã hết sức giúp đỡ, động viên, chia sẻ và tạo
điều kiện tốt nhất để tôi có thể làm tốt khóa luận của mình. Xin cám ơn và mãi kh
ắc
ghi những tình cảm ấm áp và sự quan tâm mà mọi người đã dành cho tôi.

Tôi biết ơn các Thầy Cô ở trường Khoa Học Tự Nhiên đã giảng dạy và truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Xin chân thành cám ơn Ban giám đốc và các đồng nghiệp ở Khoa Vi sinh Bệnh
viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất đã giúp đỡ và hỗ trợ tôi rất nhiều trong

quá trình lấ
y mẫu bệnh phẩm.

Tôi không bao giờ quên các bạn bè ở Khoa Dược, các bạn lớp Di Truyền K18 đã
cùng tôi trong suốt thời gian làm việc, học tập. Xin gởi đến các bạn những lời cám
ơn chân thành vì tình bạn, sự động viên và ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua.
iv


Từ tận đáy lòng, tôi muốn gởi lời tri ân đến Ba Mẹ vì sự yêu thương, vì đã dành cho
tôi những tình cảm trọn vẹn. Rất tự hào vì Ba Mẹ đã luôn bên tôi và mang đến cho
tôi những giá trị gia đình thật sự, tổ ấm thân thương nhất trong cuộc đời tôi.


Những lời thương yêu nhất tôi muốn dành cho ông xã Nguyễn Bình, người bạn
suốt đời của tôi, vì những tình cảm ng
ọt ngào, sự động viên và chia sẻ
mà anh đã dành cho tôi.


Tôi không quên những thiên thần đáng yêu, Thu Anh và Anh Thư,
luôn luôn bên cạnh và mang đến cho tôi nhiều may mắn.


Cuối cùng, tôi muốn gởi lời cám ơn đến tất cả những người thân trong gia đình,
những người đã luôn quan tâm và quý mến tôi.
Mong cho điều tốt đẹp nhất sẽ đến với mọi người.
XUW
v

MỤC LỤC
ACKNOWLEDGEMENTS i
LỜI CÁM ƠN ii
MỤC LỤC v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
DANH MỤC CÁC BẢNG x
DANH MỤC CÁC HÌNH xi
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ xii
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1 Tổng quan về họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) 4
1.1.1 Escherichia coli (E. coli) 4
1.1.2 Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) 5
1.2 Tổng quan về họ kháng sinh β -lactam 6
1.2.1 Kháng sinh họ β-lactam và cơ chế hoạt động 6
1.2.2 Cơ chế đề kháng β-lactam ở vi khuẩn 7
1.2.3 Phân loại β-lactam 8
1.3 Enzym β -lactamase 9
1.3.1 Định nghĩa 9
1.3.2 Phân loại 9
1.4 Enzym β -lactamase phổ mở rộng (ESBL) 11
1.4.1 Định nghĩa 11
1.4.2 Phân loại 11
vi

1.4.3
 Phương pháp phát hiện kiểu hình ESBL 18
1.4.4 Phương pháp sinh học phân tử xác định kiểu gen ESBL 19
1.5 Plasmid 20
1.6 Tình hình dịch tễ học của các vi khuẩn sinh ESBL. 20

1.6.1 Tình hình trên thế giới. 20
1.6.2 Tình hình Việt Nam 22
1.7 Dịch tễ học phân tử và sự phát tán các loại ESBL 23
1.7.1 Tình hình trên thế giới 23
1.7.2 Tình hình Việt Nam 24
Chương 2. VẬT LIỆU và PHƯƠNG PHÁP 26
2.1 Chủng vi khuẩn 27
2.2 Định danh họ vi khuẩn Enterobacteriacae 29
2.3 Xác định kiểu hình ESBL bằng thử nghiệm đĩa đôi 29
2.3.1 Nguyên tắc 29
2.3.2 Thực hiện 30
2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) các chủng sinh ESBL 30
2.5 Chiết DNA từ tế bào vi khuẩn 31
2.5.1 Tách chiết DNA bộ gen của vi khuẩn 31
2.5.2 Tách chiết plasmid theo phương pháp của Kadou – Liu [25]. 31
2.6 Phản ứng khuếch đại DNA xác định gen mã hóa ESBL 32
2.7 Tinh sạch DNA 33
2.8 Giải trình tự sản phẩm khuếch đại 34
2.9 Thí nghiệm tiếp hợp 35
vii

2.10
 Lai DNA bằng phương pháp Southern Blot 36
2.10.1Chuyển DNA lên màng 36
2.10.2Đánh dấu mẫu dò 37
2.10.3Lai DNA với mẫu dò 38
2.10.4Phát hiện sự quang hóa của mẫu dò bởi ECL 39
Chương 3. KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 41
3.1 Kiểu hình ESBL của các vi khuẩn thử nghiệm 42
3.1.1 Đặc điểm lâm sàng 42

3.1.2 Đặc điểm kiểu hình ESBL 42
3.2 Đặc điểm đề kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn sinh ESBL 43
3.3 Đặc điểm các gen mã hóa ESBL 45
3.3.1 Phản ứng khuếch đại gen (PCR) 45
3.3.2 Giải trình tự các gen bla
TEM
, bla
CTX-M-1
, bla
CTX-M-9
46
3.3.3 Phân tích plasmid của các chủng sinh ESBL 49
3.3.4 Lai Southern Blot xác định vị trí các gen bla trên plasmid 51
3.3.5 Khả năng tiếp hợp của các plasmid mang gen mã hóa ESBL 53
3.4 Bàn luận 55
Chương 4. KẾT LUẬN và ĐỀ NGHỊ 58
4.1 Kết luận 59
4.2 Đề nghị 59
TÀI LIỆU THAM KHẢO I
PHỤ LỤC V

viii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µg/ml Microgam/mililít
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
(công cụ tìm trình tự
t
ương đồng)

bp Base pair
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
(các tiêu chuẩn lâm sàng và tiêu chuẩn phòng thí nghiệm)
CTX-M
Loại ESBL có hoạt tính mạnh trên cef
otaxime, được phân lập
đầu tiên ở M
unich
dH
2
O Distilled water (nước cất)
DNA Deoxyribonucleic Acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate
ECL Enhanced Chemiluminescence (hóa phát quang tăng cường)
EDTA Ethilendiaminetetraacetic acid
ESBL Extended-spectrum beta-lactamase (β-lactamase phổ mở rộng)
E-test Epsilometer test
LB Môi trường Luria – Bertami
LPS Lipopolysaccharide
MIC Minimum Inhibitory Concentration (nồng độ ức chế tối thiểu)
NCBI
National Center for Biotechnology Information
(trung tâm quốc gia về thông tin công nghệ sinh học)
OUCRU
Oxford University Clinical Research Unit
(Đơn vị Nghiên cứu Lâm sàng Đại học Oxford tại Việt Nam)
PBP
Penicillin Binding Protein (protein gắn kết penicillin)
PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi)

PCR-RFLP PCR - Restriction Fragment Length Polymorphis
(PCR - đa hình độ dài các đoạn cắt bằng enzym hạn chế
)
SHV S
ulfhydryl reagent variable (một loại enzym β-lactamase)
SMART

Study for Monitoring Antimicrobial Resistance Trends
(nghiên cứu về kiểm định khuynh hướng đề kháng kháng sinh)
Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase
ix

TEM
Tem
oneira (một loại enzym β-lactamase được đặt theo tên của
b
ệnh nhân đầu tiên mang vi khuẩn tiết enzym này)
TP. HCM Thành phố Hồ Chí Minh
UV Ultra violet (tia tử ngoại)

x

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số kháng sinh họ β-lactam 8

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi dùng để phát hiện gen mã hóa ESBL 32
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 33
Bảng 2.3 Chương trình phản ứng PCR 33
Bảng 2.4 Thành phần phản ứng giải trình tự 34

Bảng 2.5 Chương trình phản ứng PCR giải trình tự 34
Bảng 3.1: Kiểu hình đề kháng kháng sinh ở các chủng vi khuẩn sinh ESBL 44
Bảng 3.2 Đặc điểm gen bla và plasmid mang gen trên các chủng thử nghiệm 54
Bảng 4.1: Các biến thể của gen bla được sử dụng so sánh trong nghiên cứu V
Bảng 4.2 : Bảng biện giải giá trị MIC cho các vi khuẩn Enterbacteriaceae V
Bảng 4.3 : Kết quả thử nghiệm đĩa đôi và nồng độ ức chế tối thiểu của các chủng vi
khuẩn thử nghiệm VI

Bảng 4.4: Kích thước plasmid ở các chủng sinh ESBL VIII
xi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 : Sự khuếch tán của kháng sinh qua thành tế bào và sự đề kháng kháng
sinh ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm 7

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các nhóm kháng sinh họ β-lactam 8
Hình 1.3 Vị trí và kiểu thay thế amino acid ở β-lactamase loại TEM. 15
Hình 1.4 : Vị trí và kiểu thay thế amino acid ở β-lactamase loại SHV 16
Hình 1.5 : Sự phân nhóm của CTX-M và vị trí các amino acid 17
Hình 1.6 : Tỉ lệ các vi khuẩn sinh ESBL ở khu vực châu Á – Thái Bình Dương. 22
Hình 1.7: Sự phân bố kiểu gen CTX-M trên thế giới, số liệu năm 2009 24
Hình 2.1 Phương pháp thử nghiệm đĩa đôi. 30
Hình 2.2 Phương pháp xác định MIC. 31
Hình 2.3 Chuyển DNA lên màng bằng máy hút chân không 37
Hình 2.4 Nguyên lý đánh dấu mẫu dò của bộ kít ECL 38
Hình 2.5 Nguyên tắc hiện phim 40
Hình 3.1: Các dạng kiểu hình ESBL 42
Hình 3.2 Kết quả điện di với các cặp mồi CTX-M-1, CTX-M-9, TEM. 46
Hình 3.3 Kết quả phân tích trình tự gen bla

TEM
47
Hình 3.4: Kết quả phân tích trình tự gen bla
CTX-M-1
48
Hình 3.5 Kết quả phân tích trình tự gen bla
CTX-M-9
49
Hình 3.6 Độ tương đồng các plasmid của 32 chủng vi khuẩn. 51
Hình 3.7 : Kết quả lai DNA plasmid của các chủng vi khuẩn 52
Hình 3.8 : Plasmid của các chủng vi khuẩn trước và sau tiếp hợp 53
Hình 4.1 Kích thước thang 1kb ladder (Invitrogen). XIII
xii

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Sơ đồ
Sơ đồ 2.1 Quy trình thực nghiệm 28


Biểu đồ

Biểu đồ 3.1: Tính nhạy cảm kháng sinh của các chủng sinh ESBL 44


Phụ lục

Phụ lục 1 : Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu IX

Phụ lục 2 : Các hóa chất sự dụng trong nghiên cứu X
Phụ lục 3 : Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu XIV

-1-
MỞ ĐẦU
Việt Nam là một trong những nước có tỉ lệ nhiễm trùng cao so với thế giới,
trong đó những vi khuẩn đường ruột Enterobacteriacea như Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, là những tác nhân phổ biến gây ra các bệnh nhiễm trùng
nguy hiểm ở người. Việc sử dụng kháng sinh không được kiểm soát tốt hiện nay đã
làm cho tình hình vi khuẩn đề kháng kháng sinh ngày một gia tăng [1],[3], [34].
Theo đó, một số chủng vi khuẩn Gram âm ở Việt Nam đã đề kháng ngày mộ
t mạnh
hơn với cephalosporin thế hệ thứ 3 và cả với fluoroquinolon, là những kháng sinh
thông dụng trong điều trị những bệnh do các vi khuẩn này gây ra. Điều này gây khó
khăn cho vấn đề trị liệu, tăng chi phí đồng thời tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân
[2],[4],[6], [34],[21],[25].
Việc sử dụng rộng rãi kháng sinh nhóm cepholosporin phổ rộng trên lâm
sàng dẫn đến sự đề kháng của vi khuẩn qua cơ chế tiết enzym beta – lactamase phổ

rộng (E
xtended Spectrum Beta-Lactamase – ESBL) ngày càng gia tăng [39]. ESBL
là enzym có khả năng ly giải các kháng sinh thuộc họ beta-lactam, chủ yếu là các
cephalosporin phổ rộng, penicillin và aztreonam [29], [12], [24]. Các vi khuẩn tiết
ESBL cũng thường đa đề kháng với các nhóm kháng sinh khác như aminoglycosid,
fluoroquinolon, tetracyclin, chloramphenicol, và sulfamethoxazole – trimethoprim
[34],[36],[37]. Vi khuẩn tiết ESBL thực sự là gánh nặng trong điều trị nhiễm khuẩn
khi mà tần suất và tỷ lệ tử vong trên các bệnh cảnh nhiễm khuẩn nặng do vi khuẩn
này ngày càng gia tăng [8],[15],[16],[40].
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đ
ã mô tả các gen chịu trách nhiệm cho sự tiết
ESBL, đồng thời cũng chứng minh được plasmid đóng vai trò quan trọng trong việc
lan truyền những gen này. Phần lớn các gen mã hóa ESBL nằm trên các plasmid có
kích thước khác nhau và có khả năng tiếp hợp cao. Các plasmid kích thước lớn (hơn

50 kb) mang gen mã hóa ESBL cũng thường mang các gen đề kháng với các kháng
sinh khác [9],[32].
-2-
Tại Việt Nam có rất ít các nghiên cứu về cơ chế đề kháng cephalosporin
cũng như cơ chế lan truyền các gen đề kháng này ở các vi khuẩn Gram âm. Trước
tình hình đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này với mục tiêu:
- Khảo sát đặc điểm các gen mã hóa enzym ESBL ở các chủng vi khuẩn Gram
âm phân lập từ bệnh phẩm tại bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Thống Nhất
thành phố Hồ Chí Minh.
- Đánh giá nguy c
ơ lan truyền các gen mã hóa ESBL này qua trung gian plasmid.


-3-
Chương 1. TỔNG QUAN

-4-
1.1 Tổng quan về họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae)
Họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae là một họ rất lớn, phân bố rộng
trên người, động vật, thực vật và ngoài môi trường. Nơi thường gặp nhất là ruột
người và các loài động vật, đây cũng là nguồn gốc của từ “đường ruột” trong thuật
ngữ tên họ của chúng (Entero – ruột,
bacteri – vi khuẩn, aceae – họ) [3].
Một vi khuẩn được xếp vào họ vi khuẩn đường ruột khi có các tính chất sau:
trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, không có enzym oxidase, lên men
đường glucose (sinh gas hoặc không), khử nitrat thành nitrit, có khả năng di động
nhờ chu mao hoặc không, không sinh bào tử [3].
Họ vi khuẩn đường ruột có tầm quan trọng bậc nhất trong y học bởi có nhiều
loài có khả năng gây bệnh ở người, trong đó có những loài có thể gây thành dịch
[38]. Chúng chi

ếm tới hơn 80% các vi khuẩn Gram âm gây bệnh ở người [34]. Họ
vi khuẩn này đứng đầu trong các nguyên nhân gây nhiễm khuẩn đường tiêu hóa,
nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm khuẩn huyết. Ngoài ra, chúng có thể gây
viêm đường mật, viêm phổi ở trẻ sơ sinh, viêm màng não, nhiễm khuẩn trong ngoại
khoa, nhiễm khuẩn trong bỏng,… Tuy nhiên, 95% các chủng phân lập được từ các
bệnh phẩm lâm sàng tập trung vào 10 chi với khoảng 20 loài. Trong đó, hai vi
khuẩn E. coli và K. pneumoniae
thường chiếm đa số [14]. Các yếu tố độc lực chính
của họ vi khuẩn này là khả năng bám vào tế bào vật chủ, khả năng xâm nhập, khả
năng sản sinh các độc tố (nội và ngoại độc tố) và các gen độc lực. Tùy thuộc vào vị
trí gây bệnh mà cơ chế gây bệnh của họ vi khuẩn này có những điểm rất khác nhau
[3],[16],[40].
1.1.1 Escherichia coli (E. coli)
Escherichia coli do Theodore Echerich (1857-1911), mộ
t nhà vi khuẩn học
người Áo, phát hiện lần đầu tiên vào năm 1885. E. coli là vi khuẩn điển hình của
chi Escherichia. E. coli là thành viên thuộc hệ vi khuẩn bình thường của đường tiêu
hóa, chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%). Chúng có
-5-
thể sản xuất ngoại độc tố đường ruột (enterotoxin), hemolysin, enzym phân hủy một
số kháng sinh (β-lactamase), bacteriocin [3].
E. coli là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, đứng đầu trong các tác nhân gây
tiêu chảy (ETEC – Enterotoxigenic E. coli), viêm đường tiết niệu (UPEC –
Uropathogenic E. coli), viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây
nhiễm khuẩn huyết. E. coli là căn nguyên thường gặp trong viêm màng não (MAEC
– Meningitidis-associated E. coli), viêm phổi ở trẻ sơ sinh [4],[3].
E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấ
y thông thường. Một số
có thể phát triển trên các môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Có khả
năng phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 40

0
C. Nhiệt độ tối ưu 37
0
C. Trong điều kiện thích
hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút [3].
1.1.2 Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae)
Klebsiella là một trong những chi quan trọng của họ vi khuẩn đường ruột,
được đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đức, Edwin Klebs (1834-1913). Trong
đó, K. pneumoniae là loài quan trọng nhất và cũng là đại diện điển hình của chi này
[3].
K. pneumoniae chủ yếu gây bệnh cơ hội, ở cộng
đồng hoặc trong bệnh viện –
là một trong những nguyên nhân gây nhiễm trùng bệnh viện thường gặp. K.
pneumoniae subsp. pneumoniae gây viêm phổi (như tên gọi) đã được biết đến từ
lâu; bệnh thường gặp ở trẻ sơ sinh, tỉ lệ tử vong rất cao nếu không được điều trị
sớm. Ngoài ra, nó còn có khả năng gây nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm
tai giữa, nhiễm khuẩn đường tiết niệu, … [3]
Yếu tố độc lực chính của K. pneunoniae là nội độc tố LPS
(lipopolysaccharide). Ngoài ra, chúng còn sinh ra hai loại độc tố ruột (chịu nhiệt và
không chịu nhiệt) và bacteriocin (microcin E492) có tác dụng ức chế một số vi
khuẩn khác và cảm ứng quá trình chết theo chương trình (apoptosis) của các tế bào
chủ [3].
-6-
Nguồn lây Klebsiella chủ yếu từ đường ruột; ngoài ra có thể từ họng và da.
Klebsiella là loại hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý, phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi
cấy thông thường. Vi khuẩn này có thể xâm nhập vào cơ thể bằng nhiều đường khác
nhau như qua các dụng cụ y tế, qua bàn tay nhiễm khuẩn, qua thức ăn, …[3].
1.2 Tổng quan về họ kháng sinh β -lactam
1.2.1 Kháng sinh họ β-lactam và cơ chế hoạt độ
ng

Beta- lactam là một họ kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay,
chiếm hơn một nữa các kháng sinh được sử dụng trong điều trị [19],[24]. Về mặt
cấu trúc, các kháng sinh trong họ này đều có vòng β-lactam. Về mặt cơ chế, chúng
tác động vào quá trình tổng hợp vách tế bào của vi khuẩn dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn.
Quá trình này bắt đầu khi các kháng sinh có tính thân nước (như β-lactam) đi qua
lớp màng ngoài nhờ sự
vận chuyển của các kênh porin, β-lactam gắn vào các
protein PBP (penicillin binding protein) – transpeptidase và carboxypeptidase –
enzym chịu trách nhiệm chuyển nhóm peptide trong quá trình tổng hợp
peptidoglycan. Khi đó, quá trình tổng hợp peptidoglycan bị xáo trộn, sự phân chia
tế bào ngừng lại làm tế bào bị ly giải hoặc biến dạng, vi khuẩn chết do khác biệt áp
suất thẩm thấu. Tương tác giữa PBP với β-lactam nhờ vào ái lực của cấu trúc vòng
β-lactam với vị trí hoạt động của PBP. Chính vì vậy mà sự
hiện diện của vòng β-
lactam là cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn của các kháng sinh thuộc họ này [1],
[24].
-7-

Hình 1.1 : Sự khuếch tán của kháng sinh qua thành tế bào và sự đề kháng kháng
sinh ở vi khuẩn Gram dương và Gram âm [11]

1.2.2 Cơ chế đề kháng β-lactam ở vi khuẩn
Để chống lại sự tương tác giữa β-lactam và PBP, phức hợp acyl-enzym được
hình thành và phá vỡ liên kết C-N trong cấu trúc vòng lactam. Các đột biến điểm
xuất hiện trong quá trình tiến hóa của một số PBP, làm phát sinh một loại enzym β-
lactamase – enzym có khả năng thủy phân vòng lactam của kháng sinh. So sánh
trình t
ự của tất cả PBP và β-lactamase chứng minh một giả thuyết liên quan đến sự
tồn tại một nguồn gốc chung của các protein này.
Sự đề kháng với kháng sinh β-

lactam của vi khuẩn liên quan đến một trong các cơ chế sau: (i) sự tổng hợp β-
lactamase phá hủy các kháng sinh này; (ii) sự giảm bớt, biến mất hay thay đổi đặc
tính chức năng của một vài porin sẽ dẫn đến tính thấm của kháng sinh vào vi khuẩn;
(iii) thay đổi cấu trúc của PBP; (iv) hoạt động của các kênh bơm kháng sinh ra khỏi
tế bào vi khuẩn (efflux system). Sự tổng hợp β-lactamase được xem như
cơ chế đề
kháng chủ yếu của các chủng lâm sàng quan trọng ở vi khuẩn Gram-âm với các
kháng sinh họ β-lactam [1],[24].
-8-
1.2.3 Phân loại β-lactam
Beta-lactam được chia thành 4 nhóm chính dựa theo cấu trúc hóa học:
penicillin, monobactam, cephalosporin, carbapenem (Bảng 1.1). Tất cả chúng đều
có vòng β-lactam và bị thủy phân bởi enzym β-lactamase. Các nhóm khác nhau bởi
các vòng được gắn thêm vào như là vòng thiazolidine đối với penicillins, không có
vòng đối với monobactams, nhân cephem đối với nhóm cephalosporins hay là cấu
trúc vòng đôi với nhóm carbapenems (Hình 1.2) [19].

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của các nhóm kháng sinh họ β-lactam [28]

Bảng 1.1 Một số kháng sinh họ β-lactam [19]
Nhóm Các kháng sinh
Penicillin Penicillin G, penicillin
Penicillin kháng lại penicillinase : methicillin, nafcillin,
oxacillin, cloxacillin
Aminopenicillin : ampicillin, amoxicillin
Carboxypenicillin: carbenicillin, ticarcillin
Ureidopenicillin: mezlocillin, piperacillin
Cephalosporin Thế hệ I: cefazolin, cephalothin, cephalexin
Thế hệ II: cefuroxime, cefaclor, cefamandole, cefamycins
(cefotetan, cefoxitin)

Thế hệ III: cefotaxime, ceftriaxone, cefpodoxime, ceftizoxime,
cefoperazone, ceftazidime
Thế hệ IV: cefepime, cefpirome
Carbapenem Imipenem, meropenem, ertapenem
Monobactam Aztreonam
-9-
1.3 Enzym β -lactamase
1.3.1 Định nghĩa
Beta-lactamase là một enzym có khả năng thủy phân vòng β-lactam giúp cho
vi khuẩn đề kháng lại với kháng sinh này. Các β-lactamase được mã hóa bởi các
gen trên nhiễm sắc thể hoặc trên các plasmid. Trong đó, plasmid được xem là
nguyên nhân chính làm phát tán tính đề kháng ở vi khuẩn [9].
1.3.2 Phân loại
Ở vi khuẩn Gram dương, β-lactamase được tiết ra bên ngoài môi trường như
một enzym ngoại bào. Nhưng ở vi khuẩn Gram âm, chúng được giữ lại khoảng chu
chấ
t (periplasmic space), ở đó chúng có thể tấn công kháng sinh trước khi các
kháng sinh này đến được các vị trí tác động (receptor) của nó [19],[29].
Cho đến nay đã có hơn 500 loại β-lactamase được biết đến, và con số này
không ngừng gia tăng hàng năm [24]. Về cơ bản, các enzym khác nhau ở khả năng
thủy phân vòng β-lactam của kháng sinh. Sự phân loại β-lactamase tùy thuộc đặc
tính hóa lý, khả năng ức chế, vị trí gen (gen trên plasmid hay trên nhiễm sắc thể), ký
chủ thường gặp, trình t
ự nucleotide hoặc thành phần amino acid, vị trí enzym ở vi
khuẩn (phía ngoài tế bào hay khoảng không chu chất) và những cơ chất tương ứng.
Có hai hệ thống phân loại của β-lactamase: hệ thống phân loại Ambler dựa vào cấu
trúc phân tử của enzym, hệ thống phân loại của
Bush-Jacoby-Medeiros dựa vào
chức năng và đặc tính sinh hóa của enzym [19], [24], [29].
• Hệ thống phân loại Ambler chia β-lactamase thành 4 lớp chính (A-D).

− Beta-lactamase lớp A, C và D có cơ chế hoạt động phụ thuộc serin. Những
enzym này có hoạt tính chống lại các kháng sinh thuộc nhóm penicillins,
monobactams, cephalosporins.
− Beta-lactamase lớp B là các metalo β-lactamase có cơ chế hoạt động phụ
thuộc kim loại. Những enzym này sử dụng một ion kim loại hóa trị hai,
thường là kẽm, liên kết với một gốc histidine ho
ặc cysteine hoặc cả hai, để
-10-
phản ứng với nhóm carbonyl của liên kết amide của hầu hết các penicillins,
cephalosporins và carbapenems, nhưng không có tác động trên
monobactams.
• Hệ thống phân loại mới nhất của Bush-Jacoby-Medeiros (1995) chia β-
lactamase thành 4 nhóm chính (1-4) và các phụ nhóm (a-f).
− Nhóm 1 là các cephalosporinase không bị ức chế bởi acid clavulanic (lớp C).
Các gen mã hóa enzym này thường nằm trên NST hơn là trên plasmid. Các
enzym thường gặp là AmpC, CYM, FOX, MOX, …
− Nhóm 2 là các penicillinase hoặc cephalosporinase bị ức chế bởi acid
clavulanic, tương ứng với lớp A và D gồm các enzym đầu tiên là TEM và
SHV. Với sự gia t
ăng các biến thể của TEM, SHV và sự xuất hiện các
enzym mới, nhóm 2 được phân thành hai phụ nhóm 2a và 2b.
Phụ nhóm 2a chỉ chứa penicillinase trong khi phụ nhóm 2b là các β-
lactamase phổ rộng do chúng có khả năng bất hoạt cả penicillin và
cephalosoprin.
Phụ nhóm 2b lại bao gồm 2be và 2br. Trong đó, 2be là các β-lactamase phổ
mở rộng hay ESBL (ký tự “e” trong 2be nghĩa là mở rộng – extended) gồm
các biến thể của TEM và SHV, các β-lactamase mới xuất hiện như CTX-M,
VEB, PER, GES, IBC,…. Loại 2br là các biến thể khác củ
a TEM hoặc
SHV có khả năng đề kháng lại với chất ức chế β-lactamase như clavulanic

acid và sulbactam, nhưng vẫn nhạy cảm với tazobactam.
Phụ nhóm 2d là các oxacillinase (OXA) có khả năng bất hoạt cloxacillin
mạnh hơn benzylpenicillin, một số khác thủy phân được carbenicillin; các
enzym này thường ít bị ức chế bởi clavulanic acid, và một vài enzym trong
phụ nhóm này là các ESBL.
Phụ nhóm 2c là các enzym có khả năng bất hoạt carbenicillin hơn là
benzylpenicillin. Phụ nhóm 2e là các cephalosporinase có khả năng thủy
-11-
phân monobactam, bị ức chế bởi clavuclanic acid. Phụ nhóm 2f được thêm
vào vì chúng là các carbapenemase hoạt động phụ thuộc serin; nhưng các
carbapenemase khác hoạt động phụ thuộc kim loại thì thuộc nhóm 3.
− Nhóm 3 là các metalo-β-lactamase lớp B, hoạt động phụ thuộc kim loại hóa
trị hai, các enzym này không bị ức chế bởi clavulanic acid nhưng bị ức chế
bởi EDTA. Chúng có khả năng thủy phân penicillin, cephalosporin và
carbapenem. Một số enzym thuộc nhóm này là IMP, VIM, NDM-1, …
− Nhóm 4 là các penicillinase không bị ức chế bởi acid clavulanic, các enzym
nhóm này không thuộc lớp nào trong hệ thống phân loại Ambler.
1.4 Enzym β -lactamase phổ mở rộng (ESBL)
1.4.1 Định nghĩa
ESBL là các β-lactamase có khả năng thủy phân các penicillin,
cephalosporin từ thế hệ I đến thế hệ III và monobactam ngoại trừ carbapenem, làm
cho vi khuẩn đề kháng lại với các kháng sinh này. ESBL bị ức chế bởi các chất ức
chế β-lactamase như clavulanic acid và sulbactam [29].
1.4.2 Phân loại
Các ESBL được xếp vào nhóm A và D theo Ambler hay nhóm 2be và 2d
trong hệ thống phân loại Bush-Jacoby-Medeiros. Thuậ
t ngữ ESBL ban đầu đề cập
đến các enzym thuộc nhóm 2be, có nguồn gốc từ TEM và SHV có khả năng thủy
giải các oxyimino-cephalosporin. Về sau, thuật ngữ này được mở rộng với enzym
thuộc các nhóm sau: CTX-M và VEB có cùng hoạt phổ nhưng không bắt nguồn từ

TEM và SHV; các thể đột biến của TEM và SHV có khả năng thủy giải oxyimino-
cephalosporin (như ceftazidim); và các thể đột biến của OXA và AmpC tăng tính
kháng với cefepime (cephalosporin thế hệ IV)[22].
Các loại ESBL khác nhau do đột biến di truy
ền. Những thay đổi nhỏ về
nucleotid dẫn đến sự thay thế acid amin này bằng acid amin kia trên vùng hoạt động
của enzym ESBL, dẫn đến khả năng thủy phân khác nhau giữa các loại ESBL. Các
-12-
gen mã hóa enzym nhóm này thường nằm trên plasmid, điều này làm cho các gen
có điều kiện lan truyền từ loài này qua loài khác hoặc giữa các cá thể khác nhau
trong cùng loài. Đề kháng thu được phát sinh trong quá trình phát triển của vi
khuẩn, do một biến cố di truyền nào đó. Hầu hết các đề kháng thu được thường đi
kèm với các yếu tố di truyền di động như plasmid, transposon, yếu tố IS (insertion
element), integron lớp 1 và integron chứa yếu tố ISCR1. Cơ chế đa dạng của sự
truyề
n thông tin này góp phần phát tán các gen đề kháng một cách nhanh chóng
[24], [36].
Ba loại chính của ESBL là TEM, SHV và CTX-M được xem là phổ biến và
có tầm ảnh hưởng rộng lớn nhất. Các loại ESBL này vẫn không ngừng biến đổi;
ngày càng tăng về số lượng và phức tạp hơn về đặc tính [27].
• ESBL loại TEM
TEM-1 được báo cáo đầu tiên vào năm 1965 trên vi khuẩn E. coli từ một
bệnh nhân tên Tem
oneira ở Hy Lạp. Các plasmid chứa TEM-1 được tìm thấy ở các
vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, P. aeruginosa, Haemophilus influenza,
Neisseria gonorrhoeae, … TEM-1 có đặc tính thủy phân hiệu quả penicillin và
cephalosporin thế hệ I. TEM-2 và TEM-13 là các biến thể của TEM-1 có cùng đặc
tính đề kháng. Do đó, TEM-1, TEM-2 và TEM-13 là các β-lactamase phổ rộng
(Broad-spectrum β-lactamases) không phải là ESBL [24],[29].
Các ESBL loại TEM đều bắt nguồn từ TEM-1 và TEM-2. TEM-3, tên trước

đây là CTX-1 vì có hoạt tính thủy phân cefotaxim, được xác định là β-lactamase
qua trung gian plasmid phân lập từ K. pneumoniae tại Pháp (1984). TEM-3 khác vớ
i
TEM-2 bởi sự thay thế 2 amino acid. Tuy nhiên, TEM-12 phân lập từ vi khuẩn K.
oxytoca tại Anh năm 1982 do gen mã hóa nằm trên plasmid mới là ESBL loại TEM
đầu tiên [29].
Ngày nay, hơn 170 thành viên của loại enzym này được mô tả và các dữ liệu
về β-lactamase vẫn được cập nhập thường xuyên. Cấu trúc nguyên thủy của TEM-1
gồm 288 gốc amino acid. Các dạng phát sinh của TEM đều là các biến thể của